二裂酵母发酵溶胞产物及在美白和抗衰老化妆品中的应用的制作方法

1.本技术涉及二裂酵母技术领域，尤其涉及二裂酵母发酵溶胞产物及在美白和抗衰老化妆品中的应用。


背景技术：

2.二裂酵母发酵产物滤液和二裂酵母发酵溶胞产物是目前化妆品中常用的功效成分，已经录入《已使用化妆品原料名称目录》2021版，其发酵菌株为双歧杆菌，尤其多以长双歧杆菌居多。双歧杆菌属(bifidobacterium)是一种革兰氏阳性、不运动、细胞呈杆状、一端有时呈分叉状的严格厌氧细菌。二裂酵母的发酵产物中含有多种代谢产物，包括多糖、有机酸、氨基酸、多肤、蛋白质、核普酸和维生素等fro of，这些成份可以为人体肌肤提供多种营养，对皮肤都具有良好的生物作用。


技术实现要素：

3.基于此，本技术发明人创造性地在二裂酵母的溶胞产物中发现了5种多糖，s1、s2、s3、s4和s5，并且对该五种二裂酵母发酵多糖进行了初步的结构分析，发现其s1、s4和s5中为含有酰胺基的多糖，而s2、s3中含有糖醛酸。
4.本技术进一步对得到的二裂酵母发酵溶胞产物进行体外试验，发现了实施例1和2提供的二裂酵母发酵溶胞产物具有更低的dpph自由基清除率ic50、羟自由基清除率ic50、体外酪氨酸酶抑制率ic50和体外透明质酸酶抑制率ic50，提示本技术实施例提供的二裂酵母发酵溶胞产物不仅能够抑制酪氨酸酶活，抑制黑色素合成，还能促进成纤维细胞生长，促进细胞增殖，具有美白和抗衰老功效。
5.本技术进一步通过动物试验证实了s1、s4和s5作为基础的二裂酵母发酵多糖不仅对皮肤无明显的刺激和副反应作用，还能够有效减低黑色素合成，再次证实其具有明显的美白和抗衰老功效。
6.第一方面，本技术实施例公开了一种二裂酵母发酵溶胞产物，所述溶胞产物含有选自s1、s4和s5中的至少一种，s1的分子量为62.5kd，s4的分子量为72.4kd，s5的分子量为76.9kd；s1分子中按照摩尔百分比计包含32.5％葡萄糖、34.7％半乳糖、10.8％岩藻糖、9.2％甘露糖、6.4％果糖、3.5％半乳糖胺和2.9％葡萄糖胺；s4分子中按照摩尔分比计包含25.4％葡萄糖、40.8％半乳糖、7.8％鼠李糖、11.4％岩藻糖、9.6％甘露糖、2.7％半乳糖胺和2.3％葡萄糖胺；s5分子中按照摩尔百分比计包含27.4％葡萄糖、38.3％半乳糖、7.9％甘露糖、8.2％果糖、3.1％半乳糖胺和2.8％葡萄糖胺。
7.在本技术实施例中，s1具有的糖苷键以摩尔百分比计包括7.25％
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
、4.36％
→
1)-d-glcp-(4
→
、3.14％
→
1)-d-glcp-(6
→
、2.88％
→
4)-d-glcap-(1
→
、4.39％
→
4)-d-glcap-(3
→
、6.14％
→
3)-β-galnac-(1
→
、7.25％
→
4)-ɑ-glca-(1
→
、18.6％
→
1)-d-galp-(3
→
、2.8％
→
1)-d-galp-(6
→
、12.3％
→
1)-d-galp-(6
→
、
8.4.5％
→
4)-β-gala-(1
→
、6.48％
→
1)-d-fucp-(3
→
、4.31％
→
2)-d-fucp-(4
→
、
5.55％
→
1)-d-manp-(2,4
→
、3.65％
→
1)-d-manp-(3,6
→
、3.92％
→
1)-l-frup-(3
→
、2.48％
→
2)-l-frup-(4
→
；
9.s4具有的糖苷键以摩尔百分比计包括8.15％
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
、5.68％
→
1)-d-glcp-(4
→
、4.17％
→
1)-d-glcp-(6
→
、4.11％
→
4)-d-glcap-(1
→
、2.19％
→
4)-d-glcap-(3
→
、2.03％
→
3)-β-galnac-(1
→
、1.36％
→
4)-ɑ-glca-(1
→
、22.34％
→
1)-d-galp-(3
→
、8.42％
→
1)-d-galp-(6
→
、7.94％
→
1)-d-galp-(6
→
、4.79％
→
4)-β-gala-(1
→
、3.15％
→
2)-l-rhap-(1
→
、4.58％
→
2,4)-l-rhap-(1
→
、7.92％
→
1)-d-fucp-(3
→
、3.47％
→
2)-d-fucp-(4
→
、6.08％
→
1)-d-manp-(2,4
→
和3.52％
→
1)-d-manp-(3,6
→
；
10.s5具有的糖苷键以摩尔百分比计包括8.31％
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
、3.68％
→
1)-d-glcp-(4
→
、5.18％
→
1)-d-glcp-(6
→
、2.61％
→
4)-d-glcap-(1
→
、4.58％
→
4)-d-glcap-(3
→
、3.97％
→
3)-β-galnac-(1
→
、1.86％
→
4)-ɑ-glca-(1
→
、23.28％
→
1)-d-galp-(3
→
、9.21％
→
1)-d-galp-(6
→
、6.35％
→
1)-d-galp-(6
→
、2.55％
→
4)-β-gala-(1
→
、5.24％
→
1)-d-xylp
→
(2,3
→
、7.06％
→
1)-d-xylp-(3
→
、4.39％
→
1)-d-manp-(2,4
→
、3.51％
→
1)-d-manp-(3,6
→
、4.36％
→
1)-l-frup-(3
→
和3.84％
→
2)-l-frup-(4
→
。
11.在本技术实施例中，s1还具有端基葡萄糖残基和端基半乳糖残基，s4还具有端基葡萄糖残基和端基半乳糖残基，s5还具有端基葡萄糖残基和端基半乳糖残基。
12.第二方面，本技术实施例公开了一种二裂酵母发酵溶胞产物，其按照重量分数计包含14.8～16.4％s1，12.3～12.6％s4和11.1～12.5％s5。
13.第三方面，本技术实施例公开了一种二裂酵母发酵溶胞产物的制备方法，其包括如下步骤：
14.获得二裂酵母的活化菌液；
15.将所述活化菌液进行至扩大和发酵培养，得到发酵液；
16.对发酵液进行过滤，得到滤液和菌体；
17.对所述菌体进行破壁处理，得到破壁液体与菌体混合，干燥处理后，即为所述二裂酵母发酵溶胞产物。
18.在本技术实施例中，所述扩大和发酵用到了扩大培养基和发酵培养基，所述扩大培养基和/或所述发酵培养基包含10g/l酪蛋白胨、5g/l酵母膏、5g/l牛肉膏、5g/l大豆蛋白胨、10g/l葡萄糖、0.15g/l nh4c1、0.5g/l一水硫酸锰、0.01％v/v tween 80、50mg/l半胱氨酸盐、25mg/l半胱氨酸、二水氯化钙0.05mg/l、七水硫酸镁0.15mg/l、磷酸二氢钾0.25m g/l、磷酸氢二钾0.25g/l、碳酸氢钠2.5mg/l、氯化钠2.5mg/l。
19.在本技术实施例中，所述扩大和发酵用到了扩大培养基和发酵培养基，所述扩大培养基和/或所述发酵培养基包含38g/l蛋白胨、96g/l葡萄糖、19g/l酵母提取物、0.06g/l的木糖、0.15mg/l氯化钠、96mg/l半胱氨酸盐酸盐、56mg/l半胱氨酸、0.15mg/l氯化钙、0.15mg/l硫酸镁、0.15mg/l磷酸氢二钾和0.77g/l碳酸氢钠。
20.在本技术实施例中，所述活化菌液中的粗多糖含量不低于0.5g/l。
21.第四方面，本技术实施例公开了一种美白抗衰精华液，该美白抗衰精华液包含s1、s4或s5中的至少一项，丁二醇，丙二醇、edta二钠和水，其中，s1、s4或s5含量不低于5.6wt％，，丁二醇含量为0.25～3.5wt％，丙二醇含量为0.5～1.75wt％，edta二钠含量为0.05～0.25wt％，溶于去离子水制得。
22.第五方面，本技术实施例公开了第一方面所述的二裂酵母发酵多糖在制备美白和/或抗衰老化妆品中的应用。
附图说明
23.图1为本技术实施例提供的5种二裂酵母发酵多糖的甲基化产物红外图谱。
24.图2为本技术实施例提供的s1的gc-ms色谱图。
25.图3为本技术实施例提供的s2的gc-ms色谱图。
26.图4为本技术实施例提供的s3的gc-ms色谱图。
27.图5为本技术实施例提供的s4的gc-ms色谱图。
28.图6为本技术实施例提供的s5的gc-ms色谱图。
具体实施方式
29.为了使本技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本技术，并不用于限定本技术。本技术中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
30.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
31.二裂酵母培养与发酵
32.1、菌株
33.二裂酵母(bifidobacterium adolensentis)，b71914，明舟生物。
34.2、菌株活化
35.将-80℃保藏的二裂酵母转接至mrs固体平板上，于37℃厌氧培养24h得到平板菌落，将平板菌落再次转接至mrs液体培养基中，于37℃厌氧培养24h，即可得到活化的菌液。
36.(1)菌落形态观察
37.对平板菌落进行菌株形态观察，对活化的液体菌液进行生物量和粗多糖的测定。
38.(2)生物量测定
39.收集活化的液体菌液，5000r/min离心10min，弃上清液，菌体用蒸馏水洗涤2次，在70℃烘箱中烘干至恒重，称重。
40.(3)粗多糖测定
41.收集将活化的菌液经过5000r/min离心10min的上清液，用3倍体积95％乙醇醇沉后，10000r/min离心5min，收集析出的胞外多糖沉淀于15ml离心管中，10000r/min离心2min收集沉淀去掉上清液；将收集到的沉淀溶于少量去离子水中，然后再加入4倍体积的80％(m/v)三氯乙酸，室温下搅拌45min、4℃静置30min后再次10000r/min离心15min，去掉沉淀
并收集上清液；旋转蒸发仪对上清液进行浓缩，向得到的浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇(95％)，4℃静置过夜，以去除粗多糖中的蛋白和细胞。
42.将离心管用封口膜封口，将封口膜做透气处理，放入冷冻干燥机中，-80℃冷冻干燥36h，获得胞外多糖粉末。取出后用研磨钵将多糖研磨成粉末，收集胞外多糖粉末于2ml离心管中，并将离心管放置在4℃冰箱中保存备用。
43.3、扩大培养
44.在一些实施例中，将上述活化的菌液接种至扩大培养基中，于37℃培养3d，得到扩大的培养液。在一些实施例中，还将该扩大的培养液转接至发酵培养基中，于37℃培养7d，收获最终的发酵液。在一些实施例中，将具有粗多糖含量不低于0.5g/l的活化菌液接种至扩大培养基或发酵培养基中。在一个对比例1中，将具有粗多糖含量为0.4g/l的活化菌液接种至扩大培养基或发酵培养基中。
45.在一些实施例中，将具有粗多糖含量不低于0.5g/l的活化菌液接种至扩大培养基或发酵培养基中。该扩大培养和发酵培养均为厌氧条件下进行，例如，所述厌氧条件为包含10％二氧化碳、10％氢气和80％混合气体(组分为氢气5％，二氧化碳10％，剩余气体为氮气)的气体环境。
46.在一个实施例1中，所述扩大培养基和/或所述发酵培养基包含10g/l酪蛋白胨、5g/l酵母膏、5g/l牛肉膏、5g/l大豆蛋白胨、10g/l葡萄糖、0.15g/l nh4c1、0.5g/l一水硫酸锰、0.01％v/v tween 80、50mg/l半胱氨酸盐、25mg/l半胱氨酸、二水氯化钙0.05mg/l、七水硫酸镁0.15mg/l、磷酸二氢钾0.25m g/l、磷酸氢二钾0.25g/l、碳酸氢钠2.5mg/l、氯化钠2.5mg/l。该扩大培养基和/或发酵瓶培养基可在厌氧条件下煮沸和冷却后加入半胱氨酸，在高压灭菌前将培养基的ph使用2m的naoh调成6.8，然后在高压锅中115℃高压灭菌15min。
47.在一个实施例2中，所述扩大培养基和/或所述发酵培养基包含38g/l蛋白胨、96g/l葡萄糖、19g/l酵母提取物、0.06g/l的木糖、0.15mg/l氯化钠、96mg/l半胱氨酸盐酸盐、56mg/l半胱氨酸、0.15mg/l氯化钙、0.15mg/l硫酸镁、0.15mg/l磷酸氢二钾和0.77g/l碳酸氢钠。该扩大培养基和/或发酵瓶培养基可在厌氧条件下煮沸和冷却后加入半胱氨酸，在高压灭菌前将培养基的ph使用2m的naoh调成7.2，然后在高压锅中115℃高压灭菌15min。
48.在一个对比例1的扩大和/或发酵培养过程中，其采用了对比例1提供的活化菌液作为种子。
49.在一个对比例2的扩大和/或发酵培养过程中，采用的扩大或发酵培养基均为mrs培养基。
50.二裂酵母发酵溶胞产物的制备
51.在一些实施例中，二裂酵母发酵溶胞产物的制备发方法包括：收集扩大培养或发酵培养的培养液，采用陶瓷膜进行过滤，膜材质为zro2，膜孔径为50nm，进行错流式过滤，浓缩液和滤液，菌体即包含在浓缩液中；将浓缩液置入离子束设备中，用氮离子束轰击菌体，所用离子的能量为10kev～25kev，注入的离子量为1
×
10
18
～1
×
10
19
n /cm2，注入15s，停止注入3s，反复操作30～60min，即完成了对二裂酵母的破壁处理，得到破壁液体；将破壁液和滤液混合，冷冻干燥，即得所述二裂酵母发酵溶胞产物。
52.二裂酵母发酵溶胞产物中的多糖成分分析
53.在一个实施例中，对二裂酵母发酵溶胞产物中的多糖成分进行分离，将二裂酵母
发酵溶胞产物用3倍体积95％乙醇醇沉后，10000r/min离心5min，收集析出的胞外多糖沉淀于15ml离心管中，10000r/min离心2min收集沉淀去掉上清液；将收集到的沉淀溶于少量去离子水中，然后再加入4倍体积的80％(m/v)三氯乙酸，室温下搅拌45min、4℃静置30min后再次10000r/min离心15min，去掉沉淀并收集上清液；旋转蒸发仪对上清液进行浓缩，向得到的浓缩液中加入3倍体积的无水乙醇(95％)，4℃静置过夜，以去除粗多糖中的蛋白和细胞，将离心管用封口膜封口，将封口膜做透气处理，放入冷冻干燥机中，-80℃冷冻干燥36h，获得多糖粗品。在一些实施例中，进一步对该二裂酵母发酵多糖粗品进行纯化处理。处理步骤包括采用凝胶色谱柱对该多糖粗品进行纯化，例如采用sephadexg-50进行凝胶色谱纯化，收集洗脱液，冻干处理，得到二裂酵母发酵多糖的精制冻干品，并进行分子量和结构测定。
54.在一个实施例中，收集的精制冻干品其分子量测定采用水溶性凝胶色谱柱进行检测，检测方法如下：
55.检测条件：水溶性凝胶色谱柱(waters)；流动相为0.1n硝酸钠，柱温30℃，示差折光检测器检测(watersarc)，进样量20μl，所有的测试结果通过breeze软件(waters chromatography,inc)积分处理。标准曲线：取标准葡聚糖(分子量分别为1000,5000,12000,80,150,270,670kda，南京都莱生物技术有限公司)，配成2％的溶液，13 000r/min离心10min，上清液用来制作标准曲线，进样量20μl，得到色谱图，以出现峰型的洗脱液的洗脱体积(ml)为横坐标，以葡聚糖重均分子量的对数1gmw为纵坐标绘制标准曲线，根据分子量标准曲线计算样品的分子量，最终得到的标准方程为：y＝13.562e－0.078x，r2＝0.991。
56.样品测定：取上述凝胶色谱纯化的冻干粉，用流动相溶解，配制成10mg/ml溶液，0.45μm滤膜过滤，采用上述条件进样检测，根据保留时间代入标准曲线，计算即可得到对应的分子量。
57.本技术实施例得到了5种分子量在30～80kd之间的二裂酵母多糖s1、s2、s3、s4和s5，分子量依次为62.5kd、41.7kd、38.5kd、72.4kd和76.9kd。另外，本技术实施例还对上述实施例1、实施例2、对比例1和对比例2分别得到的二裂酵母多糖中的s1～s5成分及含量进行了分析，结果如表1所示。由表1可知，实施例1和2制得的二裂酵母发酵溶胞产物中的二裂酵母多糖主要包含s1、s4和s5，而对比例1和2制得的二裂酵母发酵溶胞产物中的二裂酵母多糖主要包含s1、s2和s3，并且对比例2提供的s1、s2和s3含量更低。
58.表1
[0059][0060][0061]
二裂酵母多糖结构分析
[0062]
1、二裂酵母发酵多糖单糖组成分析
[0063]
采用离子色谱法对分子量为30～80kd的二裂酵母发酵多糖中单糖组成种类和浓
度进行定性定量分析：
[0064]
预处理：准确配制含1mg/ml的二裂酵母发酵多糖样品的2mol/l三氟乙酸，于110℃条件下处理6h，得到二裂酵母发酵多糖的水解溶液，于40℃下旋转浓缩后，再加入1.5倍体积的硅醚化试剂(吡啶：六甲基二硅胺烷：三甲基氯硅烷＝10:2:1体积比)，于80℃水浴加热处理1h，对其进行硅醚化，反应完成后用氮气吹干，1ml正已烷定容，用gc-ms/ms检测。
[0065]
色谱检测条件：tsq fortis
tm plus三重四极杆质谱仪(赛默飞)，tg-5ms amine thermo gc色谱柱(tg-5ms amine，thermo fisher scientific)；organomation n-ev ap氮吹仪(美国organomation公司)。色谱参数：质谱扫描模式:正离子模式；扫描范围:50-500；气相载气:氮气，流速为1.5ml/min；样品进样方式:不分流，进样量为1μl。气相的升温程序是:从80℃开始，以10℃/min升温至150℃,150℃保持2min，再以1.5℃/min升温至180℃，再以10℃min升温至210℃，210℃保持20min。
[0066]
标准品：分别配制200μg/ml葡萄糖、半乳糖、木糖、鼠李糖、岩藻糖、阿拉伯糖、甘露糖、果糖、半乳糖胺、葡萄糖胺和葡萄糖醛酸水溶液；在配制成5μg/ml的混合标准溶液；从混合溶液中分别取5、1、0.5、0.1、0.05ml溶液10μg肌醇作为内标，用氮吹仪吹干。用与样品相同的方法进行硅醚化衍生，用上述条件进行gc-ms/ms检测。
[0067]
2、二裂酵母发酵多糖结构分析
[0068]
采用如“niu,yg.,wang,h.y,xie,z.h.,whent,m.,gao,x.d.,et al.structural analysisand bioactivity of a polysaccharide from the roots of astragalus membranaceus(fisch)bge.var.mongolicus(bge.)hsiao[j].food chemistry,2011,128(3):620-626.”公开的方法对二裂酵母发酵多糖进行高碘酸氧化分析。采用如下方法对二裂酵母发酵多糖进行甲基化分析。
[0069]
(1)氢氧化钠-二甲基亚砜悬液(0.025g/ml)的配置
[0070]
取0.2ml新配置的氢氧化钠溶液(50％)与0.2ml甲醇混合，加入6ml dmso溶液，涡旋震荡器上剧烈振荡，超声波浴3～5min后10,000r/min离心20℃收集naoh沉淀，重复上述操作三次，最后的氢氧化钠沉淀加入4ml dmso溶液。
[0071]
(2)样品甲基化
[0072]
取干燥的多糖样品2mg置于10ml旋转蒸发瓶中，加入0.5ml二甲基亚砜溶液，超声水浴2min后静置30分钟，加入0.6ml氢氧化钠-二甲基亚砜悬液和0.6ml碘甲烷，盖紧盖子，在漩涡混合器上不停振荡混合后加入，加入4ml水终止反应，加入适量的氯仿振荡，静置分层后上层的水相弃去，重复此操作若干次，对有机相在低于40℃的条件下减压浓缩，后，进行红外光谱检测，以确定样品是否完全甲基化。将含完全甲基化的样品加入至甲酸溶液，100℃密封反应3h，在低于40℃下减压浓缩，加入等体积的2m三氟乙酸，100℃下反应6h，在低于40℃下减压浓缩。
[0073]
将3ml去离子水加入蒸干后的反应瓶中，加入适量的硼氢化钠，间歇振荡反应3h，用乙酸除去多余的硼氢化钠，加入适量甲醇减压浓缩。加入4ml乙酸酐，100℃条件下密封反应1h，冷却后加入适量的甲苯，减压浓缩，重复若干次后加入适量的氯仿，然后加入适量的蒸馏水充分震荡，静置分层后除去上层水溶液，重复此萃取操作若干次。用适量的无水硫酸钠干燥氯仿层，用有机相微孔滤膜过滤后除去无水硫酸钠，滤液减压浓缩，加入0.5ml氯仿，待气相色谱，质谱联用进行分析。
[0074]
gc-ms分析：气相色谱仪连接hp-5毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm，agilent)，柱流速为1ml/min。程序升温:hp-s毛细管柱初温120℃，以10℃lmin升到240℃，保持6.5min。进样1μl，分流比为1:30，进样口温度250℃，检测器温度为250℃，氢气35ml/min，空气350ml/min，尾吹气30mml/min。气相色谱-质谱联用(gc-ms)连接hp-5毛细管柱(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)，程序升温同气相色谱，接口温度250℃，离子源温度250℃，质量数扫描范围为40～500amu，扫描时间0.28s。
[0075]
4、结果
[0076]
对二裂酵母多糖s1～s5分别的单糖组成检测结果统计如表2所示，表2中，“－”表示未检出。
[0077]
表2摩尔百分比％
[0078]
组分s1s2s3s4s5葡萄糖glc32.529.326.425.427.4半乳糖gal34.712.49.840.838.3木糖xyl－15.616.7－12.3鼠李糖rha－13.715.37.8－岩藻糖fuc10.82.62.511.4－阿拉伯糖ara－10.9－－－甘露糖man9.2－12.49.67.9果糖fru6.48.79.3－8.2半乳糖胺(galnac)3.53.13.82.73.1葡萄糖胺(glcnac)2.91.21.72.32.8葡萄糖醛酸(glca)－2.52.1－－
[0079]
经过高碘酸氧化分析发现，s1～s5被高碘酸氧化后高碘酸消耗量与生成甲酸的量均大于2且消耗的高碘酸摩尔量小于2，说明其中含有的葡聚糖键型均包括i型：1
→
、1
→
2或1
→
6连接键型；ii型：1
→
4、1
→
2,6或1
→
4,6连接键型；iii型：1
→
3、1
→
3,4、1
→
3,6、1
→
3,4,6、1
→
2,3、1
→
2,3,6、1
→
2,4或1
→
2,4,6的连接键型。
[0080]
如图1所示的s1～s5甲基化产物的在3200～3600-1
处羟基峰消失，在2930-1
处出现甲基峰，在1050-1
出现的振动峰是由处出现强的吸收峰是毗喃糖环中的醚键伸缩振动和o-h键的变角弯曲引起的，在840-1
出现的振动峰是由α型毗喃糖环中碳氢键的特征性变性引起的；而s1、s4和s5在1720-1
处无由糖醛引起的振动峰，而在1650-1
处出现由酰胺基的c＝o伸缩引起的振动。由此再次说明，s1、s4和s5中为含有酰胺基的多糖，而s2、s3中含有糖醛酸，与上述的单糖组成相吻合。
[0081]
将完全还原后的s1～s5进行完全甲基化，得到糖醇乙酸酯衍生物(pmaas)，再经gc-ms测定，得到s1～s5的pmaas的总离子流图和相应的质谱图，将所得的pmaas峰对应的质谱图与美国佐治亚大学糖复合物研究汇总的标准谱库(the ccrc spectral database for pmaa)和中国科学院化学数据库进行比对，确定甲基化糖残基的类型，同时依据色谱峰的峰面积计算各甲基化糖残基相对摩尔百分比，最终得到两种多糖组分的糖苷键类型和摩尔百分比，具体统计结果见表3。
[0082]
表3中，“—”表示未检出。由表3可知，s1、s4和s5均包含端基的葡萄糖和端基的半
乳糖醛酸。其中，s1具有的糖苷键包括
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
、
→
1)-d-glcp-(4
→
、
→
1)-d-glcp-(6
→
、
→
4)-d-glcap-(1
→
、
→
4)-d-glcap-(3
→
、
→
3)-β-galnac-(1
→
、
→
4)-ɑ-glca-(1
→
、
→
1)-d-galp-(3
→
、
→
1)-d-galp-(6
→
、
→
1)-d-galp-(6
→
、
→
4)-β-gala-(1
→
、
→
1)-d-fucp-(3
→
、
→
2)-d-fucp-(4
→
、
→
1)-d-manp-(2,4
→
、
→
1)-d-manp-(3,6
→
、
→
1)-l-frup-(3
→
、
→
2)-l-frup-(4
→
。s2具有的糖苷键包括
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
、
→
1)-d-glcp-(4
→
、
→
1)-d-glcp-(6
→
、
→
4)-d-glcap-(1
→
、
→
1)-d-galp-(3
→
、
→
1)-d-galp-(6
→
、
→
1)-d-xylp
→
(2,3
→
、
→
2)-d-xylp
→
(3,4
→
、
→
1)-d-xylp-(3
→
、
→
2)-l-rhap-(1
→
、
→
2,4)-l-rhap-(1
→
、
→
1)-d-fucp-(3
→
、
→
2)-d-fucp-(4
→
、
→
3,5)-l-araf-(1
→
、
→
5)-l-araf-(1
→
、
→
1)-l-frup-(3
→
和
→
2)-l-frup-(4
→
。
[0083]
s3具有的糖苷键包括
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
、
→
1)-d-glcp-(6
→
、
→
4)-d-glcap-(3
→
、
→
3)-β-galnac-(1
→
、
→
1)-d-galp-(3
→
、
→
1)-d-galp-(6
→
、
→
1)-d-xylp
→
(2,3
→
、
→
2)-d-xylp
→
(3,4
→
、
→
1)-d-xylp-(3
→
、
→
2)-l-rhap-(1
→
、
→
2,4)-l-rhap-(1
→
、
→
1)-d-fucp-(3
→
、
→
2)-d-fucp-(4
→
、
→
1)-d-manp-(2,4
→
、
→
1)-d-manp-(3,6
→
、
→
1)-l-frup-(3
→
和
→
2)-l-frup-(4
→
。
[0084]
s4具有的糖苷键包括
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
、
→
1)-d-glcp-(4
→
、
→
1)-d-glcp-(6
→
、
→
4)-d-glcap-(1
→
、
→
4)-d-glcap-(3
→
、
→
3)-β-galnac-(1
→
、
→
4)-ɑ-glca-(1
→
、
→
1)-d-galp-(3
→
、
→
1)-d-galp-(6
→
、
→
1)-d-galp-(6
→
、
→
4)-β-gala-(1
→
、
→
2)-l-rhap-(1
→
、
→
2,4)-l-rhap-(1
→
、
→
1)-d-fucp-(3
→
、
→
2)-d-fucp-(4
→
、
→
1)-d-manp-(2,4
→
和
→
1)-d-manp-(3,6
→
。
[0085]
s5具有的糖苷键包括
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
、
→
1)-d-glcp-(4
→
、
→
1)-d-glcp-(6
→
、
→
4)-d-glcap-(1
→
、
→
4)-d-glcap-(3
→
、
→
3)-β-galnac-(1
→
、
→
4)-ɑ-glca-(1
→
、
→
1)-d-galp-(3
→
、
→
1)-d-galp-(6
→
、
→
1)-d-galp-(6
→
、
→
4)-β-gala-(1
→
、
→
1)-d-xylp
→
(2,3
→
、
→
1)-d-xylp-(3
→
、
→
1)-d-manp-(2,4
→
、
→
1)-d-manp-(3,6
→
、
→
1)-l-frup-(3
→
和
→
2)-l-frup-(4
→
。
[0086]
表3 s1～s5中各分子中的糖苷键摩尔百分比
[0087]
糖苷键s1s2s3s4s5terminal-glc0.00085－－0.000850.00085
→
1)-d-glcp-(2,4,6
→
7.2518.2617.528.158.31
→
1)-d-glcp-(4
→
4.364.15－5.683.68
→
1)-d-glcp-(6
→
3.146.675.734.175.18
→
4)-d-glcap-(1
→
2.883.91 4.112.61
→
4)-d-glcap-(3
→
4.39－4.542.194.58
→
3)-β-galnac-(1
→
6.14 2.412.033.97
→
4)-ɑ-glca-(1
→
7.25－－1.361.86terminal-gala0.00027－－0.000270.00027
→
1)-d-galp-(3
→
18.66.793.6722.3423.28
→
1)-d-galp-(6
→
2.8－－8.429.21
→
1)-d-galp-(6
→
12.38.726.937.946.35
→
4)-β-gala-(1
→
4.5－－4.792.55
→
1)-d-xylp
→
(2,3
→
－9.4510.69－5.24
→
2)-d-xylp
→
(3,4
→
－2.832.15－－
→
1)-d-xylp-(3
→
－3.323.85－7.06
→
1)-l-rhap-(1
→
－－－－－
→
2)-l-rhap-(1
→
－6.635.923.15－
→
2,4)-l-rhap-(1
→
－7.089.374.58－
→
1)-d-fucp-(3
→
6.481.390.687.92－
→
2)-d-fucp-(4
→
4.311.211.823.47－
→
3,5)-l-araf-(1
→
－3.27－－－
→
5)-l-araf-(1
→
－7.69－－－
→
1)-d-manp-(2,4
→
5.55－1.366.084.39
→
1)-d-manp-(3,6
→
3.65－11.043.523.51
→
1)-l-frup-(3
→
3.922.362.06－4.36
→
2)-l-frup-(4
→
2.486.347.24－3.84
[0088]
体外性能分析
[0089]
1、供试品
[0090]
将实施例1、实施例2、对比例1和对比例2分别提供的二裂酵母发酵溶胞产物分别作为供试品，其中含有的二裂酵母多糖组成及含量如表1所示。分别用去离子水配置1mg/ml、5mg/ml、20mg/ml、50mg/ml和100mg/ml。
[0091]
2、抗氧化性能
[0092]
(1)dpph自由基清除能力检测
[0093]
配制10-4
mol/l的dpph溶液，等体积分别与上述不同浓度的供试品混匀，以作为试验组；取相同体积、相同浓度的dpph溶液与等体积的去离子水混匀作为空白组；取相同体积的无水乙醇与等体积的上述不同浓度的供试品混匀，作为对照组。将三组溶液分别反应30min后分别检测517nm吸光度，计算dpph自由基清除率为50％的供试品溶液浓度ic50-1，其中，dpph自由基清除率＝(a空白组 a对照组－a试验组)/a空白组
×
100％。
[0094]
(2)羟自由基清除能力检测
[0095]
取等体积的2mm硫酸亚铁溶液、1mm双氧水溶液和6mm水杨酸混匀，于37℃水浴中15min后取出，分为试验组和对照组。向试验组中加入不同浓度的供试品溶液反应，体积占总溶液的10％，继续水浴加热15min，取出于510nm处测其吸光度，记为a试验组。以相同体积的去离子水加入对照组的混合液中，继续水浴加热15min，取出于510nm处测其吸光度，记为a对照组。另检测去离子水于510nm处测其吸光度记为a空白组。计算羟自由基清除率为50％的供试品溶液浓度ic50-2，其中，羟自由基清除率＝(a空白组 a对照组－a试验组)/a空白组
×
100％。
[0096]
3、体外酪氨酸酶抑制能力检测
[0097]
采用酪氨酸酶多巴速率氧化法测定体外酪氨酸酶活性。设置a、b、c和d四组，按照如表3所示的加入量和加入物质进行分别混合后于37℃水浴反应后，于475nm处的吸光度分别检测吸光度，计算酪氨酸酶活性抑制率为50％的供试品溶液浓度ic50-3，其中，氨酸酶活性抑制率＝[(a1－a2)－(a3－a4)]/(a1－a2)
×
100％。其中，pbs浓度为25mm，ph＝6.8；加
液顺序需依次加入pbs、供试品溶氧和酪氨酸酶溶液(500u/ml)后，于37℃水浴10min后，迅速加入0.98g/l的l-多巴溶液后，立即检测吸光值。
[0098]
表3体外酪氨酸酶抑制能力检测溶液添加量
[0099]
组别pbs(ml)供试品溶液(ml)酪氨酸酶溶液(ml)l-多巴溶液a3.300.30.4b3.6000.4c2.60.70.30.4d2.90.700.4
[0100]
4、体外透明质酸酶抑制能力检测
[0101]
用ph＝5.6的醋酸缓冲液将实施例1、实施例2、对比例1和对比例2分别提供的二裂酵母发酵溶胞产物配置成1mg/ml、5mg/ml、20mg/ml、50mg/ml和100mg/ml，以作为供试品溶液。
[0102]
试验分为：试验组、对照组、空白1组和空白2组。试验组中，取0.1ml 0.25mm氯化钙溶液和0.5ml透明质酸酶溶液(500u/ml)37℃保温20min；加入供试品日溶液0.5ml，继续37℃保温20min；加入0.5ml透明质酸钠溶液37℃保温30min，常温放置5min；加入0.1ml 0.4m氢氧化钠溶液和0.5ml乙酰丙酮溶液，置于沸水浴中加热15min后立即用冰水进行冷却5min；加入埃尔利希试剂1.0ml并用3.0ml无水乙醇进行稀释，放置20min显色，用分光光度计测定反应体系在555nm下的吸光度值，记为c。对照组中，用醋酸缓冲溶液代替供试品溶液，吸光值记为a。空白1组中，用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液，吸光值记为b。空白2组中，用醋酸缓冲溶液代替透明质酸酶溶液，吸光值记为d。
[0103]
计算体外透明质酸酶抑制率为50％的供试品溶液浓度ic50-4，其中，体外透明质酸酶抑制率＝[(a－b)－(c－d)]/(a－b)
×
100％。
[0104]
5、b16-f10试验
[0105]
(1)b16-f10细胞存活率检测
[0106]
试验分为试验组、对照组、空白组。配制b16细胞(小鼠黑色素瘤细胞，上海一研生物科技有限公司)的单细胞悬液，调整浓度为1
×
105个/ml接种至96孔板，每孔100ml，置于5％co2、37℃培养箱恒温培养24h后分为试验组和对照组。试验组用含有不同浓度的供试品溶液的dmem完全培养基更换新鲜培养基，对照组用dmem完全培养基更换新鲜培养基。置于5％co2、37℃恒温培养24h。弃去旧培养基，用pbs清洗三次，各孔加入含有0.5mg/ml mtt的无血清培养基溶液100ml，置于％co2、37℃恒温孵育4h，弃去旧培养基，加入150ml的dmso溶液溶解10min后，用酶标仪测量570nm处的吸光度值。以为添加mtt溶液的细胞孔作为空白组。计算细胞存活率为50％的供试品溶液浓度ic50-5，其中，细胞存活率＝(试验组吸光值-空白组吸光值)/(对照组吸光值-空白组吸光值)
×
100％。
[0107]
(2)b16-f10细胞黑色素合成抑制试验
[0108]
试验分为试验组、对照组、空白组。取对数生长期的b16细胞，用0.25wt％胰蛋自酶消化后，以dmem完全培养基配成密度为5
×
104个/ml的细胞悬液，接种于6孔培养板，每孔2ml，置于5％co2、37℃培养箱恒温培养24h后分为试验组和对照组。试验组用含有细胞存活率为50％的供试品溶液浓度的供试品溶液的dmem完全培养基更换新鲜培养基，对照组用dmem完全培养基更换新鲜培养基。于37℃、5％co2培养箱内培养72h后，加入400μl、1mol/l
的含10wt％dmso naoh溶液，80℃下恒温2h，取100μl在酶标仪490nm处测其吸光度值，即为试验组吸光值。空白组中，不添加供试品溶液和更换新型培养基。计算细胞存活率为50％浓度的供试品溶液处理后的相对黑色素含量。设置未经处理的细胞作为对照组，相对黑色素含量＝(试验组吸光度-空白组吸光度)/(对照组吸光值-空白组吸光值)
×
100％。
[0109]
6、成纤维细胞试验
[0110]
(1)对成纤维细胞存活影响
[0111]
收集对数生长期的成纤维细胞(人皮肤成纤维细胞，bncc341540，河南省工业微生物菌种工程技术研究中心)，铺板使待测细胞密度至5000个/孔，于37℃、5％co2下培养，细胞生长至一定密度，换液加入不同体积分数的样品，以不含样品的培养液为对照。继续培养24h，每孔加入20μl 0.5％mtt溶液(5g/l)，培养4h后弃去培养液，用pbs冲洗2～3遍后，每孔加入150μl二甲基亚飒，于摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。于490nm处测量各孔的吸光度。细胞存活率＝(测定孔吸光度－空白对照组吸光度)/(细胞对照组吸光度－空白对照组吸光度)
×
100％。
[0112]
(2)对成纤维细胞i型胶原蛋白合成影响
[0113]
取上述细胞存活试验中作用后的成纤维细胞培养液，2000～3 000r/min离心20min，保存上清液。采用col-i检测试剂盒(上海瑞番生物科技有限公司)进行检测，具体根据说明书的步骤进行操作。
[0114]
7、试验结果
[0115]
表4(mg/ml)
[0116]
实施方式ic50-1ic50-2ic50-3ic50-4实施例12.73
±
0.38b3.19
±
0.52b15.32
±
2.15b29.12
±
3.25实施例22.59
±
0.82b3.04
±
0.68b13.95
±
1.48b27.83
±
4.18对比例156.12
±
12.68a73.19
±
18.22a537.59
±
34.36a－对比例271.29
±
10.76a75.05
±
13.48a－ [0117]
表5(mg/ml)
[0118][0119][0120]
表4分别示出了实施例1、实施例2、对比例1和对比例2分别提供的二裂酵母发酵溶
胞产物分别作为供试品，检测的dpph自由基清除率ic50、羟自由基清除率ic50、体外酪氨酸酶抑制率ic50和体外透明质酸酶抑制率ic50，其中，“—”表示未检出。表4还对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。
[0121]
由表4可知，实施例1和实施例2提供的二裂酵母发酵溶胞产物具有更低的dpph自由基清除率ic50、羟自由基清除率ic50、体外酪氨酸酶抑制率ic50和体外透明质酸酶抑制率ic50，说明其具有显著的抗氧化、抗酪氨酸酶和抗透明质酸酶抑制活性，表面其还具有抑制黑色素合成和抗炎作用。
[0122]
表5示出了示出了实施例1、实施例2、对比例1和对比例2分别提供的二裂酵母发酵溶胞产物分别作为供试品，分别对b16-f10细胞的存活与其黑色素生成的影响，以及探究其对人成纤维细胞的存活和col-i表达的影响。表5还对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。结果可知，实施例1和实施例2提供的二裂酵母发酵溶胞产物不仅能抑制b16-f10生长和其黑色素合成，还能促进成纤维细胞增殖和col-i表达，提示本技术实施例提供的二裂酵母发酵溶胞产物不仅能够抑制酪氨酸酶活，抑制黑色素合成，还能促进成纤维细胞生长，促进细胞增殖，具有美白和抗衰老功效。
[0123]
动效试验
[0124]
1、供试品
[0125]
实施例1、实施例2、对比例1和对比例2提供的二裂酵母发酵溶胞产物，用ph＝6.8的pbs溶液配制成50mg/ml溶液。
[0126]
本技术实施例还以二裂酵母发酵多糖作为基础，制得了一序列的美白抗衰精华液，该美白抗衰精华液包含s1、s4或s5中的至少一项，丁二醇，丙二醇、edta二钠和水，其中，s1、s4或s5含量不低于5.6wt％，丁二醇含量为0.25～3.5wt％，丙二醇含量为0.5～1.75wt％，edta二钠含量为0.05～0.25wt％，溶于去离子水制得。
[0127]
在一个实施例3中，该美白抗衰精华液包含5.6wt％s1，丁二醇含量为3.5wt％、丙二醇含量为0.5wt％，edta二钠含量为0.05wt％，溶于去离子水制得。
[0128]
在一个实施例4中，该美白抗衰精华液包含5.6wt％s4，丁二醇含量为0.25wt％、丙二醇含量为1.75wt％，edta二钠含量为0.25wt％，溶于去离子水制得。
[0129]
在一个实施例5中，该美白抗衰精华液包含5.6wt％s5，丁二醇含量为0.25wt％、丙二醇含量为1.75wt％，edta二钠含量为0.25wt％，溶于去离子水制得。
[0130]
在一个实施例6中，该美白抗衰精华液包含3.5wt％实施例1提供的二裂酵母发酵溶胞产物，丁二醇含量为0.25wt％、丙二醇含量为1.75wt％，edta二钠含量为0.25wt％，溶于去离子水制得。
[0131]
在一个实施例7中，该美白抗衰精华液包含3.5wt％实施例2提供的二裂酵母发酵溶胞产物，丁二醇含量为0.25wt％、丙二醇含量为1.75wt％，edta二钠含量为0.25wt％，溶于去离子水制得。
[0132]
2、皮肤刺激试验
[0133]
根据《化妆品安全技术规范》(2015年版)，选取白色成年的无毛豚鼠作为受试动物，选用合格斑贴材料(三明市和众生物技术有限公司)，取20μl分别含有实施例1～7、对比例1和对比例2提供的二裂酵母发酵溶胞产物50mg/ml的ph＝6.8的pbs溶液放入斑试器内，对照孔不做添加。将加有受试物的斑试器用无刺激胶带贴敷于受试动物的背部无毛区，用
手掌轻压使之均匀地贴敷于皮肤上，斑试器持续停留在皮肤上24h。去除斑试器后间隔30min，待压痕消失后观察皮肤反应。斑贴试验后24和48h分别观察一次。结果判断，0级反应:受试部位无反应；1级反应:皮肤出现淡红斑；2级反应:皮肤出现红斑、浸润或丘疹；3级反应:皮肤出现水肿性红斑、丘疹；4级反应:皮肤出现显著红肿、伴丘疹或大疤。
[0134]
3、紫外照射试验
[0135]
将无毛豚鼠分为模型组和试验组，置于距离uvb紫外灯管约30cm处环境中，uvb紫外灯管照射波长为310nm，每次照射10min中，每8h照射1次，连续照射5次后，以作为模型鼠。在每次紫外照射前，试验组在其背部皮肤涂抹实施例1～7和对比例1～2分别提供的精华液，每次2.5ml，每8h涂抹1次后，再进行紫外照射；连续涂抹5次后，持续涂抹14天，取豚鼠的皮肤活组织切片染色后，进行组织学观察，显微照相，并对其进行光密度分析，对基底细胞中含黑素颗粒细胞计数及多巴阳性细胞计数，计算黑素颗粒细胞占其与多巴阳性细胞的比例作为色素指数。
[0136]
4、结果
[0137]
表6
[0138][0139][0140]
结果如表6可知，实施例1、2分别提供的二裂酵母发酵溶胞产物对无毛豚鼠皮肤无明显副作用，而对比例1、2提供的供试品具有不同程度的不良反应，不适合作为化妆品应用。
[0141]
表6还示出了实施例1～2提供的二裂酵母发酵溶胞产物，实施例3～7分别提供的美白抗衰精华液对紫外照射豚鼠皮肤的干预结果，对其皮肤色素指数进行多重比较和显著性差异标记，结果实施例1～7作为供试品具有更加的降低色素合成的干预作用，而对比例1～2无明显效果，并且实施例3～7提供的美白抗衰精华液具有较佳的美白作用。
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综上所述，本技术实施例通过对二裂酵母发酵与培养，对其发酵产物进行过滤、菌体破壁、破壁液体和滤液混合，干燥得到了二裂酵母发酵溶胞产物，从中分离得到5种分子量为30～80kd之间的二裂酵母多糖s1、s2、s3、s4和s5，并且对二裂酵母发酵多糖进行了初
步的结构分析，发现其s1、s4和s5中为含有酰胺基的多糖，而s2、s3中含有糖醛酸。
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本技术进一步对得到的二裂酵母发酵溶胞产物进行体外试验，发现了实施例1和2提供的二裂酵母发酵溶胞产物具有更低的dpph自由基清除率ic50、羟自由基清除率ic50、体外酪氨酸酶抑制率ic50和体外透明质酸酶抑制率ic50，提示本技术实施例提供的二裂酵母发酵溶胞产物不仅能够抑制酪氨酸酶活，抑制黑色素合成，还能促进成纤维细胞生长，促进细胞增殖，具有美白和抗衰老功效。
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本技术进一步通过动物试验证实了二裂酵母发酵溶胞产物中的s1、s4和s5作为基础的二裂酵母发酵多糖不仅对皮肤无明显的刺激和副反应作用，还能够有效减低黑色素合成，再次证实其具有明显的美白和抗衰老功效。
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以上所述，仅为本技术较佳的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本技术揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。