罗伊氏乳杆菌作为骨骼肌衰老和损伤/再生过程的生物标志物的应用

：
1.本发明属于生物技术和微生物学领域，具体涉及罗伊氏乳杆菌作为骨骼肌衰老和损伤/再生过程的生物标志物的应用。


背景技术：

2.老龄化给家庭和整个社会都带来了巨大的经济和社会负担，尤其是临床系统。近年来，老龄化的负担受到了广泛的关注，并预计在未来几十年内会变得空前严重。肌萎缩症是一种进行性的、与年龄有关的骨骼肌疾病，涉及加速的肌肉萎缩和功能缺陷。约有5％至13％的"肌萎缩症"患者为60至70龄，而八旬老人(定义为80至89龄的人)的患病率则从11％增至50％。据一项流行病学调查估计，目前全球有超过5千万人正经历或患上"肌萎缩症"，而这个数字在未来40年将达到2亿人。临床和流行病学调查显示，肌肉疏松症与不良健康后果之间有不可或缺的联系，包括但不限于跌倒、虚弱、残疾，甚至死亡，强调了骨骼肌的质量和健康功能在老年人群中的重要性。
3.肠道微生物群在宿主的生理、代谢、免疫和组织再生方面具有重要功能。衰老伴随着肠道微生物群的显著改变，可能是由于生活方式的改变，如运动减少、代谢紊乱和长期使用药物。最近的研究表明，肠道微生物与骨骼肌质量和功能之间存在关联，因为接受健康老年患者粪便移植的小鼠相对于接受肌肉功能受损的老年患者粪便移植的小鼠而言，肌肉功能有所改善。一些研究探讨了人类的肠道-肌肉轴，基于测序的研究强调了患有或不患有肌肉疏松症和重症肌无力(mg)患者之间的肠道微生物组成的差异。从机制上讲，蛋白质代谢、慢性炎症、代谢阻力、线粒体功能障碍和宿主基因表达的改变可能导致肠道-肌肉轴失调。肠道微生物群在卫星细胞稳态中的作用，特别是在衰老过程中或在骨骼肌再生过程中的作用还不清楚，因为卫星细胞的数量在衰老过程中逐渐减少，对出生后的生长和更新有很大贡献。本发明公布了罗伊氏乳杆菌在制备缓解骨骼肌衰老和骨骼肌损伤再说方面的应用。


技术实现要素：

4.本发明的第一个目的是提供一种缓解骨骼肌衰老和骨骼肌损伤再生的肠道菌群生物标志物。
5.所述的缓解骨骼肌衰老和骨骼肌损伤再生的肠道菌群生物标志物是罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)。
6.本发明的第二个目的是提供上述肠道菌群生物标志物在制备诊断缓解骨骼肌衰老和骨骼肌损伤再生状况的产品中的应用。
7.优选，所述的产品可以是对所述罗伊氏乳杆菌进行检测的试剂，如对所述罗伊氏乳杆菌具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
8.进一步优选，所述的特异性的引物是扩增罗伊氏乳杆菌16s rrna的引物。
9.本发明的第三个目的是提供一种诊断缓解骨骼肌衰老和骨骼肌损伤再生状况的
产品，所述的产品包括检测上述肠道菌群生物标志物-罗伊氏乳杆菌丰度的试剂。
10.所述的试剂是对所述罗伊氏乳杆菌具有特异性的引物、探针、反义寡核苷酸、适配体或抗体。
11.本发明的第四个目的是提供上述罗伊氏乳杆菌在制备缓解骨骼肌衰老和骨骼肌损伤再生的药物中的应用。
12.lactobacillus reuteri是我们发现的一种与骨骼肌老化非常密切的细菌，其水平在t3阶段明显诱导，随后在肌肉再生过程中逐渐下降。这些数据表明，lactobacillus reuteri可能是参与衰老相关骨骼肌再生缺陷的关键微生物群。总之，我们的研究精确地确定了肠道微生物群尤其是lactobacillus reuteri参与调节骨骼肌衰老和损伤/再生过程。
附图说明：
13.图1是罗伊氏乳杆菌的结构和功能在衰老过程发生的明显变化图；
14.图2是罗伊氏乳杆菌是骨骼肌再生过程中的关键细菌菌群图。
具体实施方式：
15.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
16.实施例1：
17.一、实验方法：
18.1、动物饲养：本项目采用c57bl/6j小鼠，购自广州中医药大学动物中心(动物许可证编号：scxk 2008-00202008a002)。所有的小鼠都被安置在广东省科学院微生物研究所的特定无病原体(spf)动物设施中，在标准的实验室条件下，在21-23℃的环境下，12小时的光照/黑暗周期。c57bl/6j小鼠以啮齿动物饲料喂养，自由饮水。成对的c57bl/6j小鼠进行交配，以产生足够的小鼠在不同的年龄阶段。收集不同年龄的c57bl/6j小鼠的粪便、血清和骨骼肌样本：2周龄(年龄：2-3周龄)，8周龄(年龄：8-10周龄)，40周龄(年龄：40-50周龄)和80周龄(年龄：80-90周龄)。c57bl/6j小鼠也被用于edl肌肉的单肌纤维分离和cx诱导的ta肌肉再生。所有的实验程序都得到了微生物研究所动物护理使用委员会的批准(动物使用协议编号：gt-iacuc201704071)。
19.2、骨骼肌损伤和再生：c57bl/6j小鼠通过静脉注射4％的水合氯醛进行麻醉。通过皮下注射布洛芬(1mg/ml)。通过肌肉注射100μm的心脏毒素(ctx)诱导ta肌肉损伤，ctx溶于100l pbs溶液。
20.3、16s rrna测序：粪便样品被收集在1.5毫升的冷冻瓶中，立即在液氮中冷冻，并储存在-80℃的冷冻室中，直到进一步分析。使用quick-dna fecal/soil microbe miniprep kit提取粪便细菌总dna。使用q5高保真dna聚合酶(neb)与引物341f(5'-cctacgggnggcwgcag-3')和805r(5'-gactachvgggtatctaatcc-3')扩增细菌16s rrna基因的v3-v4区域。聚合酶链反应(pcr)产物用ampure xp(beckman coulter)纯化，并使用qubit dsdna高灵敏度检测试剂盒(thermofisher)进行定量。将样本汇集起来建立文库，并在illuminanovaseq pe250平台上进行测序。使用fastx工具包对序列进行修剪，并根据条形码对单端读数进行合并。为了获得高质量的读数，使用qiime 1(v1.91)工作流程对序列进行了质量控制(也被qiime 2工作流程确认)。达到97％相似度阈值的序列被分配到相同的
out。
21.二、实验结果
22.1：肠道微生物群，尤其是罗伊氏乳杆菌的结构和功能在衰老过程发生的明显变化
23.肠道微生物群，尤其是罗伊氏乳杆菌的结构和功能在衰老过程发生的明显变化
24.我们收集了不同年龄小鼠的粪便样本，然后进行16s rrna测序，以确定与sc稳态有关的标志性生物标志物。我们没有观察到不同年龄段的α-多样性的明显差异(shannon指数，图1a)。然而，pca表明，不同年龄的小鼠具有明显不同的微生物结构，并沿着pca1轴分别聚类(图1b-c)。基于bugbase算法的预测表明，潜在的致病菌在衰老过程中有所增加(图1d)。不同年龄段的肠道微生物群的相对丰度在分类学上有很大差异，如类杆菌、韧皮菌和蛋白菌(图1e)。采用了5倍交叉验证和随机森林算法，并考虑了最低错误率和标准偏差。对于四个不同年龄段的数据，10次试验分析确定了16个核心细菌，最大平均准确度为0.81，其次是随机森林算法的优化平均减少准确度(mda)值(图1f)。在这些细菌中，乳酸菌属，尤其是罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)种类在衰老过程中都逐渐减少(图1g)。
25.2：罗伊氏乳杆菌是骨骼肌再生过程中的关键细菌菌群
26.我们收集并分析了肌肉损伤后小鼠的粪便样本，特别是整个再生过程中的动态变化。事实上，在骨骼肌再生过程中，就多样性而言，香农指数在损伤和再生后发生了显著变化(图2a)，通过pca评估的-多样性显示，细菌结构在肌肉损伤的急性期(t1)迅速改变，并逐渐恢复到未损伤状态(图2b)。因此，为了确定受伤后急性期的潜在贡献者，比较急性期(t1)和未受伤期(t0)的相对丰度表明，在t1阶段，罗伊氏乳杆菌(lactobacillus reuteri)的水平显著下降，而akkermansia muciniphila、parabacteroides distonis和bacteroides acidifaciens水平显著上升(图2c)。尽管细菌种类有所改变，但损伤修复期间肠道微生物群的总体分布受到很大影响(图2c)。为了确定骨骼肌再生期间的标志性生物标志物，我们探索了一个强大的机器学习模型。随机森林的结果显示，在前14个候选者中，lactobacillus reuteri和bacteroides acidifaciens是可能参与肌肉再生的细菌物种(图2d-e)。在骨骼肌再生过程中，lactobacillus reuteri的相对丰度急剧下降，而bacteroides acidifaciens则在t1阶段有所增加(图2f-i)。lactobacillus reuteri也是我们发现的一种与骨骼肌老化非常密切的细菌，其水平在t3阶段明显诱导，随后在肌肉再生过程中逐渐下降(图2j)。这些数据表明，lactobacillus reuteri可能是参与衰老相关骨骼肌再生缺陷的关键微生物群。总之，我们的研究精确地确定了肠道微生物群尤其是lactobacillus reuteri参与调节骨骼肌衰老和损伤/再生过程。