环状核苷磷酸酯类化合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及抗病毒化合物合成技术领域，尤其涉及一种环状核苷磷酸酯类化合物及其应用。


背景技术：

2.乙型肝炎病毒(hepatitis b virus,hbv)是引起乙型肝炎(简称乙肝)的病原体，属嗜肝dna病毒科，该科病毒包含正嗜肝dna病毒属和禽嗜肝dna 病毒属两个属，引起人体感染的是正嗜肝dna病毒属。乙型肝炎是由乙型肝炎病毒导致的可能危及生命的肝脏感染。乙肝已经成为一个主要全球性卫生问题，据世界卫生组织报告，2015年全球乙肝的感染人数已经达到2.57 亿，乙肝患者死于肝硬化和肝癌的风险很高。乙型肝炎病毒dna(脱氧核糖核酸)是乙肝病毒的核心物质和病毒复制的基础。核苷类化合物可通过直接竞争性地与天然脱氧核糖底物相结合而抑制病毒聚合酶的活性，也可以插入dna中而终止dna链的合成。因此核苷类化合物是治疗乙型肝炎的主要药物，主要包括西多福韦、阿德福韦、拉米夫定以及替诺福韦(tenofovir)等。替诺福韦是一种新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，可有效对抗多种病毒，用于治疗病毒感染性疾病。由于替诺福韦在生理ph条件下为双负离子的膦酸基团，故替诺福韦不易透过细胞膜吸收，生物利用度很低，并且还存在剂量依赖性肾毒性，从而限制了它的治疗作用。因此替诺福韦必须通过酯化、成盐等手段制成膦酸酯前药才能用于临床，例如富马酸替诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate)就是吉里德科学公司(gilead science)研发的第一代口服有效的替诺福韦前药，用于艾滋病和乙型病毒型肝炎的治疗。
[0003][0004]
由于富马酸替诺福韦酯对由血清酶介导的水解反应高度敏感，不能有效增加作用部位药物浓度，同时在代谢过程还释放两当量的具有潜在毒性的甲醛，并且在临床治疗过程中还发现具有乳酸性酸中毒，严重的肝肿大，以及脂肪代谢障碍等副作用。因此为了提高替诺福韦前药在血浆中的稳定性及生物利用度，降低其代谢产物-替诺福韦在血浆中的浓度从而降低药物毒性，研究和开发新一代替诺福韦前药一直是各大公司的研究热点，目前已取得了一些成果，例如吉利德申请的专利(专利文献号wo0208241)披露了一类用天然氨基酸(单取代)合成的替诺福韦磷酰胺酯前药(例如gs-7340)已经获得fda的批准，用于治疗乙型肝炎，商品名为韦立得(vemlidy，gs-7340 的富马酸盐)，是一种新型替诺福韦靶向前
体药物，临床实验显示其药效类似于韦瑞德(viread，富马酸替诺福韦酯/tdf，300mg)的抗乙肝病毒功效，但是与韦瑞德相比，韦立得可提高肾脏和骨骼实验室安全参数，且剂量仅为后者的十分之一。
[0005][0006]
vemlidy在中国于2018年11月获批，用于治疗成人和青少年(12岁以上，体重至少为35kg)的慢性乙型肝炎(hbv)。值得一提的是，vemlidy 是中国市场十年来首款获批治疗乙肝的新型口服方案。然而，gs-7340在血浆中还有一定程度的降解，在血浆中可检测到1-2％的替诺福韦代谢产物，从而不可避免地存在像替诺福韦酯所产生的毒副作用，导致药物使用的安全性存在问题。因此，进一步研究开发具有高疗效低毒性的替诺福韦前药具有重要意义。


技术实现要素：

[0007]
针对上述现有技术的不足，本发明从进一步提高替诺福韦前药在血浆中的稳定性设计理念出发，利用苯甘氨酸衍生物合成了一系列替诺福韦环状磷酰胺酯前药，该类前药一方面在血浆中非常稳定，在血浆中完全没有检测到代谢产物即替诺福韦，另一方面，与gs-7340相比，外周血单核细胞(pbmcs) 中活性代谢物替诺福韦的浓度显著增加，从而提供一类疗效高、毒副作用低的新型抗乙肝口服药物。
[0008]
本发明的式ⅰ所示的环状核苷磷酸酯类化合物，及其药物上可接受的盐；
[0009][0010]
z为连接键或chr1；
[0011]
当w为连接键或c(o)时，r为ch(r')c(y)or2；当w为chc(y)or2时， r为h；y为o或s；r'为h、d或未被取代的或被1～5个卤素取代的c
1-6
烷基或c
3-8
环烷基；
[0012]
各z1、z2、z3、z4独立地为n、cra，ra为h、卤素、cn、orb、n(rb)2或 co2rb，或者相邻两个碳原子上的ra与连接的碳原子形成4～8元碳环或杂1～3 个选自n、o和s杂原子的4～8元杂环；各rb独立地为h、c
1-6
烷基、c
3-8
环烷基、c
1-6
酰基或c
1-6
磺酰胺基；或者两个rb可以与相连的氮原子形成4～8元环；
[0013]
r1为氢、氧代(＝o)或未被取代的或被1～5个卤素取代的c
1-6
烷基、c
3-8
环烷基、c
2-6
烯基或c
2-6
炔基；
[0014]
r2为未被取代的或被1～5个卤素或c
1-6
烷氧基取代的c
1-6
烷基或c
3-8
环烷基。
[0015]
式ⅰ中，
[0016]
选自：
[0017][0018]
在本发明一较佳实施例中，r'为h、d或未被取代的或被1～3个卤素取代的c
1-4
烷基或c
3-7
环烷基；优选地为h、d或未被取代的或被1～2个卤素取代的 c
1-3
烷基或c
3-6
环烷基。
[0019]
在本发明一较佳实施例中，各z1、z2、z3、z4独立地为n、cra，ra为h、卤素、cn、orb、n(rb)2或co2rb，或者相邻两个碳原子上的ra与连接的碳原子形成4～7元碳环或杂1～3个选自n、o和s杂原子的4～7元杂环；各rb独立地为h、c
1-4
烷基、c
3-7
环烷基、c
1-4
酰基或c
1-4
磺酰胺基；或者两个rb可以与相连的氮原子形成4～7元环；优选地，各z1、z2、z3、z4独立地为n、cra， ra为h、卤素、cn、orb、n(rb)2或co2rb，或者相邻两个碳原子上的ra与连接的碳原子形成4～6元碳环或杂1～2个选自n、o和s杂原子的4～6元杂环；各rb独立地为h、c
1-3
烷基、c
3-6
环烷基、c
1-3
酰基或c
1-3
磺酰胺基；或者两个 rb可以与相连的氮原子形成4～6元环。
[0020]
在本发明一较佳实施例中，r1为氢、氧代(＝o)或未被取代的或被1～3 个卤素取代的c
1-4
烷基、c
3-7
环烷基、c
2-5
烯基或c
2-5
炔基；较佳地为氢、氧代(＝o)或未被取代的或被1～2个卤素取代的c
1-3
烷基、c
3-6
环烷基、c
2-4
烯基或 c
2-4
炔基；
[0021]
r2为未被取代的或被1～3个卤素或c
1-4
烷氧基取代的c
1-4
烷基或c
3-7
环烷基；较佳地为未被取代的或被1～2个卤素或c
1-3
烷氧基取代的c
1-3
烷基或c
3-6
环烷基。
[0022]
本发明的另一目的在于提供本发明的环状核苷磷酸酯类化合物在制备治疗肝炎病毒药物中的应用。尤其是，所述肝炎病毒为乙肝病毒。
[0023]
本发明的环状核苷磷酸酯类化合物的合成流程如下：
[0024][0025]
本发明的提供的式ⅰ所示的替诺福韦环状磷酰胺酯前药在血浆中非常稳定，在血浆中完全没有检测到代谢产物即替诺福韦，且具有优异的抗肝炎病毒的效果。
具体实施方式
[0026]
实施例1
[0027][0028]
步骤一：中间体d1的合成
[0029]
2-羟基苯甘氨酸2g(12mmol)溶在40ml的异丙醇中，滴入2eq的氯化亚砜 (2.8g,239mmol)升温回流过夜。母液旋干，加入1mol/l稀盐酸和甲基叔丁基醚萃取2次，水相用饱和碳酸氢钠调节ph到碱性，用乙酸乙酯萃取3次，乙酸乙酯层用盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩得到1.1g粗品，柱层析纯化，得到中间体d1。
[0030]1h nmr(400mhz,cdcl3):δ7.21(td,j＝7.2hz,j＝1.2hz,1h),7.07(dd,j＝ 7.2hz,j＝1.2hz,1h),6.87(dd,j＝8.0hz,j＝0.8hz,1h)，6.82(td,j＝7.6hz,j＝ 1.2hz,1h),5.07～5.13(m,1h),4.80(s,1h),1.28(d,j＝6.4hz,3h),1.19(d,j＝6.4hz, 3h)。
[0031]
步骤二：化合物c1的合成
[0032]
在70℃下，向替诺福韦(l g,3.5mmol)的无水乙腈(2.5ml)悬浮液中，滴加氯化亚砜(1.67g,14mmol)，混合物在70℃下继续反应1.5小时至混合物全部澄清，减压蒸除溶剂和过量的氯化亚砜，得到黄色固体，冷却至室温，加入二氯甲烷(10ml)，下加入中间体d1(732mg,3.5mmol)的二氯甲烷(10ml)和n,n
-ꢀ
二异丙基乙胺(diea)(2ml)溶液，室温搅拌过夜，过滤，干燥得到白色粉末的目标化合物c1。
[0033]1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.31(m,1h),8.09(m,1h),7.32-7.41(m,2h), 7.21-7.14(m,1h),7.07(m,1h),6.10(m,1h),5.80(b,2h),5.15-4.99(m,1h), 4.46(m,2h),3.93(m,2h),3.79(m,2h),1.34-1.26(m,3h),1.28-1.19(m,6h)。 lc/ms(esi)：m/z 461.1[m h]

。
[0034]
实施例2
[0035][0036]
步骤一：中间体d2的合成，方法同实施例1的步骤一，用原料异丁醇代替异丙醇。
[0037]
步骤二：化合物c2的合成
[0038]
同实施例1，得化合物c2(收率52％)。
[0039]1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.31(m,1h),8.09(m,1h),7.32-7.41(m,2h), 7.21-7.14(m,1h),7.07(m,1h),6.10(m,1h),5.80(b,2h),5.15-4.99(m,1h), 4.46(m,2h),3.93(m,2h),3.79(m,2h),3.45(m,1h),1.89-1.95(m,1h),1.34-1.26(m, 3h),0.84-0.91(m,6h)。lc/ms(esi)：m/z 475.1[m h]

。
[0040]
实施例3
[0041][0042]
步骤一：中间体d3的合成
[0043]
将水杨醛(1.22g,10mmol)溶解在1,2-二氯乙烷(20ml)中，加入l-丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.68g,10mmol)、三乙胺(1.01g,10mmol)、三乙酰氧基硼氢化钠(4.2g, 20mmol)和几滴醋酸。室温下搅拌直到反应完全。反应混合物加水稀释，用二氯甲烷萃取，无水硫酸镁干燥、过滤、滤液减压浓缩至干、柱层析纯化得中间体d3(收率：62％)。lc/ms(esi)：m/z 238[m h]

。
[0044]
步骤二：化合物c3的合成
[0045]
用中间体d3代替中间体d1，其他同实施例1的步骤二，得化合物c3(收率：41％)。
[0046]1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.30(m,1h),8.11(m,1h),7.11-7.33(m,4h), 5.84(b,2h),4.41-4.51(m,3h),3.93-4.22(m,2h),3.75-4.08(m,4h),1.58(m,3h), 1.26-1.34(m,3h),1.07-1.15(m,6h)。lc/ms(esi)：m/z 489.1[m h]

。
[0047]
实施例4
[0048]
[0049]
步骤一：中间体d4
[0050]
向水杨酸(1.38g,10mmol)的二氯甲烷(20ml)中加一滴dmf(n,n-二甲基甲酰胺)，然后在0℃滴加草酰氯(12mmol)，2小时后，减压浓缩至干，然后溶于20ml 二氯甲烷中。
[0051]
将l-丙氨酸异丙酯盐酸盐(1.68g，10mmol)和三乙胺(1.01g,10mmol)溶于 20ml二氯甲烷中，冷却至0℃，然后滴加上面制备好的水杨酰氯二氯甲烷溶液。反应混合物搅拌过夜。然后依次用40ml水、1n的盐酸洗涤，水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩至干，硅胶柱层析纯化得中间体d4(收率81％)。1h-nmr(400mhz,cdcl3):δ12.2(s,1h),7.40-7.48(m,2h),7.03(brs,1h),7.00(dd, j＝0.8,8.4hz,1h),6.89(dt,j＝0.8,8.0hz,1h),5.13(m,1h),4.72(m,1h),1.54(d, j＝7.2hz,3h),1.34(d,j＝6.4hz,3h),1.31(d,j＝6.4hz,3h)。
[0052]
步骤二：化合物c4的合成
[0053]
用中间体d4代替中间体d1，其他同实施例1的步骤二，得化合物c4(收率：41％)。1hnmr(400mhz,cdcl3):δ8.31(m,1h),8.09(m,1h),7.52-7.43(m, 2h),7.24-7.14(m,2h),5.86(b,2h),5.15-5.19(m,1h),4.73(m,1h),4.46-3.97(m,2h), 3.79(m,2h),3.41(m,1h),1.54(m,3h),1.34(m,6h),1.31(m,3h)。。lc/ms(esi)： m/z 503.1[m h]

。
[0054]
实施例5
[0055][0056]
化合物c5的合成：
[0057]
用原料2-氨基-3-(2-羟基苯基)乙酸代替2-羟基苯甘氨酸，其他同实施例1，得化合物c5(收率：36％)。lc/ms(esi)：m/z 475.1[m h]

。
[0058]
以下列原料为起始原料，再根据实施例1、3和4的方法，可得到相应的中间体化合物
[0059]
表1中间体化合物的合成
[0060]
[0061][0062]
效果实施例1体外抗病毒实验
[0063]
a、体外抗乙型肝炎病毒活性研究以hepg 2.2.15细胞为乙型肝炎病毒载体，测定化合物抑制乙型肝炎病毒进行dna复制的能力。
[0064]
测试方法：hepg 2.2.15细胞接种于96孔培养板中，细胞数3.5
×
104个培养，置co2培养箱中孵育至细胞密度达到80％。24小时后按不同稀释度分别加入样品及阳性对照药(gs-7340和gs-7171(gs-7340的非对映异构体混合物))，同时设细胞对照孔，加药72小时后分别更换含不同稀释浓度样品的培养液，于加药后第6天分别收集细胞上清及hepg 2.2.15细胞，采用点杂交的方法检测细胞中 hbv dna复制程度，计算ic
50
(结果见表2)。
[0065]
b、细胞毒性试验
[0066]
测试方法：hepg 2.2.15细胞接种于96孔培养板中，按不同稀释度分别加入样品及阳性对照药，于加药后第6天加celltiter-blue(promega,catalog #g8081)，使用flexstation 3仪测得荧光读数，计算cc
50
(结果见表2)。
[0067]
表2、各化合物的hbv抑制率和细胞毒性结果
[0068][0069]
*si＝cc
50
/ic
50
[0070]
效果实施例2替诺福韦前药在新鲜人全血中的代谢稳定性和在外周血单核细胞(pbmcs)细胞中的分布试验
[0071]
1、试验方法
[0072]
在37℃条件下，将化合物和新鲜人全血共同孵育，分别在孵育0.5小时、2小时后分离血桨和pbmcs细胞，测定血桨和pbmcs细胞中药物原形及代谢物替诺福韦(pama)的浓度，细胞计数仪计算pbmcs细胞。
[0073]
2、血桨/pbmc样品处理
[0074]
向l00μl血桨样品或pbmcs样品中分别加入20μl内标溶液(400ng/ml sn-38 溶液)，5μl甲醇-水(50:50,v/v)和200μl乙腈，涡流混匀l min，离心5min(14000 rpm)。取20μl上清液和180μl流动相混匀，涡流l min,取l0μl进行lc/ms/ms分析。
[0075]
表3替诺福韦前药在新鲜人全血中的代谢稳定性和在pbmcs细胞中的分布
[0076][0077]