一种白桦转录因子BpRAV1基因及其表达载体和应用的制作方法

一种白桦转录因子bprav1基因及其表达载体和应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种白桦转录因子bprav1基因及其在培育抗旱耐盐植物中的应用。


背景技术：

2.转录因子，又被叫做反式作用因子，是一类能够特异性识别并结合存在于真核生物基因启动子上的顺式作用元件的蛋白质。植物作为固着生长的生物，直接暴露于高盐、干旱、寒冷等各种环境胁迫下，为了减少逆境胁迫的不利影响，植物细胞会通过多种信号传导途径，如脱落酸、赤霉素和乙烯等介导的信号传导途径，将胁迫信号传递给参与胁迫应答的转录因子，进而由它们激活下游相关胁迫应答基因的表达，最终导致生理和代谢发生变化，使植物产生抗逆反应。
3.rav是植物特有的一类含有ap2结构域和b3结构域的转录因子。已有研究表明，rav转录因子在植物多种生物学过程中起作用，包括植物生长发育、对逆境胁迫的防御反应和激素信号传导等。过量表达gmrav的转基因烟草表现为生长速度降低、根系伸长受抑制以及开花时间延迟，表明gmrav可能在植物生长发育过程中发挥重要作用。过量表达辣椒carav1的拟南芥植株对病原菌的抗性明显增强。gmrav
‑
03的过量表达可以增加转基因拟南芥对高盐和干旱的抗性，并导致转基因植株对外源aba不敏感。在拟南芥和大豆中，gmrav1通过细胞分裂素信号通路调控根和茎的再生。
4.白桦(betula platyphylla)是主要的阔叶树种之一，桦木科桦属，其生长迅速，适应性和抗逆性较强，是研究耐盐抗旱机理和进行耐盐抗旱基因克隆的理想材料。尽管rav转录因子已被发现参与了植物的多种生物学过程，但目前的研究多集中在拟南芥、水稻等草本植物中，对木本植物的研究相对缺乏，并且对于rav基因的功能，例如它们调控植物抗逆反应的分子机制等，还有待深入研究。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明的目的是提供一种白桦转录因子bprav1基因。本发明的另一目的是提供白桦转录因子bprav1基因在白桦抗旱耐盐育种中的应用。
6.为了实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：
7.一种白桦转录因子bprav1基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.白桦转录因子bprav1基因的表达蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明还提供了一种含有所述白桦转录因子bprav1基因的表达载体。
10.本发明还提供了一种含有白桦转录因子bprav1基因的表达载体的构建方法，将如seq id no.1所示的bprav1基因的全长编码区序列克隆到prok2载体中camv 35s启动子的下游，构建过表达植物载体prok2
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bprav1；截取如seq id no.1所示的bprav1基因编码区自起始密码子开始的一段长为268bp的序列，将这段序列分别正向和反向地插入到pfgc5941载体中，构建抑制表达载体pfgc5941
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bprav1。
11.本发明还提供了一种白桦转录因子bprav1过表达与抑制表达白桦植株的获得方法，将过表达载体prok2
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bprav1和抑制表达载体pfgc5941
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bprav1，分别通过农杆菌介导的瞬时转化体系转化野生型白桦组培苗，构建白桦bprav1基因的过表达与抑制表达植株。
12.本发明还提供了白桦转录因子bprav1基因在提高植物抗旱耐盐能力中的应用。特别是在于提高林木抗旱耐盐能力中的应用，更具体的是在提高白桦抗旱耐盐能力中的应用。
13.本发明的有益效果：与现有技术相比，本发明从白桦中克隆得到一条rav转录因子基因bprav1，通过瞬时转化方法使bprav1基因在白桦中过量表达或抑制表达，对转基因白桦苗在nacl或甘露醇胁迫下的生理生化染色、生理指标测定及胁迫应答基因表达量的研究发现，bprav1基因的表达水平与转基因白桦植株对胁迫的耐受性呈正相关，可见bprav1基因具有一定的抗逆功能，在培育抗旱耐盐转基因植物品种中将具有广泛的应用。
附图说明
14.图1是盐和渗透胁迫下bprav1基因的表达模式。
15.图2是bprav1基因在不同白桦植株中的表达量。
16.图3是dab染色结果。
17.图4是nbt染色结果。
18.图5是evans blue染色结果。
19.图6是sod活性测定结果。
20.图7是pod活性测定结果。
21.图8是sod和pod基因在不同白桦植株中的表达量。
具体实施方式
22.下面结合具体实施例对本发明进一步详细说明。
23.实施例1白桦bprav1基因的克隆以及bprav1过表达和抑制表达载体的构建
24.1、白桦bprav1基因的克隆
25.在白桦基因组数据库中比对到一条rav转录因子家族的同源基因，使用orf finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf.html)工具发现该基因全长包含完整的编码区，进一步设计全长引物，以白桦cdna为模板进行pcr测序验证。经分析，最终获得bprav1基因编码区全长序列如seq id no.1所示，其表达蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
26.2、bprav1过表达和抑制表达载体的构建
27.将bprav1基因的全长编码区序列克隆到prok2载体中camv 35s启动子的下游(全长序列插入prok2载体的smai位点)，构建过表达植物载体prok2
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bprav1。截取bprav1基因编码区自起始密码子开始的一段长为268bp的序列，将这段序列分别正向和反向地插入到pfgc5941载体中(其中，正向序列插入pfgc5941载体的ncoi和swai位点中间，反向序列插入pfgc5941载体的bamhi和xbai位点中间)，构建抑制表达载体pfgc5941
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bprav1。通过电击法将bprav1过表达和抑制表达载体分别转入eha105农杆菌中，经pcr检测和测序验证后保存菌种备用。
28.实施例2bprav1基因的抗逆功能研究
29.1、bprav1基因的表达模式分析
30.为了研究bprav1基因在非生物胁迫处理下的表达模式，分别用200mm nacl、300mm甘露醇处理白桦苗3、6、9、12、24h，收集各个胁迫时间点的白桦叶片，提取rna，并反转录成cdna，用于实时荧光定量pcr分析。结果如图1所示，bprav1基因的表达量随着盐和渗透胁迫时间的增加而逐步升高，并在12h达到峰值，随后下降，表明bprav1基因受盐和渗透胁迫诱导表达。
31.2、bprav1过表达与抑制表达白桦植株的获得
32.将过表达载体prok2
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bprav1和抑制表达载体pfgc5941
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bprav1，分别通过电击法转化eha105农杆菌，检测无误后保存菌种用于白桦侵染。将prok2
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bprav1农杆菌和pfgc5941
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bprav1农杆菌分别活化至菌液od
600
达到0.4
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0.5，离心收集菌体并重悬于1/2wpm液体培养基中(含终浓度为150μm的乙酰丁香酮)，用作白桦侵染菌液。选取1个月大的白桦组培苗，浸入侵染菌液中，25℃，120rpm培养2d，每天更换一次新的1/2wpm液体培养基。培养结束后，取出瞬时侵染的白桦苗用蒸馏水冲洗3遍，即得到白桦bprav1基因的过表达(oe)与抑制表达(rnai)植株。进而通过实时荧光定量rt
‑
pcr分析bprav1基因在过表达与抑制表达植株中的表达量，结果如图2所示。与野生型植株(wt)相比，bprav1基因在oe植株中的表达水平明显增加，而在rnai植株中的表达则被显著抑制，在mock植株(转染空白农杆菌细胞的植株作为空白对照)中bprav1的表达水平没有显著差异。
33.3、非生物胁迫下bprav1介导的活性氧(ros)清除能力
34.将oe，rnai和mock植株移至含有200mm nacl或300mm甘露醇的wpm培养基上培养12小时，在正常wpm培养基上生长的植株用作对照(control)，然后取未胁迫处理和胁迫处理后各植株的叶片进行dab和nbt染色，以检测活性氧(ros，reaction oxygen species)的水平，dab着色代表h2o2积累水平，nbt着色代表o2‑
积累水平。结果如图3和图4所示，在正常的生长条件下，所有植株叶片均表现出很低的h2o2和o2‑
积累；而在盐和渗透胁迫条件下，在所有植株叶片中均观察到ros积累的增多，其中在rnai植株中的ros积累水平最高，而在oe植株中的积累最少。
35.4、非生物胁迫下不同白桦植株的细胞损伤情况
36.利用伊文思蓝(evans blue)染色检测nacl和mannitol胁迫条件下白桦叶片的细胞损伤程度，细胞损伤率与叶片染色程度正相关。染色结果如图5所示，在盐和渗透胁迫下，与mock植株叶片相比，rnai植株的染色最深，说明其叶片组织内细胞的损失率最高；oe植株的染色程度明显更弱，说明oe植株的细胞损伤率最低。该结果表明bprav1基因在白桦中的过量表达能够降低由非生物胁迫造成的细胞损伤。
37.5、非生物胁迫下不同白桦植株的生理生化指标分析
38.(1)超氧化物歧化酶(sod)活性测定
39.超氧化物歧化酶(sod)能够催化生物体内超氧阴离子自由基(o2‑
)发生歧化反应，从而减少过氧化物自由基对细胞膜系统的损伤，在植物抗逆反应中起着重要作用。为了研究非生物胁迫下白桦的氧化应激反应，测定了sod活性，结果如图6所示，在正常生长条件下，不同白桦植株的sod活性没有显著差异。在nacl和甘露醇处理下，所有植株的sod活性较正常生长条件下都有所升高，其中，oe植株的sod活性显著高于mock植株，而rnai植株的sod活性显著低于mock植株。该结果表明在非生物胁迫条件下，bprav1基因的过表达使得白桦
植株的sod活性升高，从而清除细胞内积累的活性氧，提高转基因白桦的抗逆性。
40.(2)过氧化物酶(pod)活性比较
41.过氧化物酶(pod)能够催化h2o2氧化酚类的反应，是清除植物体内氧自由基伤害的重要保护酶，与植物的抗逆能力密切相关。分别取非胁迫条件下和胁迫处理后的各白桦植株测定pod的活性。结果如图7所示，在非胁迫条件(control)下，各植株的pod活性大致相同；在nacl和mannitol胁迫条件下，各植株的pod活性较正常生长条件下有不同程度地升高，其中，oe植株的pod活性显著高于mock植株，而rnai植株的pod活性显著低于mock植株，说明过表达bprav1基因能够提高植株抵御逆境胁迫的能力。
42.6、非生物胁迫应答基因的表达量分析
43.分别提取未胁迫处理和胁迫处理后各白桦植株的rna，反转录为cdna，选取白桦的6个sod和8个pod基因进行实时荧光定量pcr，以每个基因在mock植株中的表达量为1，分析在这些基因在oe植株和rnai植株中的表达。结果如图8，在nacl和甘露醇处理条件下，与mock植株中的表达量相比，oe植株中sod和pod基因的表达显著上调，而在rnai植株中大部分的sod和pod基因显著下调表达，表明bprav1能够正向调控sod和pod基因的表达。
44.本发明利用bprav1蛋白含有一个ap2(44
‑
103aa)和一个b3(167
‑
261aa)结构域，具备rav转录因子的典型结构特征。bprav1基因受nacl和甘露醇胁迫处理诱导表达。通过瞬时转化方法使bprav1基因在白桦中过量表达或抑制表达，对转基因白桦苗在nacl或甘露醇胁迫下的生理生化染色、生理指标测定及胁迫应答基因表达量的研究发现，bprav1基因的表达水平与转基因白桦植株对胁迫的耐受性呈正相关，可见bprav1基因具有一定的抗逆功能，可用于培育抗旱耐盐转基因植物品种。
45.46.47.