尿苷-胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用的制作方法

1.本发明涉及尿苷-胞苷激酶突变体及其在生产胞苷酸方面的应用，属于酶工程和生物催化领域。


背景技术：

2.核苷酸主要参与构成核酸，且具有重要的生物学功能。核苷酸及其衍生物可广泛应用与农业生产、食品、医药等领域。化学法合成核苷酸通常以三氯氧磷为磷酸供体，将核苷直接磷酸化生产相应核苷酸。但此种化学法合成5
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胞苷酸时，需要在核糖的2’,3
’‑
羟基上加上保护基团，再进行磷酸化反应。化学法合成核苷酸操作步骤多、路线长、立体选择性差、试剂昂贵且试剂有毒、可操作性差、生产成本高，不适合大规模绿色生产。
3.核糖核酸(rna)降解也可以用于生产5
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胞苷酸，需要经分离纯化获得纯的5
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胞苷酸。该方法可以一次获得4种产物，但除了5
’‑
胞苷酸外，其他三种均为反应的副产物。同时，作为降解的原料(rna)也存在诸多限制，如rna的来源并不广泛，而且该降解rna生产5
’‑
胞苷酸工艺中的分离操作复杂，目标产物收率降低。
4.采用酶催化方法，以胞苷为底物生产胞苷酸，酶催化反应具有诸多优点，例如较为温和、对环境、设备及操作人员均无害。重组表达酶的菌株，经过细胞破壁后，离心分离上清液，采用含有粗酶液的细胞破壁上清液直接催化底物生产胞苷酸，减少了酶蛋白的纯化、分离等操作步骤，极大的简化了生产工艺，节约了生产成本。例如，记载于公开号为cn111269870a的发明专利中，采用重组大肠杆菌表达胞苷激酶，采用粗酶液催化底物胞苷及atp，转化生成胞苷酸的转化率可达85％。但其酶的催化效率没有达到足够高的水平，这将降低酶催化反应的效率，增加生产周期，通过蛋白质工程，因此，一种对酶蛋白进行分子改造，进而提高酶的催化效率的方法十分必要。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，采用定点突变技术对尿苷-胞苷激酶进行定点突变，提高尿苷-胞苷激酶的催化效率，并耦合乙酸激酶进行催化，高效催化5
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胞苷生产5
’‑
胞苷酸，可以高效生产5
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胞苷酸(5
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cmp)，促进其在医药等领域中的应用。
6.本发明提供了一种尿苷-胞苷激酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如seq id no.1所示的尿苷-胞苷激酶的第100位进行突变得到的。
7.在本发明的一种实施方式中，所述尿苷-胞苷激酶来源于大肠杆菌。
8.在本发明的一种实施方式中，编码所述尿苷-胞苷激酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.在本发明的一种实施方式中，所述突变体为：
10.将氨基酸序列如seq id no.1所示的尿苷-胞苷激酶的第100位的组氨酸突变为苯丙氨酸得到的，突变体命名为h100f；
11.或，将氨基酸序列如seq id no.1所示的尿苷-胞苷激酶的第100位的组氨酸突变
为酪氨酸得到的，突变体命名为h100y。
12.本发明还提供了编码上述尿苷-胞苷激酶突变体的基因。
13.本发明还提供了携带上述基因的重组载体。
14.在本发明的一种实施方式中，所述重组载体以pet22b质粒、pet28a质粒或prsfduet-1质粒为表达载体。
15.本发明还提供了携带上述基因，或上述重组载体的微生物细胞。
16.在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞以细菌或真菌为表达宿主。
17.本发明还提供了一种生产5
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胞苷酸(5
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cmp)的方法，所述方法为：将上述尿苷-胞苷激酶突变体，或上述微生物细胞添加至含有胞苷、磷酸盐、mg
2
、gtp、乙酸激酶的反应体系中，进行反应制备得到。
18.在本发明的一种实施方式中，所述乙酸激酶来源于保加利亚乳杆菌。
19.在本发明的一种实施方式中，所述乙酸激酶的氨基酸序列如seq id no.3所示。
20.在本发明的一种实施方式中，编码所述乙酸激酶的核苷酸序列如seq id no.4所示。
21.在本发明的一种实施方式中，反应体系中，胞苷添加的终浓度为40～100mm。
22.在本发明的一种实施方式中，反应体系中，磷酸盐添加的终浓度为10～100mm。
23.在本发明的一种实施方式中，所述磷酸盐为：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液或磷酸氢二钾/磷酸二氢钾缓冲液。
24.在本发明的一种实施方式中，反应体系中，mg
2
添加的终浓度为1～50mm。
25.在本发明的一种实施方式中，所述mg
2
为：mgcl2或mgso4。
26.在本发明的一种实施方式中，反应体系中，gtp添加的终浓度为0.1～6mm。
27.在本发明的一种实施方式中，反应体系中，尿苷-胞苷激酶突变体的添加量为1～10u/ml。
28.在本发明的一种实施方式中，反应体系中，乙酸激酶的添加量为1～10u/ml。
29.本发明还提供了上述尿苷-胞苷激酶突变体，或上述基因，或上述重组载体，或上述微生物细胞，或上述重组大肠杆菌在制备胞苷酸，或含有胞苷酸的产品中的应用。
30.在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
31.有益效果
32.(1)本发明通过采用定点突变技术对尿苷-胞苷激酶进行定点突变，提高尿苷-胞苷激酶的催化效率，酶突变体的催化效率最高提高至对照的1.7倍；采用相同的质粒prsfduet共表达基因udk和ack，混合后实现尿苷-胞苷激酶耦合乙酸激酶的高效催化，减少单一质粒表达尿苷-胞苷激酶后酶的用量。
33.(2)本发明的尿苷-胞苷激酶突变体可高效催化5
’‑
胞苷生产5
’‑
胞苷酸，可以高效生产5
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胞苷酸(5
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cmp)，转化效率可达98％以上。采用本发明获得的尿苷-胞苷激酶突变体，并耦合乙酸激酶后，可以高效生产5
’‑
胞苷酸，可促进其在医药等领域中的应用。
附图说明
34.图1：重组菌e.coli prsfduet-udk-ack和e.coli prsfduet-udk表达尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶的sds-page图。
35.图2：大肠杆菌来源的尿苷-胞苷激酶基因序列比对及其三级结构同源建模分析图。
36.图3：尿苷-胞苷激酶突变体h100f和h100y表达的sds-page图。
37.图4：尿苷-胞苷激酶催化胞苷产5
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胞苷酸的hplc图。
具体实施方式
38.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
39.下述实施例中所涉及的prsfduet质粒购自novagen。下述实施例中所涉及的胞苷、gtp购自默克sigma-aldrich，下述实施例中所涉及的mg
2
可为：mgcl2、mgso4中的任一种，本发明仅采用mgcl2，下述实施例中所涉及的磷酸盐可为：磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾中的任一种，本发明仅采用磷酸氢二钠/磷酸二氢钠。
40.下述实施例中所涉及的培养基如下：
41.lb液体培养基：胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeast extract)5g/l，氯化钠(nacl)10g/l。
42.tb液体培养基：将下列组分溶解在0.9l水中：蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml。各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/l kh2po4/0.72mol/l kh2po4的溶液(2.31g的kh2po4和12.54g kh2po4溶在足量的水中，使终体积为100ml)。
43.下述实施例中所涉及的检测方法如下：
44.尿苷-胞苷激酶酶活的检测：底物胞苷的浓度为45mm，磷酸盐浓度为30mm(ph 7.0)，mg
2
浓度为25mm，gtp浓度为2.5mm，尿苷-胞苷激酶3.5u/ml，乙酸激酶7.0u/ml，催化温度为30℃，酶活力单位定义为：在酶活力测定条件下，每分钟催化底物胞苷生产1μmol/l胞苷酸所需的酶量为一个酶活力单位，u。
45.乙酸激酶酶活的检测：以4mm gdp和15mm acp为底物，加入0.1ml乙酸激酶和25mm mg
2
、磷酸盐缓冲液，37℃反应5min，取20μl反应液加入去离子水至1ml，沸水浴2min终止反应，将稀释后的反应液用hplc测定成分，计算酶活力，酶活力单位定义为：酶催化底物，每分钟生产1μmol产物所需的酶量，为一个酶活力单位，u。
46.kcat和km值的测定：
47.采用与乙酸激酶偶联的方法测定，kcat和km值是通过使用nadh依赖型酶偶联测定。温度为30℃，胞苷浓度为30-320μm，mg
2
浓度为25mm，gtp浓度为2.5mm，磷酸盐浓度为30mm(ph 7.0)。
48.催化生产5
’‑
胞苷酸(5
’‑
cmp)方法为：其底物胞苷的浓度为45mm，磷酸盐浓度为30mm(ph 7.0)，mg
2
浓度为25mm，gtp浓度为2.5mm，尿苷-胞苷激酶1ml，乙酸激酶1ml，催化温度为30℃，时间为：2-3h。
49.胞苷酸含量的检测方法：液相色谱仪岛津10a，色谱柱：inertsil ods-sp 5μm 4.6*250mm，流动相：缓冲液配制：0.1mol/l磷酸二氢钾水溶液：0.01mol/l的四丁基氢氧化铵：甲醇＝95：95：10，然后磷酸调节ph至4.5，波长：276nm，流速：1.0ml/min。
[0050]5’‑
胞苷酸转化率的计算方法：实际生成5
’‑
胞苷酸的量*100％/理论生成5
’‑
胞苷酸的量。
[0051]
实施例1：尿苷-胞苷激酶野生酶和乙酸激酶的制备
[0052]
具体步骤如下：
[0053]
(1)本实施例采用分子生物学手段，设计引物pcr扩增e.coli来源的尿苷-胞苷激酶基因udk(核苷酸序列如seq id no.2所示，其中大肠杆菌来源的尿苷-胞苷激酶基因序列比对及其三级结构同源建模分析如图2所示)和保加利亚乳杆菌来源的乙酸激酶基因ack(核苷酸序列如seq id no.4所示)，采用质粒prsfduet共表达；同时，采用质粒prsfduet表达尿苷-胞苷激酶基因udk。
[0054]
具体引物：
[0055]
ec-udk-fw：catgccatgggcactgatcagtctcatcagtg；
[0056]
ec-udk-rs：cgggatccttattcaaagaactgactta；
[0057]
lb-ack-fw：ggaattccatatggacaagattttagcaatcaa；
[0058]
lb-ack-rs：ggggtaccttacttaagcttggccaaac。
[0059]
pcr扩增的条件：预变性98℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃(酶的延伸速度为1kb/min，具体时间根据扩增片段的长度来设置)；设置循环30次；再延伸72℃，10min；最后16℃保温。pcr扩增的体系：5
×
ps buffer 20μl，dntp 10μl，上游/下游引物(10μmol
·
l-1)2μl，模板1μl，酶1μl，水66μl。
[0060]
(2)尿苷-胞苷激酶基因udk采用酶切位点nco i和bamh i连接在质粒prsfduet上获得重组质粒prsfduet-udk；
[0061]
乙酸激酶基因ack采用酶切位点nde i和kpn i连接在质粒prsfduet-udk上获得重组质粒prsfduet-udk-ack。同时将该序列送至测序公司测序验证正确。
[0062]
分别构建获得含有尿苷-胞苷激酶基因udk的重组质粒prsfduet-udk；
[0063]
及同时含有尿苷-胞苷激酶基因udk和乙酸激酶基因ack的重组质粒prsfduet-udk-ack。
[0064]
(3)分别将重组质粒prsfduet-udk、prsfduet-udk-ack导入大肠杆菌bl21(de3)中，制备得到可同时表达尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶的重组菌e.coli prsfduet-udk-ack；及表达尿苷-胞苷激酶的重组菌e.coli prsfduet-udk。
[0065]
(4)分别将步骤(3)制备得到重组菌e.coli prsfduet-udk-ack、e.coli prsfduet-udk接种至lb液体培养基中，在37℃和200rpm条件下培养10h，制备得到种子液，将上述种子液按照1％(v/v)的接种量接种至tb液体培养基中，在37℃发酵培养至od600＝0.8时，添加终浓度为0.5mm的诱导剂iptg 0.5ml，在25℃诱导发酵36h，制备得到发酵液。
[0066]
将发酵液离心，获得菌体细胞，采用超声破碎方法破壁菌体细胞。将破壁后的菌体细胞离心后，取破壁细胞上清液进行琼脂糖-凝胶电泳分析，由图1可知，结果显示，在重组菌e.coli prsfduet-udk-ack的发酵液中成功表达尿苷-胞苷激酶和乙酸激酶；在重组菌e.coli prsfduet-udk的发酵液中成功表达尿苷-胞苷激酶。
[0067]
分别制备得到含有udk-ack的粗酶液和含有udk的粗酶液。
[0068]
实施例2：尿苷-胞苷激酶突变体的制备
[0069]
具体步骤如下：
[0070]
(1)以实施例1制备得到的含有尿苷-胞苷激酶基因udk的重组质粒prsfduet-udk为模板，采用引物h100f_fw:cagctatgttgaattcacgcgtatgaaag和h100f_rs:
ctttcatacgcgtgaattcaacatagctg，进行pcr扩增，获得含有udk突变体h100f基因的重组质粒prsfduet-h100f。
[0071]
pcr扩增的条件：预变性98℃，5min；变性95℃，30s；退火55℃，30s；延伸72℃，1min；设置循环29次；再延伸72℃，10min；最后16℃保温。pcr扩增的体系：5
×
ps buffer 20μl，dntp 10μl，上游/下游引物(10μmol
·
l-1)2μl，模板1μl，酶1μl，水66μl。利用pcr获得重组质粒prsfduet-h100f，转化大肠杆菌jm109，涂布lb平板筛选获得阳性克隆，提取质粒进行基因测序验证正确。
[0072]
(2)将构建获得的重组质粒prsfduet-h100f转化大肠杆菌e.coli bl21(de3)，获得可以表达突变体h100f的重组菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-h100f。
[0073]
(3)将突变体基因h100f采用酶切位点nco i和bamh i连接在实施例1制备得到的重组质粒prsfduet-ack上，获得重组质粒prsfduet-h100f-ack。将构建获得的重组质粒prsfduet-h100f-ack转化大肠杆菌bl21(de3)，获得可以共表达突变体h100f和乙酸激酶的重组菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-h100f-ack。
[0074]
(4)采用(1)～(3)的方法，构建获得含突变体h100y的重组质粒prsfduet-h100y和prsfduet-h100y-ack，同时构建获得重组菌e.coli bl21(de3)/prsfduet-h100y-ack和e.coli bl21(de3)/prsfduet-h100y；所涉及的引物如下：
[0075]
h100y_fw:cagctatgttgaatacacgcgtatgaaag，
[0076]
h100y_rs:ctttcatacgcgtgtattcaacatagctg。
[0077]
(5)分别将步骤(3)～(4)制备得到重组菌接种至lb液体培养基中，在30℃和200rpm条件下培养10h，分别制备得到种子液；
[0078]
分别将上述种子液按照1％(v/v)的接种量接种至tb液体培养基中，在37℃发酵培养至od600＝0.8时，添加终浓度为0.5mm的诱导剂iptg 0.5ml，在25℃诱导发酵36h，制备得到发酵液；
[0079]
将发酵液离心，获得菌体细胞，采用超声破碎方法破壁菌体细胞。将破壁后的菌体细胞离心后，取破壁细胞上清液进行琼脂糖-凝胶电泳分析，结果如图3所示，由图3可知，结果显示，尿苷-胞苷激酶突变体得到了表达。
[0080]
分别制备得到含有h100y-ack的粗酶液，含有h100y的粗酶液，含有h100 f的粗酶液，含有h100f-ack的粗酶液。
[0081]
分别检测上述制备得到的野生酶wt粗酶液及突变体粗酶液的酶活，其中，经检测，乙酸激酶酶活力为15u/ml；尿苷-胞苷激酶野生酶wt粗酶液及突变体酶活力的结果如表1所示：
[0082]
表1粗酶液的酶活力
[0083]
[0084]
实施例3：尿苷-胞苷激酶突变体催化效率
[0085]
分别采用含有野生型udk-ack的粗酶液，含有突变体h100y-ack的粗酶液，含有突变体h100f-ack的粗酶液催化胞苷生产5
’‑
胞苷酸，分别检测尿苷-胞苷激酶的动力学参数，结果如表2及图4所示。
[0086]
表2尿苷-胞苷激酶及其突变体h100f和h100y的动力学参数
[0087]
参数kcat(s-1
)km(μm)kcat/km(m-1
s-1
)wt7.32303.2*104h100f7.21335.5*104h100y3.5913.8*104[0088]
经测定：
[0089]
野生型的尿苷-胞苷激酶的动力学参数分别为kcat值为7.3s-1
，km值为230μm，kcat/km值为3.2*104m-1
·
s-1
。
[0090]
尿苷-胞苷激酶突变体h100f的动力学参数：kcat值为7.2s-1
，km值为133μm，kcat/km值为5.5*104m-1
·
s-1
；
[0091]
尿苷-胞苷激酶突变体h100y的动力学参数：kcat值为3.5s-1
，km值为91μm，kcat/km值为3.8*104m-1
·
s-1
。
[0092]
由hplc图可知(图4)，催化3h时，已经产生了大量的5
’‑
胞苷酸，突变体h100f的5
’‑
胞苷酸转化率可达97.5％，证明异源表达获得的催化体系，催化效率较高。
[0093]
由此可以看出，尿苷-胞苷激酶突变体h100f和h100y的催化效率均显著提高，说明该突变方式对提高尿苷-胞苷激酶的催化效率具有促进作用。
[0094]
实施例4：胞苷酸的制备
[0095]
利用尿苷-胞苷激酶突变体h100f和h100y制备胞苷酸，具体步骤如下：
[0096]
(1)反应体系(5ml)：
[0097]
向含有30mm(ph 7.0)的磷酸盐溶液中，分别添加终浓度为45mm的胞苷，终浓度为25mm的mg
2
，终浓度为2.5mm的gtp，得到反应体系；
[0098]
(2)分别向上述反应体系中添加1ml实施例2制备得到的udk-ack的粗酶液，h100y-ack的粗酶液，h100f-ack的粗酶液，在如下条件下进行催化胞苷生产得到胞苷酸：底物胞苷的浓度为45mm，磷酸盐浓度为30mm(ph 7.0)，mg
2
浓度为25mm，gtp浓度为2.5mm，尿苷-胞苷激酶1ml，乙酸激酶1ml，催化温度为30℃，时间为：2.5h，检测结果如表3所示：
[0099]
表3尿苷-胞苷激酶催化胞苷产胞苷酸
[0100]
参数5
’‑
胞苷酸转化率(％)wt96h100f98h100y98
[0101]
结果显示，催化2.5h时，产生了大量的5
’‑
胞苷酸，尿苷-胞苷激酶突变体h100f和h100y的5
’‑
胞苷酸转化率可达98.0％，证明尿苷-胞苷激酶突变体h100f和h100y及其催化体系，具有高效的5
’‑
胞苷酸转化率。
[0102]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范
围应该以权利要求书所界定的为准。