PERK在预防或治疗雌性生殖功能紊乱或卵巢病变中的应用

perk在预防或治疗雌性生殖功能紊乱或卵巢病变中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及perk在预防或治疗雌性生殖功能紊乱或卵巢病变中的应用。


背景技术：

2.环境温度的改变能够影响正常机体的生理功能，寒冷作为一种重要的环境因素可以引发机体多个系统的损伤，对人们的健康造成严重的威胁。暴露于寒冷的环境被广泛认为是人类健康的全球性挑战，探讨减少寒冷应激对机体影响的措施具有十分重要的意义。鉴于人体对寒冷的适应能力不如适应高温的能力强(v klenerov
á
,jana juroviov
á
,kaminsky o,et al.combined restraint and cold stress in rats:effects on memory processing in passive avoidance task and on plasma levels of acth and corticosterone[j].behavioural brain research,2003,142(1-2):143-149.)，寒冷损伤和适应历来受到医学界高度重视。
[0003]
有研究表明，寒冷环境会对生殖系统造成影响。慢性冷应激时，卵巢内神经营养因子介导的交感神经激活，导致卵泡发育变化而引起生殖功能损伤。同时实验证实，低温对精子发生和精子活力有迅速干扰作用，大鼠致冷后睾丸内氧的活力显著降低，睾丸组织缺氧，对蛋白质和酶的合成与活性均有影响，从而影响精子的形成和成熟，增强了生殖细胞膜脂质的过氧化反应，损害生殖细胞并导致其凋亡增加。目前寒冷损伤的治疗和预防措施仍不完善，运用分子生物学技术阐明寒冷损伤的分子机制，研究与寒冷损伤密切相关的基因，并进一步探索相应的防治方法，对提高寒冷环境工作人员的生殖健康保健具有重要意义。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的是提供一种预防或治疗雌性生殖功能紊乱或卵巢病变的新方法，为实现该目的，本发明采用了如下技术方案：
[0005]
本发明第一方面提供了一种可用于预防或治疗雌性生殖功能紊乱或卵巢病变的抑制剂，所述的抑制剂为perk的抑制剂。
[0006]
本发明中所述的“预防”表示防止有患病风险的对象中的疾病的出现或者已消失的疾病的复发。
[0007]
术语“治疗”是指在显著程度上改善本文提及的疾病或病症或伴随其的症状。
[0008]
进一步，所述的抑制剂包括核酸抑制剂，蛋白抑制剂，蛋白水解酶，蛋白结合分子。
[0009]
在本文中，除非另有说明，否则术语“包含”、“包括”和“含有”为开放式表述，意味着除所列出的要素、组分和步骤外，还可涵盖其它未指明的要素、组分和步骤。
[0010]
进一步，所述的抑制剂为核酸抑制剂。
[0011]
进一步，所述的核酸抑制剂包括反义寡核苷酸、sirna、mirna、核酶。
[0012]
术语“反义寡核苷酸”是指进行了某些化学修饰的短链核酸(由约15-25个核苷酸组成)，它的碱基顺序排列与特定的靶标序列互补，进入细胞后可按照watson-crick碱基互
补配对的原则与靶标序列形成双链结构。
[0013]
本发明中，“互补”指的是，两个核苷酸在杂交条件下能够配对，例如，腺嘌呤(a)和胸腺嘧啶(t)或尿嘧啶(u)之间的关系，以及胞嘧啶(c)和鸟嘌呤(g)之间的关系。
[0014]
术语“核酶”是指具有催化特定生物化学反应的功能的rna分子。
[0015]
术语“sirna”是指能够抑制靶基因表达、包括正义rna片段区域和反义rna片段区域的核糖核酸(rna)。
[0016]
术语“mirna”是指真核生物中广泛存在的一种长约21到23个核苷酸的核糖核酸(rna)分子，可调节其他基因的表达。
[0017]
在本发明中，反义寡核苷酸、核酶、sirna或mirna可被设计成靶向目的基因或者调节序列，例如需要抑制其表达的基因或其调控序列，以便抑制或降低其表达。所针对的基因或其调控序列可以是需要抑制或降低其表达的任何基因或其调控序列，例如来自病原体的、或者参与疾病形成和发展的那些，特别是靶向perk。本发明的反义寡核苷酸、核酶、sirna或mirna可按照常规方法设计。
[0018]
sirna的常规设计方法可参考文献(如：reynoldsa等，自然生物技术，2004年，22卷：326-330)或amhion、qiagen等公司网站的公开资料。mirna的常规设计方法可参考文献(lo hl等，基因治疗，2007年，14卷：1503-1512页)，选择靶序列的方法与sirna的设计方法相似，例如可将设计的含有靶序列的正义链及相应的反义链替换到pri-microrna上，使构建的mirna可阻止含有靶序列的mrna的表达。核酶的常规设计方法可参考文献(haseloff j等，自然，1988年，334卷：585-591页)，例如可将与靶序列的前后序列互补的核苷酸序列分别置于核酶保守性核心的序列(如锤头结构)前后，使构建的核酶能在靶序列处切割含有靶序列的核酸。反义寡核苷酸的常规设计方法可参考文献(matveeva ov等，核酸研究，2003年，31卷：4989-4994页)。
[0019]
术语“正义链”指的是，具有和基因编码链相同的序列的核苷酸链。
[0020]
术语“反义链”是指sirna的这样一条链，所述链包含与靶序列完全或基本互补的区域。其中，术语“互补区域”是指反义链上与靶mrna序列完全或基本互补的区域。在互补区域与靶序列不完全互补的情况下，错配可以位于分子的内部或末端区域中。通常，最耐受的错配位于末端区域中，例如，在5’和/或3’端的5、4、3、2或1个核苷酸内。对错配最敏感的反义链部分被称为“种子区”。
[0021]
本发明的反义寡核苷酸、核酶、sirna或mirna包括对构成反义寡核苷酸、核酶、sirna或mirna的磷酸骨架和/或核糖和/或碱基等构成部分进行化学修饰的修饰产物，修饰方法是本领域已知的，适合于本发明的修饰可选自包括下列的组：锁核酸(lna)、非锁核酸(una)、2
′‑
甲氧基乙基、2
′‑
o-烷基、2
′‑
o-甲基、2
′‑
o-烯丙基、2
′‑
c-烯丙基、2
′‑
氟、2
′‑
脱氧、2
′‑
羟基、磷酸骨架、荧光探针、配体修饰或其组合。
[0022]
进一步，所述的核酸抑制剂为sirna。
[0023]
进一步，所述的sirna的序列如seq id no.1所示。
[0024]
进一步，所述的抑制剂为gsk2606414或其立体异构体、药学上可接受的盐、溶剂化物或其水合物。
[0025]
本发明第二方面提供了一种药物组合物，所述的药物组合物包含本发明第一方面所述的抑制剂和药学上可接受的载体。
[0026]“药学可接受的”意指不降低活性成分的无毒性材料。
[0027]
进一步，所述的药学上可接受的载体包括稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。
[0028]
本发明第三方面提供了如下任一项所述的应用：
[0029]
(1)本发明第一方面所述的抑制剂、或本发明第二方面所述的药物组合物在制备预防或治疗雌性生殖功能紊乱的药物中的应用；
[0030]
(2)本发明第一方面所述的抑制剂、或本发明第二方面所述的药物组合物在制备预防或治疗卵巢病变的药物中的应用；
[0031]
(3)检测样本中cx43的表达水平的试剂在制备诊断雌性生殖功能紊乱的产品中的应用；
[0032]
(4)检测样本中cx43的表达水平的试剂在制备诊断卵巢病变的产品中的应用。
[0033]
进一步，所述的雌性生殖功能紊乱为寒冷应激导致的雌性生殖功能紊乱，优选的，所述的雌性生殖功能紊乱包括生殖周期紊乱。
[0034]
进一步，所述的卵巢病变为寒冷应激导致的卵巢病变，优选的，所述的卵巢病变包括卵泡闭锁。
[0035]
进一步，所述的试剂包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中cx43的表达水平的试剂。
[0036]
进一步，所述的试剂包括对cx43具有特异性的引物、探针、抗体。
[0037]
如本文所用的术语“引物”是指具有游离的3
′
羟基基团的短核酸链，其与互补模板形成碱基对，以便作为产生新模板链的起点。除引物外，dna合成或复制需要合适的缓冲液、适当的温度、聚合酶(dna聚合酶或逆转录酶)和4种三磷酸核苷酸。在本发明中，对crx多核苷酸具有特异性的有义和反义引物可以用于pcr扩增，以便用pcr产物诊断雌性生殖功能紊乱或卵巢病变。根据本领域的已知信息，可以适当改变所述有义和反义引物的长度。
[0038]
如本文所用的术语“探针”意指诸如rna或dna的核苷酸序列的片段，其长度范围从短至1个碱基至长至数百个碱基，其可以与目的mrna特异性地结合并且用标签进行标记用于检测所述目的mrna。本发明中有用的探针可以构建为寡核苷酸探针、单链dna探针、双链dna探针或rna探针的形式。在本发明的实施方案中，通过测定与本发明的crx多核苷酸互补的探针是否与目的核苷酸序列杂交，可以实现雌性生殖功能紊乱或卵巢病变的诊断。按照本领域已知的信息可以更改合适的探针和杂交条件的选择。
[0039]
本发明中有用的引物或探针可以使用亚磷酰胺固相载体法或其他熟知技术化学合成。使用本领域已知的各种手段可以修饰它们的核苷酸序列。修饰的示例性、非限制性实例包括甲基化、加帽、用一个或多个同系物取代天然核苷酸和核苷酸之间的改变，例如不带电荷的连接物(例如甲基磷酸、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电荷的连接物(例如磷硫酰，二硫代磷酸酯等)。
[0040]
术语“抗体”描述了一类免疫球蛋白分子，以及在本发明中以其最广泛的含义进行使用。抗体特异性地包括单克隆抗体、多克隆抗体、完整抗体和抗体片段。抗体包含至少一个抗原结合结构域。抗原结合结构域包括通过vh-v l二聚体形成的抗原结合结构域。所述vh和v l区可以进一步细分为高变区(“高变区(hvrs)”，也称为“互补决定区”(cdrs))，所述
高变区散布着更保守的区域。所述更保守的区域称为框架区域(fr)。每个v h和v l通常包含三个cdr和四个fr，按以下顺序进行排列(从n端到c端)：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。所述cdr参与抗原结合，并赋予抗原特异性和结合亲和力给所述抗体。来自任何脊椎动物物种的所述轻链，基于恒定结构域的序列可以分配为两种类型中的一种，所述两种类型称为κ和λ。来自任何脊椎动物物种的所述重链，可以指定为五种不同类别(或亚型)的一种：iga、igd、ige、igg和igm。这些类别也分别指定为α、δ、ε、γ和μ。基于序列和功能上的差异，所述igg和iga类进一步分为子类。人类表达以下子类：igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。
[0041]
进一步，所述的产品包括试剂盒、芯片、核酸膜条。
[0042]
术语“样品”或“样本”指从受试者获得的相似细胞的集合。组织或细胞样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、分泌物、腹膜液(腹水)或间隙液；来自受试者任何时间的细胞。组织样品可能包含在自然界中天然不与组织混杂的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素等等。本文中受试者样品的例子包括但不限于，血清或血浆、循环中的血浆蛋白质、腹水、患者原代细胞培养物或细胞系、以及保存的组织样品，诸如福尔马林固定的、石蜡包埋的组织样品或冷冻的组织样品。在优选的实施方案中，所述样品为血液或组织。
[0043]
如本文所指的“受试者”优选为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于家养动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物诸如猴)、兔和啮齿类动物(例如小鼠和大鼠)。
[0044]
本发明所述药物可根据需要制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。所述药物组合物可以是任何剂型，并以任何方式施用。所述剂型包括按常规方法制成溶液、混悬液、乳剂、浸膏、酏剂、粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊等。所述使用方式包括口服或肠胃外方式而给予，其中所述肠胃外方式为静脉注射、肌肉注射、腹腔注射或皮下注射等。
[0045]
本发明第四方面提供了一种筛选预防或治疗雌性生殖功能紊乱或卵巢病变的候选药物的方法：
[0046]
(1)在测试组中，向待测对象施用测试化合物，检测测试组中来源于所述对象的样品中perk的表达水平v1；在对照组中，向待测对象施用空白对照，检测对照组中来源于所述对象的样品中perk的表达水平v2；
[0047]
(2)比较上一步骤检测得到的表达水平v1和表达水平v2，从而确定所述测试化合物是否是预防或治疗雌性生殖功能紊乱或卵巢病变的候选化合物。
[0048]
进一步，所述的雌性生殖功能紊乱为寒冷应激导致的雌性生殖功能紊乱。
[0049]
进一步，所述的雌性生殖功能紊乱包括生殖周期紊乱。
[0050]
进一步，所述的卵巢病变为寒冷应激导致的卵巢病变。
[0051]
进一步，所述的卵巢病变包括卵泡闭锁。
附图说明
[0052]
图1是寒冷暴露对雌性小鼠生殖周期的影响结果图，其中，图a是正常对照组和寒冷暴露组雌性小鼠的生殖周期分布图(每组动物各显示一只小鼠的代表性结果)，图b是正
常对照组和寒冷暴露组雌性小鼠的生殖周期长度统计图(n＝6，p《0.0001)；
[0053]
图2是寒冷暴露对卵泡发育的影响结果图，其中，图a是he染色检测正常对照组和寒冷暴露组雌性小鼠卵巢组织形态学变化结果图(200
×
)，图b是正常对照组和寒冷暴露组雌性小鼠卵巢中闭锁卵泡百分比率(闭锁卵泡数/总卵泡数
×
100％)统计图(n＝20，p《0.01)；
[0054]
图3是寒冷暴露雌性小鼠卵巢组织和颗粒细胞中cx43表达水平结果图，其中，图a是寒冷暴露后雌性小鼠卵巢组织间隙连接蛋白cx43的表达水平检测结果(n＝6)，图b是cx43蛋白表达水平的定量分析结果(n＝6，p《0.05)，图c是寒冷暴露后雌性小鼠卵巢组织cx43 mrna表达水平检测结果(n＝6，p《0.05)，图d是原代颗粒细胞寒冷暴露12h前后cx43蛋白和mrna表达水平检测结果；
[0055]
图4是寒冷暴露诱导小鼠卵巢组织perk/nrf2途径活化结果图，其中，图a是小鼠cx43基因的启动区存在转录因子nrf2、ap-1、stat、myod潜在结合位点的示意图，图b是寒冷暴露后雌性小鼠卵巢组织nrf2、c-jun、stat3以及myod蛋白表达及活化水平检测结果图(n＝6)，图c是nrf2活化表达水平的定量分析结果图(n＝6，p《0.01)，图d是寒冷暴露后雌性小鼠卵巢组织perk活化表达水平检测结果图(n＝6)，图e是perk活化水平的定量分析结果图(n＝6，p《0.05)；
[0056]
图5是抑制perk/nrf2途径活化显著下调原代颗粒细胞中cx43的诱导表达反应的实验结果图，其中，图a是低温暴露诱导原代颗粒细胞中perk/nrf2途径活化的结果图，图b是抑制原代颗粒细胞中nrf2表达显著下调cx43的转录诱导表达反应的结果图，图c是抑制原代颗粒细胞中perk表达显著下调cx43的诱导表达反应的结果图，图d是抑制原代颗粒细胞中perk活性显著下调cx43的诱导表达反应的结果图；
[0057]
图6是perk sirna拮抗寒冷暴露对雌性小鼠生殖周期的影响实验结果图，图a是正常对照组和perk sirna及其溶剂对照预处理组雌性小鼠经寒冷暴露后的生殖周期分布图，图b是正常对照组和perk sirna及其溶剂对照预处理组雌性小鼠经寒冷暴露后的生殖周期长度对比结果(n＝6，p《0.001)；
[0058]
图7是perk sirna拮抗寒冷暴露对卵泡发育的影响实验结果图，其中，图a是he染色检测正常对照组、perk sirna及其溶剂预处理组雌性小鼠经寒冷暴露前后的卵巢组织形态学变化结果图(200
×
)；图b是正常对照组、perk sirna及其溶剂预处理组雌性小鼠经寒冷暴露前后的卵巢闭锁卵泡百分比率统计结果(n＝6，p《0.001)。
具体实施方式
[0059]
本发明经过研究发现，寒冷暴露会影响雌性小鼠生殖周期、卵巢内卵泡发育，与对照组小鼠相比，寒冷暴露小鼠的cx43表达水平显著上调，进一步的，本发明还发现，抑制perk的表达或活化水平可显著拮抗寒冷暴露诱导的生殖周期紊乱效应和卵泡发育异常效应，说明perk可作为预防或治疗雌性生殖功能紊乱或卵巢病变的靶标，在此基础上完成了本发明。
[0060]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0061]
实施例1寒冷暴露对生殖周期、卵巢内卵泡发育的影响
[0062]
采用8周龄未交配雌性小鼠建立间歇性冷暴露实验动物模型(10:00-14:00，每天持续暴露于4℃4小时，连续3天)，其余时间模型小鼠与对照组小鼠同样在正常温度(22℃)环境下饲养，自由饮食饮水。
[0063]
在实验组小鼠连续间歇性冷暴露3天后，于第四日开始采用阴道细胞学涂片法检测对照组和实验组小鼠的动物周期变化，根据涂片细胞形态、种类、数量确定动情间期、动情前期、动情期和动情后期；连续监测3周。
[0064]
结果发现：对照组小鼠平均动情周期5.13
±
0.24天，冷暴露后动情周期延长至9.66
±
0.80天(图1a-1b，p《0.0001)。此结果说明：寒冷暴露可导致雌性小鼠生殖周期紊乱。
[0065]
在实验组小鼠连续间歇性冷暴露3天后，于第四日早7：00取对照组和寒冷暴露组雌性小鼠一侧卵巢的最大截面制作组织切片进行he染色观察，统计每张切片上的卵泡总数和闭锁卵泡数，计算卵泡闭锁百分率。
[0066]
结果发现：与对照组小鼠相比，寒冷暴露后小鼠卵巢中闭锁卵泡百分率显著增加(图2a-2b，p《0.01)。此结果说明：寒冷暴露可引发卵巢内卵泡发育异常，闭锁卵泡比率增加可能是造成寒冷诱发生殖功能异常变化的关键贡献因素。
[0067]
实施例2寒冷暴露后卵巢组织cx43表达水平变化
[0068]
鉴于间隙连接蛋白cx43在调节卵泡发育成熟过程中具有关键作用，本发明检测了寒冷暴露后卵巢组织cx43表达水平变化情况。
[0069]
结果发现：与对照组小鼠相比，寒冷暴露小鼠卵巢组织cx43表达水平显著上调(图3a-3b，p《0.05)。同时，本发明又检测了间隙连接蛋白cx43 mrna的表达水平。结果显示：寒冷暴露后cx43 mrna的表达水平也同步上调(图3c，p《0.05)。上述结果说明：寒冷暴露可显著影响卵巢组织中间隙蛋白cx43的表达水平。
[0070]
由于间隙连接蛋白cx43在颗粒细胞中高丰度表达，因此本发明分离培养了原代颗粒细胞，并将它们分别置于正常温度(37℃)和低温(35℃)条件培养12h，结果发现寒冷暴露后原代颗粒细胞中的cx43蛋白及mrna表达水平也显著上调(图3d)。上述结果说明：寒冷暴露后卵巢组织cx43的表达水平变化源于颗粒细胞中的异常表达。
[0071]
为了对cx43的异常表达进行有效控制，本发明尝试揭示cx43表达水平上调的可能途径。本发明对小鼠cx43基因的启动子区进行了分析，采用alggen-promo软件预测可能存在的潜在转录因子结合位点。
[0072]
结果发现：小鼠cx43基因启动子区近端存在有nrf2、ap-1、stat3以及myod的潜在结合位点(图4a)。
[0073]
因此本发明检测了对照组和实验组小鼠卵巢组织中上述各转录因子的活化及表达水平。
[0074]
结果发现：寒冷暴露能够诱导卵巢组织nrf2显著活化(图4b-4c，p《0.01)；而同样条件下，ap-1组成亚基c-jun、stat3活化水平以及myod表达水平无明显改变(图4b)。
[0075]
以上结果说明：nrf2可能影响卵巢组织中cx43表达水平。
[0076]
实施例3寒冷暴露对卵巢组织中perk的表达及活化水平的影响
[0077]
本发明检测了小鼠模型卵巢组织中perk的表达及活化水平。
[0078]
结果发现：寒冷暴露能够诱导卵巢组织中perk显著活化(图4d-4e，p《0.05)，提示
perk可能通过调控下游分子nrf2进而影响cx43的诱导表达。
[0079]
随后，本发明又将原代颗粒细胞分别置于正常温度(37℃)和低温(35℃)条件培养12h后检测perk/nrf2途径活化情况。
[0080]
结果发现：原代颗粒细胞经35℃暴露后可出现perk和nrf2的显著诱导活化(图5a)。
[0081]
以上结果说明：低温暴露诱导原代颗粒细胞中perk/nrf2途径显著活化，与寒冷应激动物卵巢组织内结果一致。
[0082]
为了进一步确定perk/nrf2途径活化在寒冷暴露诱导cx43表达上调反应中的作用和贡献，本发明在原代颗粒细胞中转染nrf2 sirna并进行低温暴露。
[0083]
结果发现，抑制nrf2表达可导致cx43的诱导表达反应显著下调(图5b)
[0084]
为了进一步证实上述结论，本发明又分析了转染nrf2 sirna前后cx43基因转录情况。结果显示：低温暴露后cx43转录诱导表达反应被明显抑制(图5b)，以上结果提示了nrf2能够在转录水平介导寒冷应激诱导的cx43基因表达异常上调反应。
[0085]
进而，本发明在原代颗粒细胞中转染perk sirna(ccacagacatcattgaaaa，seq id no.1)。结果显示，抑制perk的表达水平，nrf2的诱导活化和cx43的诱导表达反应显著下调(图5c)。同时，本发明在原代颗粒细胞采用perk抑制剂gsk2606414阻断perk的寒冷诱导活化反应。
[0086]
结果发现，抑制perk激酶的活性，nrf2的诱导活化和cx43的诱导表达反应也同步下调(图5d)。
[0087]
以上结果说明：perk/nrf2信号途径活化介导寒冷暴露诱导原代颗粒细胞中cx43异常表达。控制上述途径活化预期可拮抗由cx43异常变化导致的卵泡发育异常和生殖功能紊乱效应。
[0088]
进而，本发明分析了perk/nrf2/cx43信号途径异常活化在介导寒冷暴露诱导雌性小鼠生殖功能紊乱效应中的作用。本发明在实验组小鼠进行寒冷暴露前1天开始腹腔给予perk sirna或其溶剂预处理，共连续处理4天。结果发现：溶剂对照组雌性小鼠经冷应激后的动情周期约为7.47
±
1.11天，而perk sirna处理组雌性小鼠的动情周期为5.25
±
0.25天，与未应激正常对照组雌性小鼠的动情周期长度(5.13
±
0.24天)基本一致(图6a-6b，p《0.001，n＝6)。上述结果说明：perk sirna可显著拮抗寒冷暴露诱导的生殖周期紊乱效应。
[0089]
最后，本发明分析了上述各组小鼠的卵泡闭锁百分率。结果发现：溶剂对照组雌性小鼠经冷应激后的卵泡闭锁百分率为70.80
±
5.04％，而perk sirna处理组雌性小鼠的卵泡闭锁百分率为49.35
±
4.20％，与未应激正常对照组雌性小鼠的卵泡闭锁百分率(44.03
±
7.22％)基本一致(图7a-7b，p《0.001，n＝6)。
[0090]
上述结果说明：perk sirna可显著拮抗寒冷暴露诱导的卵泡发育异常效应。
[0091]
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。