一种幽门螺旋杆菌单克隆抗体及其应用的制作方法

1.本发明属于疫病诊断技术领域，具体涉及一种幽门螺旋杆菌单克隆抗体及其应用。


背景技术：

2.幽门螺旋杆菌(helicobacter pylori，hp)是一种螺旋形、微厌氧、对生长条件要求十分苛刻的细菌。1983年首次从慢性活动性胃炎患者的胃黏膜活检组织中分离成功，是目前所知能够在人胃中生存的唯一微生物种类。2017年10月27日，世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物清单初步整理参考，幽门螺旋杆菌(感染)在一类致癌物清单中。幽门螺旋杆菌病包括由幽门螺旋杆菌感染引起的胃炎、消化道溃疡、淋巴增生性胃淋巴瘤等。幽门螺旋杆菌病的不良后果是胃癌。
3.幽门螺旋杆菌是一种革兰氏阴性菌，主要分布在猕猴、大鼠、猪、犬等动物的胃粘膜组织中，67％-80％的胃溃疡和95％的十二指肠溃疡是由幽门螺旋杆菌引起的。慢性胃炎和消化道溃疡患者的普遍症状为：食后上腹部饱胀、不适或疼痛，常伴有其它不良症状，如嗳气、腹胀、反酸和食欲减退等。有些还可出现反复发作性剧烈腹痛、上消化道少量出血等。幽门螺旋杆菌病是后天传染的。其传播方式还不十分明确，但最可能的途径是口-口、粪-口、宠-人传播，已有以下实验可以证明：1.利用pcr从唾液、牙斑和粪便中检出幽门螺旋杆菌的dna；2.从牙斑和粪便中分离出幽门螺旋杆菌；3.从同一居住地的宠物排泄物中分离出相同的幽门螺旋杆菌菌株。
4.幽门螺旋杆菌感染检测有许多方法，如活组织镜检、幽门螺旋杆菌的分离培养、快速尿素酶试验、尿素呼气试验、尿氨排出试验、血清学试验以及多聚酶链反应等。所以，在此基础上，很有必要继续开发一种快速、简便的检测方法。


技术实现要素：

5.为了弥补现有技术的不足，本发明的目的之一，提供一种幽门螺旋杆菌的单克隆抗体及其制备方法；本发明的目的之二，提供了一种使用本发明制备的单克隆抗体制备幽门螺旋杆菌检测试剂盒。
6.一方面，本发明公开了一种幽门螺旋杆菌ureb抗原表位多肽，所述的抗原表位多肽的氨基酸序列为gevitrtwqtadknkkefgrlkeekg。
7.再一方面，本发明还公开了一种所述的抗原表位多肽的单克隆抗体，所述的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示。
8.再一方面，本发明还公开了一种用于检测幽门螺旋杆菌抗体的试剂盒，所述试剂盒包括有效量的权利要求1所述的抗原表位多肽和权利要求2所述的单克隆抗体以及配套的检测试剂。
9.优选地，本发明所述试剂盒中抗原表位多肽使用前与bsa偶联，所述的与bsa偶联的抗原表位多肽的包被量为5μg/ml。
3iygeelkfgggktlregmsqsnnpsk38-631:1024iykadigikdgkiagigkggnkdmqd81-1061:1025titpgrrnlkwmlraaeeysmnlgfl171-1961:1046igfkihedwgttpsainhaldvadky216-2411:1037aiagrtmhtfhtegaggghapdiikv264-2891:108mlmvchhldksikedvqfadsrirpq317-3421:1039gevitrtwqtadknkkefgrlkeekg370-3951:10523.实施例2：抗幽门螺旋杆菌尿素酶b亚单位(ureb)抗原表位多肽单克隆抗体的制备与检测
24.杂交瘤细胞筛选：使用合成的抗原表位多肽9免疫适龄balb/c小鼠，三次免疫后分离小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞sp2/0进行融合，再通过有限稀释法进行克隆化筛选，筛选出抗体效价高、形态良好的细胞株继续采用有限稀释法进行亚克隆，直至获得单克隆细胞，将单克隆细胞扩大培养并保存于液氮中。经过多轮检测和筛选，最终获得1株较好的阳性杂交瘤细胞，将其编为杂交瘤细胞1a2。
25.腹水制备：取6～8周龄balb/c雌性小鼠经腹腔注射降植烷，0.5ml/只，7日后，小鼠腹腔注射1
×
106个杂交瘤细胞1a2，7～10日后，用注射器无菌抽取小鼠腹水，并于4℃12000rpm离心20min，收集上清液即为腹水抗体，将收获的上清液进行分装，2ml/管，-70℃以下保存备用。
26.抗体纯化：采用常规的辛酸-硫酸铵沉淀法对制备的腹水抗体进行纯化(参见：周玉等，小鼠腹水igg类单克隆抗体纯化方法的研究。《黑龙江畜牧兽医》2006年第10期)。取纯化后的腹水抗体20μl，使用sds-page进行纯度检验，结果显示(图1)，单克隆抗体的sds-page纯度大于95％；使用bca试剂盒对纯化后的抗体进行蛋白浓度检测，蛋白浓度为2.12mg/ml。
27.单克隆抗体序列测定：参见中国发明专利(cn 111393525 b)对制备的单克隆抗体进行重链可变区和轻链可变区的分析和测定。经过检测和分析，单克隆抗体的重链可变区序列如seq id no.1所示，轻链可变区序列如seq id no.2所示。再对重链可变区序列和轻链可变区序列进行分析，结果见表2所示。
28.表2单克隆抗体可变区序列信息
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实施例3：幽门螺旋杆菌抗体的检测
[0031]
酶标板制备：采用本研究筛选的抗原表位多肽包被酶标板，因抗原表位多肽是半
抗原，在包被之前，将其与bsa偶联(使用常规的戊二醛法)得到抗原，将抗原以5μg/ml的剂量(0.1ml/孔)包被在酶标板上，4℃包被过夜；洗涤后，加封闭液(含2％bsa的pbst溶液)0.2ml/孔，4℃封闭过夜，洗涤后拍干，置于-20℃保存备用。
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酶标抗体制备：使用改良的高碘酸钠法对单克隆抗体进行hrp标记，简述如下：取0.1ml hrp和0.05ml naio4(0.06m)于反应管中，室温避光反应20min；再加入0.05ml乙二醇溶液，室温避光反应20min；然后对1l 0.01m ph 9.5的碳酸盐缓冲液中4℃透析过夜；加入0.05mg单克隆抗体，室温避光轻轻搅拌2h；再加入0.025ml nabh4溶液(4mg/ml)，4℃反应2h；使用1l pbs透析，4℃透析过夜；4000rpm 4℃离心30min，取上清，即为hrp标记的单克隆抗体。再标记好的单克隆抗体中加入等体积甘油，置于-20℃保存备用。使用前，用封闭液稀释20000倍，于4℃保存备用。
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试剂盒检测：1)将血清样品1:1稀释后加入酶标板中，0.1ml/孔，并加入阳性对照(制备的单克隆抗体，浓度为1μg/ml)和阴性对照(封闭液)各0.1ml，37℃孵育60分钟；2)洗涤后加入酶标抗体，0.1ml/孔，37℃孵育30分钟；3)洗涤后加入显影液(tmb显色液，购自北京索莱宝生物科技有限公司)，0.1ml/孔，37℃孵育10分钟；4)加入终止液(2m h2so4)，0.1ml/孔，混匀后立即将包被板置于酶标仪中，在波长为450nm下读取od450nm值；根据od450nm值计算s/n值(样品od450nm值/阴性对照od450nm值)；5)当阴性对照孔每孔od450nm读数大于1.0且各孔间最大差值应《0.3，阳性对照孔每孔od450nm读数应《0.3时，试验成立；6)当s/n值大于0.5时判为阴性，当s/n值小于等于0.5时判为阳性。
[0034]
试剂盒应用：发明人收集了来自广东某医院30份幽门螺旋杆菌感染病人的血清和45份正常血清。使用制备的试剂盒分别对75份血清进行检测，结果显示，本试剂盒检测的30份幽门螺旋杆菌感染病人的血清均为阳性，45份正常血清均为阴性，说明本试剂盒具有良好的准确性、特异性和灵敏度，适合大范围的应用。
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另外，本发明的幽门螺旋杆菌ureb抗原表位多肽作为抗原对螺旋杆菌感染病人的血清均能产生特异性的反应，说明本发明的抗原表位多肽具有良好的针对ureb的免疫原性，可以作为抗原表位疫苗的候选多肽之一。
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上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。