一种制备型色谱分离高纯度甘油三酯型α-亚麻酸的方法

一种制备型色谱分离高纯度甘油三酯型
α-亚麻酸的方法
1.技术领域
2.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种制备型色谱分离高纯度甘油三酯型α-亚麻酸的方法。
3.

背景技术：

4.随着健康中国战略的提出，全面营养和膳食均衡的理念得到了更多人的关注。在膳食脂质中，n-6和n-3 多不饱和脂肪酸（pufas）与人类健康密切相关，具有重要的生物学意义。n-6和n-3的失衡可能会增加许多慢性疾病的风险，如炎症和过敏（nutrients, 2016, 8(3):128.）。然而，人们不合理的饮食习惯会导致n-6 pufas摄入量过度，使n-3和n-6 pufas摄入比例失衡。为了缓解n-3和n-6 pufas的失衡，降低发病风险，有必要适当增加n-3 pufas的摄入。α-亚麻酸是n-3 pufas中唯一的必需脂肪酸，也是对人体健康至关重要的二十碳五烯酸（eicosapntemacnioc acid，epa）和二十二碳六烯酸（docose hexaenoie acid，dha）的前体（nutrients, 2016, 8(3):128.）。α-亚麻酸是组成细胞膜和生物酶的基本物质，随着α-亚麻酸含量的增加，膜的形成和流动性得到改善，这可能对预防动脉粥样硬化和回复血管弹性起到作用。α-亚麻酸除了具有结构功能外，还可以竞争性抑制n-6 pufas途径中的几种酶，特别是与脂肪酸和胆固醇生物合成相关的
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6-去饱和酶，从而促进代谢过程中的脂质平衡（journal of nutrition, 2016, 147(1):37-44.）。因此补充α-亚麻酸能够最有效地解决n-3 pufas的缺失问题。
5.亚麻科、杜仲科和唇形科植物是α-亚麻酸的主要来源。但考虑到耕地红线限制，且植物种子获取困难、成本高，导致植物来源的α-亚麻酸无法满足需求，人们开始将目光转向昆虫（journal of soil water conservation, 2004, 4:190-192.）。我国是养蚕大国，蚕蛹的年产量可达390,480吨，占世界总产量的80%。蚕蛹油中不饱和脂肪酸占75%以上，其中α-亚麻酸的含量占到35%（food chemistry, 2017, 231:348-355.）。因此，将蚕蛹油作为α-亚麻酸新的来源具有重要的现实意义和应用价值。在自然界，脂肪酸通常以甘油三酯的形式存在，α-亚麻酸的分离通常需要皂化预处理，既增加了制备成本又造成了中间环节α-亚麻酸的损失。乙酯化是α-亚麻酸分离的另一种常用手段，通过乙醇置换油脂中的甘油，制备α-亚麻酸乙酯（cn107556187a.）。然而，乙酯型n-3 pufas在人体中消化和吸收比较困难，而且可能存在安全隐患。综合以上考虑，从蚕蛹油分离获得甘油三酯型α-亚麻酸是一种经济、高效的手段甘油三酯的结构组成复杂，而且物理化学性质类似，导致甘油三酯的分离是一件十分艰巨的任务。已报道的脂质分离手段包括柱层析法、超临界co2萃取法和分子蒸馏技术，但这些方法只能对脂质中甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯和游离脂肪酸等混合物进行分离，并不能满足分离出甘油三酯中单体的要求（中国食品学报, 2018, 18(1):292-300.）。
制备型色谱是指采用色谱技术制备纯物质，即分离、收集一种或多种色谱纯物质。近年来，已报道研究人员将制备型色谱技术应用于甘油三酯的分离中来，利用中压制备液相色谱-紫外检测器联用技术制备了中链甘油三酯中极性相近的4个组分，并对收集的产物进行鉴定，结果显示每个组分的纯度均大于99%（烟草科技, 2018,51(7):61-66.）。因此，制备色谱技术能够高效、快速地分离纯化油脂中不同甘油三酯，有望应用于对蚕蛹油中不同功能性甘油三酯单体的分离纯化。然而，截止目前尚未见到关于蚕蛹油甘油三酯单体分离纯化的研究报道。因此，利用制备色谱技术有望应用于对蚕蛹油中不同功能性α-亚麻酸甘油三酯单体的分离纯化。
6.

技术实现要素：

7.针对从蚕蛹油中提取的α-亚麻酸纯度低，工艺复杂，成本高等问题，本发明提供了一种制备型色谱分离高纯度甘油三酯型α-亚麻酸的方法。结合有机溶剂浸提法、柱层析法和制备色谱技术，制备高纯度、多种类的高纯度甘油三酯型α-亚麻酸，拓宽蚕蛹油高附加值新产品的开发。
8.为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案为：一种制备型色谱分离高纯度甘油三酯型α-亚麻酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1，将蚕蛹粉碎至200目后，烘干，再加入有机溶剂，超声条件下萃取，重复萃取后，进行固液分离，收集滤液，旋转蒸发去除有机溶剂得到粗制蚕蛹油；所述的有机溶剂与蚕蛹粉的固液比为1-30：1，单位为ml/g；步骤2，以硅胶作为填料填装层析柱，装至2/3柱高，将粗制蚕蛹油与硅胶混合，使其均匀吸附于硅胶上，并将样品加入层析柱，保持柱面平整均匀；使用正己烷-乙醚混合液进行梯度洗脱，收集蚕蛹油甘油三酯组分；步骤3，将蚕蛹油甘油三酯组分进行制备色谱分离，再用异丙醇-乙腈混合液进行梯度洗脱，利用紫外检测器监测甘油三酯型α-亚麻酸的分离，收集产物，旋转蒸发去除有机溶剂，获得高纯度甘油三酯单体α-亚麻酸。
9.作为改进的是，步骤1中所述的有机溶剂为乙醇、正己烷、异丙醇、丙酮或石油醚。
10.作为改进的是，步骤1中所述的超声功率为100-1000w，超声时间为1-10 h，温度为15-60℃。
11.作为改进的是，步骤2中所述的蚕蛹油与硅胶的质量比为0.1-30：1，粗制蚕蛹油的上样量为0.1-50 g。
12.作为改进的是，步骤2中梯度洗脱为正己烷：乙醚混合液，体积比为1-50：1。
13.作为改进的是，步骤3中所述的甘油三酯组分进样浓度为1-100 mg/ml，样品进样量为1 ml，溶剂为异丙醇。
14.作为改进的是，步骤3中，所述的流动相为异丙醇-乙腈混合液，异丙醇与乙腈配比为（0.01-10）：1。
15.作为改进的是，步骤3中所述的流动相为异丙醇-乙腈混合液，流速为1-20 ml/min，紫外检测器检测波长为210 nm，柱温35 ℃。
16.上述方法制备的高纯度的高纯度甘油三酯型α-亚麻酸。
17.有益效果：与现有技术相比，本发明一种制备型色谱分离高纯度甘油三酯型α-亚麻酸的方法，从蚕蛹油中分离纯化得到高纯度的甘油三酯型α-亚麻酸,其工艺更加简单、操作方便、样品无损失、高效快速、制备量大及纯度高,是一种适合大量制备生产高纯度α-亚麻酸甘油三酯单体的良好方法。
18.附图说明
19.图1 为蚕蛹油中甘油三酯的成分；图2 为蚕蛹油、甘油三酯单体的实物图；图3 为蚕蛹油甘油三酯单体hplc-elsd图谱；图4 为蚕蛹油甘油三酯单体lnlnln的核磁共振氢谱和质谱图，a为核磁共振氢谱，b质谱图。
20.具体实施方式
21.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。
22.实施例1超声辅助浸提法提取蚕蛹油将蚕蛹于60℃下干燥后粉碎成大小为200目的颗粒，放入棕色试剂瓶中，按石油醚：蚕蛹粉=1:1（v/v）加入石油醚，40℃下超声波处理5 h，每隔20 min摇匀混合物。将处理后的蚕蛹粉-石油醚混合物过滤，分离得到的包含蚕蛹油的石油醚溶液，于55℃的温度下减压浓缩除去其中的石油醚，即得粗制蚕蛹油。
23.利用气相色谱对粗制蚕蛹油的脂肪酸组成进行分析（如表1），结果表明蚕蛹油中α-亚麻酸含量高达32.60
±
0.67%，是一种提取α-亚麻酸的油脂原料。
24.表1. 蚕蛹油的脂肪酸组成及分布实施例2柱层析法分离蚕蛹油甘油三酯取一定量硅胶湿法填装层析柱，装至2/3柱高，将30 g粗制蚕蛹油均匀吸附于硅胶上，粗制蚕蛹油与硅胶的质量比为1：1。将粗制蚕蛹油和硅胶的混合物加入层析柱，保持柱面平整均匀，分别使用200 ml正己烷、100 ml正己烷/乙醚（95：5，v/v）、正己烷/乙醚（70：
30，v/v）进行梯度洗脱，收集只含甘油三酯的洗脱液，于55℃的温度下减压浓缩除去其中的有机溶剂，即得蚕蛹油甘油三酯混合物。
25.利用hplc-elsd对蚕蛹油的甘油三酯组成进行分析（结果如图1），hplc色谱条件：agilent 1260 infinity ii色谱仪，kromasil c
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（250
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4.6 mm，5 μm）色谱柱，35 ℃柱温，1 ml/min的进样流速，10 μl的进样量；检测器条件：agilent 1260 infinity ii elsd, 1.6 ml/min的气体流量，50℃蒸发器温度和45℃雾化器温度；流动相条件：a，乙腈；b，二氯甲烷；洗脱条件：梯度洗脱，0~5 min，0 b~15% b，5~30 min, 15 % b~70 % b，30~32 min 70 % b，32~35 min 70%~0 b。结果表明蚕蛹油中含有α-亚麻酸的甘油三酯多达9种，其中，甘油三酯lnlnln的α-亚麻酸含量为100%，有望分离获得高纯度、高含量的甘油三酯型α-亚麻酸。
26.实施例3 制备色谱分离α-亚麻酸甘油三酯单体选择乙腈/异丙醇作为流动相对蚕蛹油甘油三酯的进行分离，在乙腈：异丙醇=1：1(v/v)、蚕蛹油甘油三酯浓度为15 mg/ml、进样量1 ml和流速12 ml/min的条件下，根据紫外检测器的出峰时间在线收集蚕蛹油α-亚麻酸甘油三酯单体，将收集到的洗脱液在40℃旋转蒸发获得蚕蛹油甘油三酯型单体。
27.蚕蛹油呈亮黄色透明状，有蚕蛹腥味，甘油三酯单体lnlnln和lnlno均无色透明且无明显气味（如图2）。两种甘油三酯单体的α-亚麻酸含量分别为100.00%和66.66%，远高于蚕蛹油的32.60
±
0.67%。同时lnlnln和lnlno两种甘油三酯颜色透亮、没有异味，开发成高效补充α-亚麻酸产品，更易被人们所接受。
28.实施例4蚕蛹油甘油三酯单体的纯度分析根据紫外检测器的出峰时间在线收集蚕蛹油甘油三酯单体，收集的样品使用hplc-elsd检测，确保收集的甘油三酯单体组分正确。
29.利用hplc-elsd（参数同实施例1）对步骤3中收集的7个组分进行分析，可以看出接收的组分能与蚕蛹油中甘油三酯组分一一对应（结果如图3），利用面积归一法（公式1）计算各甘油三酯单体纯度大于98%，说明建立的半制备色谱技术可以满足蚕蛹油甘油三酯单体的分离。
30.式中为各组分的量之和；为各组分峰面积之和。
31.实施例5 甘油三酯型α-亚麻酸的结构鉴定利用质谱和1h nmr对富含α-亚麻酸的甘油三酯单体进行结构鉴定，结果如图4所示。从图4中可以看出，lnlnln的m/z为895.50，碎裂之后的碎片峰为595.30，可以推测碎裂出来碎片为[rcooh na]

，裂解的脂肪酸为α-亚麻酸，由于单体1包含三个脂肪酸，因此其结构为lnlnln。
[0032]
从上述结果可以看出，本发明首次利用制备色谱技术从蚕蛹油中分离纯化高纯度α-亚麻酸甘油三酯单体，其工艺简单、高效快速、制备量大及纯度高，可产业化生产高纯度甘油三酯α-亚麻酸。