一种盐湖混合微藻的规模化连续培养方法与流程

1.本发明涉及微藻培养生物技术领域，具体为一种盐湖混合微藻的规模化连续培养方法。


背景技术：

2.微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养植物，微藻约有3万种记录在册。光养和异养是生产微藻的两种方法。
3.微藻可在光能驱动下吸收co2、将光能转化为细胞内储藏的化学物质，同时释放氧气。微藻的细胞代谢产生多糖、蛋白质、油脂、色素等产物，这些代谢产物在食品、医药、液体燃料等领域均具有良好的开发前景。因此，微藻培养越来越广泛，但是，现有的微藻培养方法基本上都是对单一藻种进行培养，培养液配制成本高，微藻培养效率较低。
4.对混合微藻、微藻培养进行现有技术的检索如下：专利申请公布号cn112410225a（一种微藻培养方法）中，提供了一种微藻培养方法，该方法主要是对微藻的扩培过程及培养液、光照强度等常规参数进行了规定，而对最关键的微藻品种没有规定，藻的品种是最重要的，不同的品种最佳培养条件都不一样。该发明也未见对混合微藻的培养方法。
5.专利申请公布号cn114133039a（一种利用混合微藻处理城市生活污水的方法）中，提供了一种利用混合微藻处理城市生活污水的方法，其所述混合微藻为小球藻和栅藻，未见有对混合微藻为小球藻和盐藻的混合培养。
6.专利申请公布号cn 111607523a（一种高产工厂化微藻培养方法）中，公开了一种高产工厂化微藻培养方法，该方法主要是对微藻的扩培设施场地、温度控制、co2发生及施放装置等参数进行了规定，而对培养用微藻品种没有规定，该发明也未见对混合微藻的培养方法。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明目的是提供一种盐湖混合微藻的规模化连续培养方法，其微藻藻种均取自运城盐湖优势藻种，本地藻种不需驯化就能适应运城盐湖卤水生长环境；培养液选用运城盐湖饱合卤水和中水，就地取材，原料广泛，成本低廉。不需对微藻进行采收，培养的混合微藻直接作为本地卤虫养殖活体饵料，不仅提高卤虫品质而且大幅降低卤虫饵料成本，经济效益显著。
8.为实现上述目的，本发明是采用如下技术方案实现的：一种盐湖混合微藻的规模化连续培养方法，包括如下步骤：步骤1：分离出运城盐湖卤水中优势混合微藻藻种；所述混合微藻藻种包括小球藻和盐藻。
9.将卤虫养殖水用200目的网绢进行过滤，过滤后的样品就是初始样品；初始样品静置后，藻上浮，液面贴壁一圈为绿色，取其绿色藻种接种于培养基中，扩培至每毫升百万级。
10.其中，培养基为实验室依据配制卤虫养殖水的饱和卤水确定的营养基：盐度8obe
/
～10obe
/
；nano
3 0.2g/l～0.4g/l，尿素量为0.5g/l～1.0g/l，kh2po
4 0.01g/l～0.3g/l，nahco
3 0.2g/l～1.0g/l；ph值7.0～9.0。
11.培养基采用运城盐湖饱合卤水，其中钠离子与镁离子摩尔比为（0.5～1.5）：1.0，ph为7.0～9.0，盐度为 8obe
/
～10obe
/
。
12.步骤2：对步骤1获得的优势混合微藻藻种依次进行多级扩培，培养基所用卤水和淡水要求用200目筛网过滤并消毒。
13.扩培用营养基为：盐度8obe
/
～10obe
/
；nano
3 0.2g/l～0.4g/l；尿素量为0.5g/l～1.0g/l；kh2po
4 0.01g/l～0.3g/l；ph值7.0～9.0。
14.扩培用运城盐湖饱合卤水，其中钠离子与镁离子摩尔比为（0.5～1.5）：1.0，ph为7.0～9.0，盐度为 8obe
/
～10obe
/
。
15.搅拌方式：将纳米曝气盘置于池底，将空气以微泡形式通入水中。
16.步骤3：取上述步骤2中扩培后的混合微藻，于运城盐池池塘中进行混合培养，提高生物量。
17.（1）微藻养殖前的准备工作池塘清整养殖池注水前排干池水，清理池塘底泥，暴晒后，采用生石灰干法清塘，对池塘边埂进行加固、防漏处理。
18.进水和施肥进水：初次进水为配制卤虫养殖水的饱和卤水，深度为25～35
㎝
，放置20天，用高浓度卤水对养殖池消毒杀菌。
19.施肥：以养殖池面积100亩为计，初次进水放置20天后，有机肥选择发酵豆粕，每亩施用发酵豆粕50kg～150kg，补水至0.6m～0.8m，每亩施尿素5～15
㎏
、kh2po
4 2～10
㎏
；调整盐度为8obe
/
～10obe
/
、ph值7.0～9.0；进、补水经过滤网筛过滤，筛网要求在200目以上。
20.（2）接种在扩培池中取混合微藻藻种接种于微藻养殖池中，采取连续培养方法，当微藻养殖池培养的微藻浓度达到每毫升百万级时，将混合微藻藻液注入卤虫养殖池中，每次每池注入3cm～5cm，剩余藻液至少0.4m；然后，将微藻养殖池补加水至0.6m～0.8m，根据需要进行补充养料，达到连续培养。
21.进一步优选的，步骤1中，营养基：盐度9obe
/
；nano
3 0.34g/l，尿素量为0.8g/l，kh2po
4 0.03g/l，nahco
3 0.8g/l。
22.进一步优选的，步骤2中，扩培用培养基为实验室依据配制卤虫养殖水的饱和卤水确定的营养基：盐度9obe
/
；nano
3 0.34g/l，尿素量为0.8g/l，kh2po
4 0.01g/l。
23.进一步优选的，步骤1和步骤2中，运城盐湖饱合卤水，其中钠离子与镁离子摩尔比为1.0，ph为8.0，盐度为9obe
/
。
24.进一步优选的，步骤3中，生石灰的每亩用量为80～120kg。施肥：以养殖池面积100
亩为计，每亩施用发酵豆粕10kg、每亩施尿素1kg、kh2po
4 5kg，调整盐度为8obe
/
，ph值8.0。
25.本发明具有的有益效果如下：1、本发明原料就地取材，成本低，工艺简单，易实施，具有良好的经济效益和社会效益，可以得到推广应用，促进微藻培养和水产养殖业的健康发展。
26.2、本发明培养得到的盐湖混合微藻，属于天然绿色环保型生物饵料，活性好，营养全面，易吸收，能够有效提高生物饲料的利用率和转化率。
27.3、通过本发明培养盐湖混合微藻，能够有效降低盐湖中氮、磷及有机质含量，降低盐湖水体中的bod值，净化盐湖水质，从而取得明显的盐湖生态效益。
28.本发明设计合理，培养液选用运城盐湖饱合卤水、中水，进行合理调配后再补充营养成分，通过对培养液中矿物质成分含量的调节，稳定ph环境，为混合微藻提供了适宜的生长环境，从而有效地提高了微藻的生物量，实现了微藻的规模化生产，具有很好的实际应用价值。
具体实施方式
29.下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，本领域普通技术人员参照说明书文字能够据以实施。
30.一、优势微藻藻种的确定通过对运城盐湖浮游生物资源系统的调查，发现如下藻类，见表1。
31.表1
ꢀꢀ
运城盐湖藻类
5月至8月，是卤虫的盛产期，卤虫养殖水的盐度是12～15obe
/
，养殖水中的微藻主要是盐藻和小球藻，卤虫以盐藻和小球藻为食物。盐藻是单细胞的浮游植物，其藻体为卵圆形、椭圆形或梨形，长14～22μm，宽3～14μm；小球藻是一种单细胞藻类，直径3～8μm。最终确定优势微藻藻种是盐藻和小球藻。
32.二、培养液盐度确定依据：表2
ꢀꢀ
养殖盐度与藻类生长情况低于8obe
/
的卤水中很容易生长大于50μm的藻类。卤虫是滤食性动物，适合的食物颗粒要小于50μm，大于50μm的藻无法被采食。
33.从对运城盐湖卤水中浮游生物及生物环境的调研中，得知5～15obe
/
的卤水中的都有盐藻和小球藻。确定微藻的养殖水盐度是8obe
/
～10obe
/
，原因一是此盐度可以抑制大型藻的生长；二是此盐度的藻液进入卤虫养殖池中，可以抑制大型藻的生长；三是此盐度液进入卤虫养殖池中，可以补充蒸发掉的养殖水；四是盐藻和小球藻在此盐度下可以较快生长。
34.三、优势藻种的分离、提纯及扩培（1）盐藻的分离、提纯及扩培采用稀释分离法和平板分离法从卤虫养殖水中分离出盐藻种。
35.培养基为实验室依据配制卤虫养殖水的饱和卤水确定的营养基：盐度9obe
/
；nano
3 0.34g/l，kh2po
4 0.03g/l，nahco
3 0.8g/l；ph值8.0。培养基于高温高压锅内消毒杀菌。用此培养基提纯、扩培盐藻。
36.（2）小球藻的分离、提纯及扩培采用稀释分离法和平板分离法从卤虫养殖水中分离出盐藻种。
37.培养基为实验室依据配制卤虫养殖水的饱和卤水确定的营养基：盐度9obe
/
；naco
3 0.02g/l，nano
3 2.0g/l，kh2po
4 0.02g/l，尿素量为0.8g/l；ph值6.0。培养基于高温高压锅内消毒杀菌。用此培养基提纯、扩培小球藻。
38.（3）混合藻的富集及实验室扩培将卤虫养殖水用200目的网绢进行过滤，过滤后的样品就是初始样品。初始样品静置一段时间后，藻上浮，液面贴壁一圈为绿色，取其绿色藻种接种于培养基中，扩培至每毫升百万级。
39.培养基为实验室依据配制卤虫养殖水的饱和卤水确定的营养基：盐度9obe
/
；nano
3 0.34g/l，尿素量为0.8g/l，kh2po
4 0.03g/l，nahco
3 0.8g/l；ph值7.0～9.0。培养基于高温高压锅内消毒杀菌，用此培养基扩培。
40.表3 优势藻种分离、提纯营养基筛选试验数据
四、培养介质选择培养介质的组成直接关系到户外大面积养殖的效果，微藻开放式养殖需要大量的高盐度卤水。用淡水加盐的办法也可使培养液达到所需要的盐度，但会使养殖成本大幅增加。本发明采用配制卤虫养殖水的饱和卤水来配制培养基，由于饱和卤水对敌害生物有很强的抑制力，故不经消毒直接用于微藻养殖。而且卤水中含有丰富的营养元素基本满足微藻生长的需要，只需添加n、p、c等元素。培养基所用卤水和淡水要求用200目筛网过滤。
41.五、本发明所述的盐湖混合微藻的规模化连续培养方法，培养过程需要经过运城盐湖优势混合微藻的藻种选择、饱合卤水和中水筛选过滤、一级扩培、二级扩培、运城盐湖规模化培养。
42.其中，混合微藻为小球藻、盐藻两种，小球藻与盐藻的数量比为1～10∶10～1。所用藻种均从运城盐湖卤水中获取。培养液为运城盐湖饱合卤水与中水，所用饱合卤水和淡水要求用200目筛网过滤。饱合卤水为氯离子、钠离子、硫酸根离子、镁离子，其中钠离子与镁离子摩尔比为（0.5～1.5）：1.0。培养液ph范围为7.0～9.0，培养液盐度为8obe
/
～10obe
/
。补加物为豆粕发酵液、尿素、kh2po4。
43.具体实施例如下：一种盐湖混合微藻的规模化连续培养方法，其步骤如下：步骤1：分离出运城盐湖卤水中优势混合微藻藻种；混合微藻藻种包括小球藻和盐藻。
44.将卤虫养殖水用200目的网绢进行过滤，过滤后的样品就是初始样品。初始样品静置一段时间后，藻上浮，液面贴壁一圈为绿色，取其绿色藻种接种于培养基中，扩培至每毫升百万级。
45.其中，培养基为实验室依据配制卤虫养殖水的饱和卤水确定的营养基：盐度9obe
/
；nano
3 0.34g/l，尿素量为0.8g/l，kh2po
4 0.03g/l，nahco
3 0.8g/l；ph值7.0～9.0。培养基于高温高压锅内消毒杀菌，用此培养基扩培。
46.步骤2：对步骤1确定的优势藻种分别进行一级扩培和二级扩培，培养基所用卤水和淡水要求用200目筛网过滤并消毒。
47.一级扩培：取步骤1实验室培养的混合微藻藻种2l接种至体积为400l的白色塑料养殖箱中于室外进行一级扩培。
48.二级扩培：在白色塑料养殖箱中取一级扩培的混合微藻藻液的藻种100l接种至100m2的养殖池中进行二级扩培。
49.其中，扩培用培养基均为实验室依据配制卤虫养殖水的饱和卤水确定的营养基：盐度9obe
/
；nano
3 0.34g/l，尿素量为0.8g/l，kh2po
4 0.01g/l；ph值8.0。
50.搅拌方式：将纳米曝气盘置于桶底，将空气以微泡形式通入水中。作用一是提高光合作用效率，防止藻体下沉、集聚，减小营养物质梯度和气体梯度；二是补充co2，提供碳源。
51.扩培用运城盐湖饱合卤水，其中钠离子与镁离子摩尔比为1.0，ph为8.0，盐度为9obe
/
。
52.步骤3：取上述步骤2中扩培后的混合微藻，于运城盐池100亩池塘中进行混合培养，提高生物量。
53.（1）微藻养殖前的准备工作池塘的清整养殖池面积100亩，池深1.2m左右，注水前30天排干池水，清理池塘底泥，暴晒2周后，采用生石灰干法清塘，每亩用量为100kg。对池塘边埂进行加固、防漏处理。
54.进水和施肥进水：初次进水为配制卤虫养殖水的饱和卤水，深度为25
㎝
，放置20天，用高浓度卤水对养殖池消毒杀菌。
55.施肥：有机肥选择发酵豆粕。初次进水放置20天后，每亩施用发酵豆粕100
㎏
，补水至0.6m，每亩施尿素1
㎏
、kh2po
4 5
㎏
。调整盐度为8obe
/
、ph值8.0。进、补水经过滤网筛过滤，筛网要求在200目以上。
56.（2）接种在100m2的二级扩培池中取混合微藻藻种15～30m3（本实施例选择20m3），然后接种于100亩微藻养殖池中。
57.采取连续培养方法，当微藻养殖池培养的微藻浓度达到每毫升百万级时，将混合微藻藻液注入卤虫养殖池中，每次每池注入5
㎝
，剩余藻液至少0.4m。然后，将微藻养殖池补加水至0.6m，根据需要进行补充养料，达到连续培养。
58.（3）微藻养殖日常管理工作适当施肥：每周进行尿素、kh2po4与nahco3溶液泼洒，阴雨天气少施或不施，晴天尽量施足肥料，每隔一月施用发酵豆粕一次。无机肥和有机肥合理搭配。
59.测水质：每天测量水体各理化指标，主要包括每天平均水温、ph、溶解氧、氨氮含量、亚硝酸盐含量及水色变化等。
60.搅拌方式：主要靠运城盐湖的风力搅，再加上适当的机械搅拌。由于盐藻细胞无细胞壁，极易被破坏，故而搅拌方式不易猛烈，选择轮式搅拌，每日搅拌3～4次，每次1小时。
61.水体调控：由于运城盐湖日蒸发量较大，要及时补充淡水。如果连日降雨或降暴雨，使养殖池内盐度降低，要及时调节卤水盐度。
62.镜检：用浮游生物网取水样，利用显微镜观察水体中是否有其他杂藻及敌害生物，如果有就要用药物将其杀灭，确保微藻的纯度与防治危害。
63.做记录：将当天所用的肥料、药物、水质指标和各种情况记录下来。
64.（4）藻类敌害生物的防治在温度较低时，微藻生长都不旺盛，所以培养初期的引种可使微藻迅速成为优势种群，与其它其他藻类产生竞争关系，抑制其它藻类的生长。培养中后期，微藻已成为优势种群，其它藻类和敌害生物无法大量繁殖。
65.微藻敌害生物主要包括轮虫、枝角类、各种昆虫幼体及各种以微藻为食的原生动物。防治微藻敌害生物可使用敌百虫及菊酯类药物等水产杀虫药。注意不能长期只用一种药物，而是要几种药物交替使用，以免产生耐药性。
66.（5）微藻生物量指标由显微镜观察百亩微藻养殖池，微藻浓度达到每毫升百万级，经镜检主要是盐藻和小球藻。肉眼观察，水色翠绿。
67.采用血球计数板计数方法。
68.鲁哥氏液的配置：将6g碘化钾溶于20ml水中，待其完全溶解后，加入4g碘充分摇动，待碘充分溶解后定容到100ml即可（用棕色玻璃瓶装）。
69.准备待测藻液（每个中格中藻细胞数5～10个为宜，待测藻液不需稀释），用鲁哥氏液固定，每1000ml藻液中加入鲁哥氏液10～15ml。
70.取洁净的血球计数板（25
×
16型）一块，在计数区上盖一块盖玻片。
71.用20微升移液器吸取鲁哥氏液固定过的藻液，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘滴入一小滴。
72.静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。将血球计数板放置于显微镜载物台上，先在低倍镜下找到计数区后，再转换400倍镜下计数。
73.统计大方格四角及中央中格内的藻细胞数，重复计数3次。
74.计算公式藻细胞数=(80小格内藻细胞个数/80)
×
400
×
104×
稀释倍数表4
ꢀꢀ
藻细胞计数（6）微藻采收方式及投喂方式的确定
养殖微藻的目的主要是用来喂养卤虫，养殖场地和卤虫养殖基地很近，直接将藻液用泵抽出经循环江道进入卤虫养殖池中，不用专门进行采收。
75.本发明所述的盐湖混合微藻的培养方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变成分组成与配比等环节来实现相应的其他目的，其相关改变都没有脱离本发明内容，凡在本发明创造的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。