用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆B细胞的ELISpot试剂盒及其应用

用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的elispot试剂盒及其应用
技术领域
1.本发明属于兽医生物技术领域，具体涉及用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的elispot试剂盒及其应用。


背景技术：

2.猪圆环病毒2(porcine circovirus 2，pcv2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症(post-weaning multisystem wasting syndrome，pmws)、猪皮炎肾病综合症(porcine dermatitis andnephropathy syndrome，pdns)等多种猪病的主要病原，这些由pcv2引起的多种病症统称为猪圆环病毒病(porcine circovirus disease，pcvd)。pcv2在我国流行范围广，感染情况严重，对养猪业危害大。
3.目前流行的pcv2基因型主要为pcv2b和pcv2d，疫苗免疫是预防pcvd的主要手段，但是疫苗的免疫效果需要进行评估，而评估指标中体液免疫反应的检测尤为重要。体液免疫效果评估，通常采用抗体检测方法来进行，其中使用最多的是酶联免疫吸附试验(elisa)。但是对于仔猪，临床上pcv2疫苗的免疫时间通常为2-4周龄，此时仔猪体内存在较高的母源抗体，且持续时间较长，而elisa等抗体检测方法不能区分母源抗体与疫苗抗体或感染抗体。因此，如果采用elisa等抗体检测技术来检测pcv2特异性抗体，得到的疫苗免疫效果并不客观。


技术实现要素：

4.有鉴于此，本发明的目的在于提供蛋白组合和用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的elispot试剂盒及其应用，本发明的蛋白组合和elispot试剂盒能够客观判断猪圆环病毒疫苗诱导的免疫效果和猪圆环病毒感染的诊断。
5.本发明提供了一种蛋白组合，包括cap-2b和cap-2d；所述cap-2b的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述cap-2d的氨基酸序列如seq id no.2所示。
6.本发明还提供了上述方案所述蛋白组合在制备检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的试剂或试剂盒中的应用。
7.本发明提供了一种包被有上述方案所述蛋白组合的elispot孔板。
8.优选的，所述elispot孔板的材质包括pvdf膜。
9.优选的，所述蛋白组合中cap-2b和cap-2d的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；所述cap-2b和cap-2d的总包被质量浓度为1.25μg/ml。
10.本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的elispot试剂盒，包括：上述方案所述的elispot孔板、pbs、生物素标记的二抗、hrp标记的链霉亲和素和aec底物显色液。
11.优选的，所述生物素标记的二抗的使用浓度为5μg/ml。
12.优选的，所述hrp标记的链霉亲和素的使用浓度为0.25μg/ml。
13.本发明还提供了上述方案所述的elispot孔板或者上述方案所述的elispot试剂盒在非诊断目的的检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞或者评估pcv2疫苗免疫效果中的应用。
14.优选的，所述非诊断目的的检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞或者评估pcv2疫苗免疫效果包括以下步骤：
15.1)将待检样本加入到elispot孔板内，进行第一孵育；
16.2)在所述第一孵育后，去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第一洗涤；
17.3)在所述第一洗涤后，在elispot孔板内加入生物素标记的二抗，进行第二孵育；
18.4)在所述第二孵育后，去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第二洗涤；
19.5)在所述第二洗涤后，在elispot孔板内加入hrp标记的链霉亲和素，进行第三孵育；
20.6)在所述第三孵育后，去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第三洗涤；
21.7)在所述第三洗涤后，在elispot孔板内加入aec底物显色液，进行显色反应；
22.8)在所述显色反应后，终止显色，在所述终止显色后，读取所述elispot孔板上的斑点数量，通过所述斑点数量的多少对猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的数量进行定量从而评估pcv2疫苗免疫效果；所述斑点数量代表猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的数量；所述斑点数量越多表示pcv2疫苗免疫效果越好。
23.本发明提供了一种蛋白组合，包括cap-2b和cap-2d。cap-2b和cap-2d分别为pcv2b和pcv2d的cap蛋白。对猪圆环病毒而言，b细胞免疫水平对抵抗和清除病毒起关键作用，因此诱导b细胞免疫反应的能力是pcv2候选疫苗免疫保护效力的重要指标。针对上述需求，本发明提供了蛋白组合，本发明的蛋白组合能够作为特异性抗原用于捕获猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞产生的抗体。本发明的蛋白组合能够用于评估经刺激后产生pcv2-cap蛋白抗体的b细胞的水平，从而反映pcv2候选疫苗诱导的特异性记忆b细胞免疫反应的水平，通过检测特异性记忆b细胞有效避免了母源抗体的干扰，进而准确客观评估疫苗所诱导的免疫反应。
附图说明
24.图1为elispot检测原理图；
25.图2为昆虫杆状病毒表达系统表达pcv2b和pcv2d基因型cap蛋白的sds-page电泳检测(a)和western blot分析(b)；m为蛋白marker，1为cap-2b蛋白，2为cap-2d蛋白，3为阴性对照；
26.图3为pcv2b和pcv2d基因型cap蛋白的纯化结果；m为蛋白marker，1、2分别为纯化后的cap-2b蛋白和cap-2d蛋白，3、4分别为纯化前cap-2b和cap-2d的蛋白表达上清；
27.图4为断奶仔猪免疫pcv2疫苗后各时期抗体水平结果；其中，a：注射生理盐水(对照组)；b：免疫勃林格pcv2疫苗；
28.图5为断奶仔猪免疫pcv2疫苗后各时期记忆b细胞elispot结果；其中，a：注射生理盐水(对照组)；b：免疫勃林格pcv2疫苗；c：断奶仔猪elispot代表性结果。
具体实施方式
29.本发明提供了一种蛋白组合，包括cap-2b和cap-2d；所述cap-2b的氨基酸序列如seq id no.1所示，具体为：
30.mtyprrryrrrrhrprshlgqilrrrpwlvhprhryrwrrkngifntrlsrtfgytikrttvrtpswavdmmrfnindflppgggsnprsvpfeyyrirkvkvefwpcspitqgdrgegssavilddnfvtkataltydpyvnyssrhtitqpfsyhsryftpkpvldstidyfqpnnkrnqlwlrlqtagnvdhvglgtafensiydqeynirvtmyvqfrefnlkdpplnp；
31.所述cap-2d的氨基酸序列如seq id no.2所示，具体为：
32.mtyprrrfrrrrhrprshlgqilrrrpwlvhprhryrwrrkngifntrlsrtigytvkkttvrtpswnvdmmrfnindflppgggsnpltvpfeyyrirkvkvefwpcspitqgdrgvgstavilddnfvpkanaltydpyvnyssrhtitqpfsyhsryftpkpvldgtidyfqpnnkrnqlwlrlqttgnvdhvglgtafensiydqdyniritmyvqfrefnlkdppltpk。
33.本发明对所述cap-2b和cap-2d的来源和制备方法没有特殊限制，采用本领域常规方法制备得到。
34.本发明还提供了上述方案所述蛋白组合在制备检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的试剂或试剂盒中的应用。
35.在本发明中，所述蛋白组合作为所述试剂或试剂盒的检测抗原使用。
36.本发明提供了一种包被有上述方案所述蛋白组合的elispot孔板。
37.在本发明中，包被有上述方案蛋白组合的elispot孔板优选的采用以下方法制备得到：将cap-2b、cap-2d和0.01m的pbs混合，得到混合液；将所述混合液加入到elispot孔板中，进行孵育；在所述孵育后，去除elispot孔板中的液体，对elispot孔板进行洗涤后，在所述elispot孔板内加入含体积含量为10％fbs的rpmi-1640培养基，进行封闭，得到包被有上述方案蛋白组合的elispot孔板。
38.在本发明中，所述cap-2b和cap-2d的质量比优选为在本发明中，所述蛋白组合中cap-2b和cap-2d的质量比优选为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)，更优选为1:1；所述混合液中cap-2b和cap-2d的总质量浓度优选为1.25μg/ml；所述0.01m的pbs的ph值优选为7.4。在本发明中，将所述混合液加入到elispot孔板中之前，优选的还包括在elispot孔板中加入乙醇水溶液，对elispot孔板进行预激活，以提高pvdf膜对抗原蛋白的结合能力；在本发明中，所述乙醇水溶液中乙醇的体积浓度优选为35％；所述elispot孔板中乙醇水溶液的加入量优选为15μl/孔；所述预刺激的时间优选为1min；在所述预刺激后，优选的还包括去除elispot孔板中的水溶液并采用灭菌超纯水对elispot孔板进行洗涤；所述洗涤的次数优选为4次，每次洗涤，elispot孔板中灭菌超纯水的加入量优选为200μl/孔；所述elispot孔板中混合液的加入量优选为100μl/孔；所述孵育的温度优选为4℃；所述孵育的时间优选为12～16h；所述洗涤采用的试剂优选为无菌pbs；所述洗涤的次数优选为4次，本发明在最后一次洗涤后，优选的还包括在无菌纸上轻轻扣干孔板内水分；所述含体积含量为10％fbs的rpmi-1640培养基的加入量优选为150～200μl/孔；所述封闭的温度优选为37℃；所述封闭的时间优选为1.5～2h。
39.本发明还提供了一种用于检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的elispot试剂盒，包括：上述方案所述的elispot孔板、pbs、生物素标记的二抗、hrp标记的链霉亲和素和
aec底物显色液。
40.在本发明中，每个elispot试剂盒中elispot孔板的数量优选为2块；所述elispot孔板的规格优选为8孔
×
12条。所述elispot孔板的材质优选的包括pvdf膜。
41.在本发明中，所述pbs优选为10倍浓缩的0.1m pbs；每个elispot试剂盒中pbs的体积优选为75ml。在本发明中，所述生物素标记的二抗优选为生物素标记的羊抗猪igg；所述生物素标记的二抗的使用浓度优选为5μg/ml；每个elispot试剂盒中生物素标记的二抗的体积优选为30ml。在本发明中，所述hrp标记的链霉亲和素的使用浓度为0.25μg/ml；每个elispot试剂盒中hrp标记的链霉亲和素的体积优选为30ml。在本发明中，每个elispot试剂盒中aec底物显色液的体积优选为30ml。
42.本发明还提供了上述方案所述的elispot孔板或者上述方案所述的elispot试剂盒在非诊断目的的检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞或者评估pcv2疫苗免疫效果中的应用。
43.在本发明中，所述非诊断目的的检测猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞或者评估pcv2疫苗免疫效果包括以下步骤：
44.1)将待检样本加入到elispot孔板内，进行第一孵育；
45.2)在所述第一孵育后，去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第一洗涤；
46.3)在所述第一洗涤后，在elispot孔板内加入生物素标记的二抗，进行第二孵育；
47.4)在所述第二孵育后，去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第二洗涤；
48.5)在所述第二洗涤后，在elispot孔板内加入hrp标记的链霉亲和素，进行第三孵育；
49.6)在所述第三孵育后，去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第三洗涤；
50.7)在所述第三洗涤后，在elispot孔板内加入aec底物显色液，进行显色反应；
51.8)在所述显色反应后，终止显色，在所述终止显色后，读取所述elispot孔板上的斑点数量，通过所述斑点数量的多少对猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的数量进行定量从而评估pcv2疫苗免疫效果；所述斑点数量代表猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的数量；所述斑点数量越多表示pcv2疫苗免疫效果越好。
52.本发明首先将待检样本加入到elispot孔板内，进行第一孵育。
53.在本发明中，所述待检样本优选为血液里面分离且经过刺激的淋巴细胞；所述刺激优选的包括在进行elispot检测前，将激动剂添加到待检测的淋巴细胞中进行的刺激，以使记忆b细胞分化为浆细胞；所述激动剂优选的包括雷西莫特(r848)；所述待检样本在elispot孔板内的加入量优选为100μl/孔；所述第一孵育在的温度优选为37℃；所述第一孵育的时间优选为24h；所述第一孵育优选的于5％co2细胞培养箱中进行。在本发明中，所述待检样本包括经pcv2疫苗刺激培养后的淋巴细胞；所述刺激培养的时间优选为3d。
54.在所述第一孵育后，本发明去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第一洗涤。所述第一洗涤采用的试剂优选为无菌pbs；所述第一洗涤的次数优选为4次；在最后一次第一洗涤后，优选的还包括在无菌纸上轻轻扣干elispot孔板内水分。
55.在所述第一洗涤后，本发明在elispot孔板内加入生物素标记的二抗，进行第二孵育。在本发明中，所述生物素标记的二抗的加入量优选为100μl/孔；所述第二孵育的温度优选为20～25℃；所述第二孵育的时间优选为2h。
56.在所述第二孵育后，本发明去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第二洗涤；所述第二洗涤优选的同第一洗涤，这里不在赘述。
57.在所述第二洗涤后，本发明在elispot孔板内加入hrp标记的链霉亲和素，进行第三孵育。在本发明中，所述hrp标记的链霉亲和素的加入量优选为100μl/孔；所述第三孵育的温度优选为20～25℃；所述第三孵育的时间优选为1h。
58.在所述第三孵育后，本发明去除elispot孔板内液体，对elispot孔板进行第三洗涤；所述第三洗涤优选的同第一洗涤，这里不在赘述。
59.在所述第三洗涤后，本发明在elispot孔板内加入aec底物显色液，进行显色反应。在本发明中，所述显色反应的温度优选为20～25℃；所述显色反应的时间优选为10min。
60.在所述显色反应后，本发明终止显色，在所述终止显色后，读取所述elispot孔板上的斑点数量，通过所述斑点数量的多少对猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的数量进行定量或者评估pcv2疫苗免疫效果；所述斑点数量为猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞的数量；所述斑点数量越多表示pcv2疫苗免疫效果越好。
61.在本发明中，斑点数量越多，说明记忆性b细胞数量越多，pcv2疫苗免疫效果越好。待检测的淋巴细胞数量是一定的，以待检测的淋巴细胞数量为106个为例，最后的结果以在这106个淋巴细胞中检测出pcv2特异性记忆b细胞数量的多少来判断疫苗的免疫效果，也可根据需要计算特异性记忆b细胞数量与淋巴细胞的总数量的比值。
62.在本发明中，所述终止显色的方式优选为使用流水冲洗终止显色；在所述终止显色后，优选的还包括将elispot孔板在避光处晾干；在所述终止显色后使用酶联免疫斑点分析仪读取所述elispot孔板上的斑点数量。
63.常规的抗体检测方法elisa是检测血液中循环中总的特异性抗体水平，但不能区分抗体是主动免疫产生还是被动获得。为了避免被动获得的pcv2母源抗体的干扰，需要一种更为可靠的以pcv2特异性记忆b细胞或记忆b细胞为检测指标的检测方法。
64.针对上述技术问题，本发明提供了一种elispot试剂盒，本发明的elispot试剂盒是基于酶联免疫吸附试验(elisa)原理并联合细胞培养技术的一种能在单细胞维度上检测细胞的体液免疫水平的技术，elispot检测原理图参见图1。本发明利用包被在elispot上的特异性抗原(上述方案所述蛋白组合)来捕获孵育在孔板内的猪圆环病毒2型特异性记忆b细胞分泌的抗体，并通过生物素-亲和素系统将酶联反应放大，后续通过底物进行化学显色将其进行“可视化”并在孔板内生成圆形斑点，每一个斑点等同于一个待检测的特异性记忆b细胞，最后通过显微镜或者elispot专用的读板仪器进行计数统计。
65.对猪圆环病毒而言，由b细胞产生的体液免疫水平对病毒血症控制和病毒清除起关键作用，因此诱导b细胞免疫反应的能力是pcv2候选疫苗免疫保护效力的重要指标。针对上述需求，本发明通过设计合理的实验方案，建立相应的酶联免疫斑点试验(elispot)方法，评估经刺激后产生pcv2-cap蛋白抗体的b细胞的水平，从而反映pcv2候选疫苗诱导的特异性记忆b细胞免疫反应的水平，通过检测特异性记忆b细胞有效避免了母源抗体的干扰，进而准确评估疫苗所诱导的免疫反应。
66.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
67.实施例1 pcv2a、pcv2b重组cap蛋白的制备
68.1)重组表达质粒的构建：根据genbank中pcv2a、pcv2d的基因序列，设计引物，引物
five细胞表达cap-2b、cap-2d重组蛋白(图2)，将重组蛋白cap-2b、cap-2d用ni
2
亲和层析法纯化(图3)。
81.实施例2
82.1.实验动物的分组、疫苗免疫及样品的采取
83.挑选20头pcv2病原阴性的4周龄仔猪分别打好耳标，分成2组，对照组注射等量生理盐水，免疫组注射商品化圆环疫苗。分别在免疫疫苗前(0天)、免疫疫苗后14天、免疫疫苗后28天，使用抗凝真空采血管通过前腔静脉采集抗凝全血3～5ml，轻微颠倒混匀，并记录相应耳标号，冰袋保存运输，采样到实验室间隔时间不超过6h。
84.2.elispot检测pcv2特异性记忆b细胞
85.将采集的抗凝全血用含有3％胎牛血清的pbs等比例稀释以降低血液中血细胞结团率；另取一支15ml离心管，吸取少量胎牛血清润洗管壁；将3ml淋巴细胞分离液(ficoll)加入离心管中，吸取3ml已稀释好的抗凝血贴近管壁并将离心管倾斜30
°
缓慢加入，室温下以550g水平离心20～30min，离心后会出现明显分层，在血浆层与分离液之间呈云雾状的白膜层为淋巴细胞层。缓慢吸取白膜层淋巴细胞加入到一支新的15ml离心管，加入3ml红细胞裂解液吹打重悬后在涡旋震荡仪震荡2min，4℃冰箱内静置10min后，室温300g水平离心10min。倒去离心管内液体，加入4ml含3％胎牛血清的pbs缓慢吹打重悬，300g水平离心10min，此操作重复3次。倒去离心管内液体，加入一定体积含有10％fbs、1％青霉素链霉素双抗的rpmi-1640培养基重悬细胞，进行活细胞计数，记录细胞数量后按相应细胞数量进行稀释，将重悬的细胞液铺于细胞培养板，加入终浓度为1μg/ml的r848，于37℃、5％co2细胞培养箱刺激培养三天后进行后续elispot检测操作。
86.具体如下：
87.1)elispot检测前，在无菌条件下以每孔加入15μl体积浓度为35％的乙醇水溶液到elispot的孔板中进行预激活以提高pvdf膜对抗原蛋白的结合能力，时间约为1min，然后每孔用200μl的灭菌超纯水洗涤孔板4遍。
88.2)将cap-2b、cap-2d蛋白放置在冰盒中回温，用0.01m pbs(ph7.4)将两种蛋白1:1混合稀释至浓度为1.25μg/ml，100μl每孔加入到elispot孔板中，4℃过夜(12～16h)。
89.3)倒去孔板中的液体，无菌pbs洗涤4遍，倒去最后一遍液体时在无菌纸上轻轻扣干孔板内水分。
90.4)每孔加入200μl含10％fbs、rpmi-1640培养基，37℃封闭2h。
91.5)倒去培养基，将刺激培养3天后的淋巴细胞洗涤后加入新的培养基重悬，重新计数后每孔加入适当的细胞数量，100μl/孔。在37℃、5％co2细胞培养箱孵育24h。
92.6)第三天，倒去孔板内细胞，无菌pbs洗涤4次，倒去最后一遍液体时在无菌纸上轻轻扣干孔板内水分。
93.7)将浓度为5μg/ml生物素化的羊抗猪igg以100μl每孔加入到elispot孔板内，室温(20～25℃)孵育2h。
94.8)按步骤6)的操作洗涤，将浓度为0.25μg/ml hrp标记的链霉亲和素以100μl每孔加入到elispot孔板内，室温(20～25℃)孵育1h。
95.9)按步骤6)的操作洗涤，将aec显色液每孔100μl加入到elispot孔板中，室温显色10min，使用流水直接冲洗终止显色。
96.10)将elispot板在避光处晾干，使用酶联免疫斑点分析仪读板计数。
97.11)通过对斑点数量的多少对记忆b细胞的数量进行定量，评估疫苗的免疫效果。
98.对比例1
99.elisa检测pcv2特异性血清抗体
100.实验动物的分组、疫苗免疫及样品的采取同实施例2。
101.(1)抗原包被：将制备保存的两种cap蛋白分别用0.05m碳酸盐缓冲液(ph9.6)稀释到1μg/ml，等量混合后以100μl/孔加入到96孔酶标板中，用塑封袋密封，置于4℃冰箱包被过夜(16～24h)；
102.(2)封闭干燥及保存：待包被完成后，倒去孔内液体，于干燥的无尘纸上拍干孔内残留水分，以110μl/孔加入封闭液，用塑封袋密封后放置在37℃恒温箱中孵育30min，待孵育结束后倒去孔内液体，在干燥的无尘纸上排干孔内残留水分，置于37℃恒温箱中进行干燥，时间为3h，干燥后的孔板便可直接进行下一步实验。(如需保存可放置干燥剂后置于塑封袋中4℃密封保存)；
103.(3)样品处理：在样品稀释板中用血清稀释液将待检的血清样品进行一定比例浓度的稀释，放置在微量震荡仪上充分震荡混匀，混匀后的血清样品以100μl/孔加入到抗原包被中，塑封袋密封后放置在37℃恒温箱中孵育1h；
104.(4)洗涤：倒去孔内液体，以250～300μl/孔加入含0.05％吐温-20(体积比)的pbs(ph7.4)洗涤液(pbst)洗涤，该洗涤操作重复4次，完成最后一次洗涤时，需将孔板内残留水分在干燥的无尘纸上拍干。
105.(5)酶标二抗孵育：以100μl/每孔加入浓度为5μg/ml的hrp标记的羊抗猪igg，放置在塑封袋中37℃密封孵育30min；
106.(6)洗涤：方法见步骤(4)；
107.(7)tmb底物显色：以50μl/孔加入tmb底物，塑封袋密封后置于37℃避光孵育15min；
108.(8)终止显色：以50μl/孔加入终止液终止显色，放置于酶标仪中测定450nm吸光度。
109.通过本发明建立的elispot方法与现有的elisa方法，对存在高母源抗体仔猪免疫商品化疫苗后的pcv2特异性抗体水平和记忆b细胞水平进行对比检测。首先通过elisa方法检测抗体水平，结果表明，未免疫疫苗组与免疫疫苗组的pcv2抗体都呈降低趋势，因此通过elisa测定抗体水平并不能判断疫苗是否诱导产生有效的免疫应答(图4)；而利用elispot检测pcv2特异性记忆b细胞水平，结果表明对照组免疫前后的记忆b细胞数量都很少且无明显差异，而免疫组在免疫后14、28天的特异性记忆b细胞较免疫当天有明显上升，能够较好的反映疫苗诱导的体液免疫水平(图5)。综合表明，elispot方法可以用于pcv2疫苗免疫效果评价，对指导pcv2的防控具有重要意义。
110.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。