无支架组织结构的制作方法

1.本发明涉及组织工程领域，特别是涉及一种无支架组织结构的制作方法。


背景技术：

2.当前组织工程(te)的方法主要由两种截然不同且有些相反的策略代表。基于支架的方法依赖于使用支持活细胞附着、增殖和形成3d组织的“模板”。在过去几十年中，研究人员利用生物支架试图培育出皮肤和软骨、骨骼和软骨、肝脏、心脏瓣膜和动脉、膀胱、胰腺、神经、角膜和各种其他软组织。支架设计和制造是生物材料研究的主要热点，也是组织工程和再生医学研究的重要课题。在生物医学应用中，作为支架的材料，需要考量它们的化学性质、分子量、溶解度、形状和结构、亲水性/疏水性、润滑性、表面能、吸水降解和侵蚀机制等。然而基于支架的方法存在以下问题：支架中的细胞重组不仅无法代替天然组织，且存在一些局限性，例如生物材料及其副产物的毒性、对细胞不友好的交联剂、生物材料降解与新组织形成的不平衡速率、限制培养细胞的数量等。另一方面，用生物材料固定细胞会限制细胞间的相互作用并减慢细胞成熟。
3.无支架生物打印被认为是组织制造的一个有前途的方向，因为它们是完全生物和生物相容的细胞聚集体，可以提高细胞密度，促进ecm(细胞外基质)的沉积，具有更好的细胞间相互作用。将细胞扩散到3d环境中时，能够诱导快速分化并加速组织成熟，保持细胞功能更长时间，并提供紧密的仿生微环境，增加ecm产量，最大限度地减少调节周围环境的时间。“无支架”是一种自下而上的策略，主要培养技术有：单层细胞培养技术、聚集培养技术、沉淀培养技术，通过上述培养技术得到细胞球聚体、细胞片或组织链作为三维结构的构建块。组织链是通过将高密度细胞填充并注入具有渗透性和机械性能的中空管中产生，最后将管道去除得到长径比较大的细胞聚集体，这些组织链表现出高细胞活力和圆滑度、充分且快速地融合、复杂自组装以及细胞特异性功能标志物表达的能力。尽管这种将细胞悬液注入预设管道的方法可以得到长径比较大的组织链，但是在注射过程中，细胞会受到针头剪切力的损伤，降低其存活率。当构建大型结构时，要制作大量管道模型以满足需求，但制作预设管道以及注射细胞都需要时间，因此会大大降低组织构建的效率。


技术实现要素：

4.基于此，有必要提供一种效率高、细胞存活率高的无支架组织结构的制作方法，该方法所制作的无支架组织结构能够用于构造大型三维结构。
5.一种无支架组织结构的制作方法，包括如下步骤：
6.提供生物墨水和接收基质，所述生物墨水中含有二价阳离子和细胞，所述接收基质包括含有羧基的聚合物，所述二价阳离子能够与所述含有羧基的聚合物发生交联形成凝胶；
7.将所述生物墨水在所述接收基质中进行嵌入式3d打印，得到外层为凝胶层的打印结构，所述凝胶层的厚度为150μm～250μm；
8.对所述打印结构进行细胞培养，使所述细胞融合成组织；及
9.去除所述凝胶层，得到无支架组织结构。
10.在其中一个实施例中，嵌入式3d打印过程中的打印速度为800mm/min～2000mm/min；及/或，
11.嵌入式3d打印过程中的泵出压力为0.1bar～1bar；及/或，
12.嵌入式3d打印过程中的针头规格为21g～27g。
13.在其中一个实施例中，所述二价阳离子为钙离子和/或钡离子；及/或，
14.所述含有羧基的聚合物选自海藻酸盐、明胶及透明质酸中的至少一种。
15.在其中一个实施例中，所述二价阳离子以可溶性盐的形式加入所述生物墨水中，在所述生物墨水中，所述二价阳离子的可溶性盐的质量百分比为3％～5％；及/或，
16.在所述生物墨水中，细胞的密度为1
×
107个/ml～1
×
108个/ml；及/或，
17.在所述接收基质中，所述含有羧基的聚合物的质量百分比为1.5％～3％。
18.在其中一个实施例中，将所述生物墨水在所述接收基质中进行嵌入式3d打印的时间为2min～3min。
19.在其中一个实施例中，去除所述凝胶层的步骤包括：
20.将进行细胞培养后的所述打印结构浸在柠檬酸钠溶液中，使所述凝胶层溶解。
21.在其中一个实施例中，所述柠檬酸钠溶液的质量浓度为1.5％～2％。
22.在其中一个实施例中，所述生物墨水中还含有流变性调节剂。
23.在其中一个实施例中，在所述生物墨水中，所述流变性调节剂的质量百分比为2％～4％；及/或，
24.所述流变性调节剂包括聚丙烯酰胺及聚乙二醇中的至少一种。
25.在其中一个实施例中，对所述打印结构进行细胞培养的步骤包括：
26.将所述打印结构置于37℃的培养箱中培养5天～7天，每隔1天～2天更换一次培养液。
27.在其中一个实施例中，所述生物墨水和所述接收基质所用的溶剂均为磷酸盐缓冲液；及/或，
28.所述细胞为3t3细胞或者hela细胞。
29.在其中一个实施例中，所述无支架组织结构为链状结构，内径为200μm～1500μm。
30.上述无支架组织结构的制作方法将含有二价阳离子和细胞的生物墨水在包括含有羧基的聚合物的接收基质中进行嵌入式3d打印，使二价阳离子与含有羧基的聚合物交联形成凝胶层，细胞包覆在凝胶层的内部，然后对细胞进行细胞培养，使细胞融合成组织，最后去除凝胶层，得到无支架组织结构。实验证明，凝胶层的厚度会影响打印结构培养过程中细胞与外界的氧气、养料和废物交换。凝胶层的厚度太厚，细胞获取营养物质不及时会造成内部细胞死亡；凝胶层的厚度太薄，无法将细胞限制住，撑破凝胶层则无法形成组织结构。另外，上述制作方法不需要预先制作管道，也不需要进行额外地细胞注射，大幅提高了细胞存活率，同时通过调整3d打印过程中的工艺参数，能高效率地产出可被设计长径比的组织结构并用于构造大型三维结构。
附图说明
31.图1为一实施方式的无支架组织结构的制作方法的工艺流程图；
32.图2为实施例9步骤(3)所得到的打印结构的内部表面形貌图；
33.图3为实施例9步骤(3)所得到的打印结构的外部表面形貌图；
34.图4为对实施例1步骤(3)所得到的打印结构进行染料灌注，不同时间内的染料灌注情况图；
35.图5为在显微镜下观察到不同时间的细胞培养情况图；
36.图6为实施例1所制备的无支架组织结构的细胞存活情况图；
37.图7为不同实施例中打印速度与所制作的无支架组织结构的内径的关系图；
38.图8为不同实施例中泵出压力与所制作的无支架组织结构的内径的关系图；
39.图9为不同实施例中针头规格与所制作的无支架组织结构的内径的关系图。
具体实施方式
40.为了便于理解本发明，下面将结合具体实施方式对本发明进行更全面的描述。具体实施方式中给出了本发明的较佳的实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
41.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体地实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
42.无支架生物打印能够通过不同的培养技术得到细胞球聚体、细胞片或组织链作为三维结构的构建块。其中，生产细胞球聚体的方法主要包括：(1)悬滴法：将细胞悬液分配到培养板的盖面上，然后将盖倒置，由于表面张力和重力，细胞悬浮液的液滴保持附着、自组装，最终在液滴底部形成细胞球聚体。(2)磁悬浮法：目标细胞被生物相容性磁性纳米粒子(如氧化铁)标记，然后施加外部磁场，这种磁力将磁化的细胞聚集在培养基中，最后形成细胞球聚体。(3)旋转烧瓶法：将细胞悬液倒入转瓶中，然后通过叶轮或磁力搅拌连续生成细胞球聚体。搅拌速度和培养时间都对球聚体的大小至关重要，搅拌速度过慢会导致球聚体沉降，但搅拌速度过快会因流体剪切应力而导致细胞损伤。(4)微流控法：利用微坑使细胞沉降，在重力作用下形成细胞球聚体；细胞被注入到水溶液的两个不同相中，利用渗透效应触发聚集。细胞片的构建主要是基于敏感性材料所构建的培养基底，通过改变温度、酶、光、离子、氧化还原ph、糖等刺激因素，调节基底对细胞的粘附行为使细胞发生自然脱附，从而获取细胞片。以上两种基础构建块已经被广泛用于无支架的生物墨水中，但是从组织工程的角度来说仍具有一些局限性。形成的球状聚集体可能具有不规则的几何形状和尺寸，弱的可重复性，在制造放大组织中有困难，此外细胞聚集体之间缺乏接触会影响空间放置和融合的精度，球体之间的间隙可能会影响自组装和成熟过程，导致组织再生失败。细胞片的收获时间可能较长，存在细胞衰亡的风险，影响细胞的活性。采用细胞片叠加形成复杂的三维组织，需要大量细胞片，而目前细胞片的大批量生产仍然存在问题。由于缺乏功能性血管，目前多层细胞片的厚度受到了限制，有可能使内部细胞缺乏氧气和营养物质，导致细胞
死亡。
43.而组织链能够表现出高细胞活力和圆滑度、充分且快速地融合、复杂自组装以及细胞特异性功能标志物表达的能力。然而传统的组织链的制作方法存在方法复杂、效率低、细胞存活率低的问题，基于此，本发明提供了一种新的组织链的制作方法。
44.具体地，请参阅图1，一实施方式的无支架组织结构的制作方法，包括如下步骤：
45.步骤s110：提供生物墨水和接收基质，生物墨水中含有二价阳离子和细胞，接收基质中含有羧基的聚合物，二价阳离子能够与含有羧基的聚合物发生交联形成凝胶。
46.具体地，二价阳离子为钙离子和/或钡离子。由于钡离子具有一定毒性，在本实施方式中，二价阳离子优选为钙离子。在一个具体的示例中，二价阳离子以可溶性盐的形式加入生物墨水中，例如氯化钙。
47.进一步地，在生物墨水中，二价阳离子的可溶性盐的质量百分比为3％～5％。在一个具体的示例中，二价阳离子的可溶性盐的质量百分比为3％、3.5％、4％、4.5％、5％或这些取值中任意两者所组成的范围。通过调节含有羧基的聚合物与二价阳离子的浓度能够调控所生成的凝胶层的厚度与机械强度。另外，二价阳离子如钙离子浓度过高，可能会导致细胞钙离子中毒，因此，在本实施方式的生物墨水中，二价阳离子的可溶性盐的质量百分比为3％～5％。
48.在一些实施例中，在生物墨水中，细胞的密度为1
×
107个/ml～1
×
108个/ml。一般的细胞打印密度数量级在106个/ml，而在本实施方式中，生物墨水中的细胞密度更大，这是由于在本实施方式的打印结构中，细胞被包覆在凝胶层内部，流动性好，因而可以在更大的密度下存活，而传统的打印结构中，细胞与凝胶材料混在一起，限制了细胞的流动。
49.具体地，细胞为3t3细胞或者hela细胞。上述细胞容易获取且繁殖快。
50.进一步地，在生物墨水中，上述细胞为经过离心处理，去除上清液后的细胞沉淀。在实际处理过程中，还可以对细胞进行染色标记，以定位细胞。在一个具体的示例中，标记细胞膜蛋白的探针did或标记细胞核的染料dapi对细胞进行染色标记，可以理解，对细胞进行染色标记的方法并不限于此，还可以为其他探针或染料，只要能定位细胞即可。
51.在一些实施例中，生物墨水中还含有流变性调节剂。流动性调节剂用于调节生物墨水的流变性，如粘度、粘弹性等，以使生物墨水能够用于3d打印。具体地，流变性调节剂包括聚丙烯酰胺及聚乙二醇中的至少一种。可以理解，流变性调节剂并不限于此，还可以为本领域常用的其他流变性调节剂。
52.具体地，在生物墨水中，流变性调节剂的质量百分比为2％～4％。在一个具体的示例中，流变性调节剂的质量百分比为2％、2.5％、3％、3.5％、4％或这些取值中任意两者所组成的范围。
53.在一些实施例中，生物墨水所用的溶剂为磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液具有盐平衡、可调整的适宜ph缓冲作用，能够保证细胞活性。
54.在一些实施例中，含有羧基的聚合物选自海藻酸盐、明胶及透明质酸中的至少一种。优选地，含有羧基的聚合物为海藻酸盐。在一个具体的示例中，海藻酸盐为海藻酸钠。以含有羧基的聚合物作为接收基质，例如海藻酸钠等，其溶液是具有粘性，以及是剪切变稀的屈服应力流体，这种流体的特性足以支撑打印在其中的结构，但二价阳离子水溶液是不具有以上特性的，所以无法支撑打印出来的结构，就无法形成组织链的形状。因此，在本实施
方式中，以含有羧基的聚合物作为接收基质，以含有二价阳离子和细胞的溶液作为生物墨水。
55.具体地，在接收基质中，含有羧基的聚合物的质量百分比为1.5％～3％。在一个具体的示例中，含有羧基的聚合物的质量百分比为1.5％、2％、2.5％、3％或这些取值中任意两者所组成的范围。
56.进一步地，在其中一个实施例中，生物墨水中含有氯化钙、细胞和聚丙烯酰胺。在生物墨水中，氯化钙的质量百分比为3％～5％，细胞的密度为1
×
107个/ml～1
×
108个/ml，聚丙烯酰胺的质量百分比为2％～4％。接收基质中含有海藻酸钠，海藻酸钠的质量百分比为1.5％～3％。在一个具体的示例中，在生物墨水中，氯化钙的质量百分比为5％，细胞的密度为6
×
107个/ml，聚丙烯酰胺的质量百分比为3％。在接收基质中，海藻酸钠的质量百分比为3％。
57.具体地，接收基质所用的溶剂为磷酸盐缓冲液(pbs)。
58.步骤s120：将生物墨水在接收基质中进行嵌入式3d打印，得到外层为凝胶层的打印结构，凝胶层的厚度为150μm～250μm。
59.在一些实施例中，嵌入式3d打印过程中的打印速度为800mm/min～2000mm/min。例如，打印速度为800mm/min、900mm/min、1000mm/min、1200mm/min、1500mm/min、1800mm/min、2000mm/min等。进一步地，嵌入式3d打印过程中的打印速度为1500mm/min～2000mm/min。通过控制打印速度能够调整所制备的无支架组织结构的内径。在其他条件不变的情况下，打印速度越大，所制备的无支架组织结构的内径越小。
60.在一些实施例中，嵌入式3d打印过程中的泵出压力为0.1bar～1bar。例如，泵出压力为0.1bar、0.2bar、0.3bar、0.4bar、0.5bar、0.6bar、0.7bar、0.8bar、0.9bar、1bar等。进一步地，嵌入式3d打印过程中的泵出压力为0.1bar～0.4bar。通过控制泵出压力能够调整所制备的无支架组织结构的内径。在其他条件不变的情况下，泵出压力越大，所制备的无支架组织结构的内径越大。
61.在一些实施例中，嵌入式3d打印过程中的针头规格为21g～27g。例如，针头规格为21g、22g、23g、24g、25g、26g、27g等。进一步地，嵌入式3d打印过程中的针头规格为25g～27g。通过控制针头规格能够调整所制备的无支架组织结构的内径。在其他条件不变的情况下，针头尺寸越小，所制备的无支架组织结构的内径越小。
62.在一些实施例中，在接收基质中进行嵌入式3d打印的时间为2min～3min。通过调节含有羧基的聚合物与二价阳离子反应时间来调控所生成的水凝胶的厚度与机械强度。
63.进一步地，凝胶层的厚度为150μm～250μm。在一个具体的示例中，凝胶层的厚度为150μm、180μm、200μm、220μm、250μm或这些取值中任意两者所组成的范围。实验证明，凝胶层的厚度会影响组织结构培养过程中细胞与外界的氧气、养料和废物交换。凝胶层的厚度太厚，细胞获取营养物质不及时会造成内部细胞死亡；凝胶层的厚度太薄，无法将细胞限制住，撑破凝胶层则无法形成组织结构。因此，在本实施方式中，凝胶层的厚度设置为150μm～250μm。
64.采用嵌入式3d打印，生物墨水在接触接收基质时发生交联，从而形成外层为凝胶层，内部为细胞的中空结构。而采用其他打印方式，如挤出式打印是生物支架材料和细胞混合作为生物墨水的，无法得到无支架组织结构。
65.步骤s130：对打印结构进行细胞培养，使细胞融合成组织。
66.具体的细胞培养可以为本领域常用的技术。例如，在其中一个实施例中，对打印结构进行细胞培养的步骤包括：
67.将打印结构置于37℃的培养箱中培养5天～7天，每隔1天～2天更换一次培养液。
68.进一步地，在步骤s120之后，在步骤s130之前，还包括对打印结构进行清洗的步骤。具体地，采用磷酸盐缓冲液对打印结构进行清洗2次～3次。
69.步骤s140：去除凝胶层，得到无支架组织结构。
70.在一些实施例中，去除凝胶层的步骤包括：
71.将细胞培养后的打印结构浸在柠檬酸钠溶液中，使凝胶层溶解。加入柠檬酸钠溶液能够与二价阳离子结合，破坏二价阳离子与羧基之间的相互作用，从而去除凝胶层。例如，二价阳离子为钙离子，含有羧基的聚合物为海藻酸盐，由于海藻酸钙呈弱碱性，柠檬酸钠呈弱酸性，二者之间可以发生弱酸和弱碱的反应。
72.具体地，柠檬酸钠溶液的质量浓度为1.5％～2％。例如，柠檬酸钠溶液的质量浓度为1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％或2％。
73.在一些实施例中，无支架组织结构为链状结构，内径为200μm～1500μm，以满足各种场景下的需求。进一步地，内径为200μm～500μm。在上述内径范围内，内部细胞的氧气与养料获取更充分，细胞存活率更高。
74.进一步地，在步骤s130之后，在步骤s140之前，还包括对细胞培养后的打印结构进行清洗的步骤。具体地，采用磷酸盐缓冲液对细胞培养后的打印结构进行清洗2次～3次。
75.进一步地，在一些实施例中，在去除凝胶层的步骤之后，还包括对无支架组织结构进行清洗的步骤。具体地，采用磷酸盐缓冲液对无支架组织结构进行清洗2次～3次。
76.上述无支架组织结构的制作方法至少具有以下优点：
77.(1)上述无支架组织结构的制作方法对含有二价阳离子和细胞的生物墨水进行嵌入式3d打印，用含有羧基的聚合物的接收基质交联固化，在外层形成凝胶层，细胞包覆在凝胶层的内部，然后对细胞进行细胞培养，使细胞融合成组织，最后去除凝胶层，得到无支架组织结构。实验证明，凝胶层的厚度会影响组织结构培养过程中细胞与外界的氧气、养料和废物交换。凝胶层的厚度太厚，细胞获取营养物质不及时会造成内部细胞死亡；凝胶层的厚度太薄，无法将细胞限制住，撑破凝胶层则无法形成组织结构。另外，上述制作方法不需要预先制作管道，也不需要进行额外地细胞注射，大幅提高了细胞存活率，同时能高效率地产出可被设计长径比的组织结构并用于构造大型三维结构。
78.(2)上述无支架组织结构的制作方法还可以通过调控3d打印过程中的打印速度、泵出压力和针头规格调整所制作的无支架组织结构的内径，得到内径可调且连续的无支架组织结构。
79.(3)上述无支架组织结构的制作方法能够简单高效地产出高细胞密度的结构。
80.为了使本发明的目的以及优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明的无支架组织结构的制作方法及其效果做进一步详细的说明，应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不得用以限定本发明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产
厂家推荐的方法实现。
81.实施例1
82.本实施例的无支架组织结构的制作过程具体如下：
83.(1)称取适量的无水氯化钙和非离子型pam(聚丙烯酰胺)溶于pbs中，得到氯化钙质量分数为5％，pam质量分数为3％的pbs溶液。称取适量的海藻酸钠，充分溶于pbs中，得到海藻酸钠质量分数为3％的溶液作为接收基质。
84.(2)将从培养箱中取出的3t3细胞进行dapi荧光染色，将细胞核标记成蓝色，再以400g的转速离心，去除上清液得到细胞沉淀，进行计数后重悬于步骤(1)的含有氯化钙和pam的pbs溶液中，得到生物墨水，在生物墨水中，细胞的密度为6
×
107个/ml。
85.(3)将预先编写好的gcode代码导入打印机中(打印机型号为allevi 2 3d bioprinter)，调整打印速度为800mm/min，泵出压力为0.7bar，针头规格为25g打印预设尺寸的细胞链条，在接收基质中进行交联固化2min，得到外层为厚度220μm的凝胶层的打印结构。
86.(4)将打印结构捞出，使用pbs清洗2次，将其浸泡在培养基中，放入细胞培养箱进行为期7d的培养，每隔1d更换一次培养液。
87.(5)将细胞培养后的打印结构捞出，使用pbs清洗2次，将其浸泡在配制好的质量浓度为1.5％的柠檬酸钠溶液中，待外层水凝胶完全溶解后将组织结构捞出，并放入pbs中清洗2次，得到本实施例的无支架组织结构。
88.实施例2～实施例24
89.实施例2～实施例24与实施例1的区别在于，打印过程中的工艺参数不同，具体如下表1所示。
90.表1
[0091][0092]
实施例25
[0093]
本实施例与实施例1的区别在于，用明胶代替海藻酸钠，其他步骤与实施例1相同。
[0094]
实施例26
[0095]
本实施例与实施例1的区别在于，用透明质酸代替海藻酸钠，其他步骤与实施例1相同。
[0096]
以下为测试部分：
[0097]
实施例9步骤(3)所得到的打印结构的表面形貌图如图2和图3所示，图2聚焦在打印结构的内部，由图2中可以看出，打印结构尺寸均匀且内壁表面光滑平整。图3聚焦在凝胶层也就是打印结构的外壁，由图3中可以看出，打印结构表面交联成网状结构。
[0098]
对实施例1步骤(3)所得到的打印结构进行染料灌注，不同时间内的染料灌注情况如图4所示。从图4中可以看出，打印结构为空心，并且具备一定的机械性能。
[0099]
将实施例1步骤(3)所得到的打印结构进行细胞培养，在显微镜下观察到不同时间的细胞培养情况如图5所示。从图5中可以看出，培养3天后，显微镜下观察细胞有成团趋势。
[0100]
采用cck0-8法细胞增殖试剂盒测定实施例1所制备的无支架组织结构的细胞存活情况，得到如图6所示数据：
[0101]
从图6中可以看出，细胞活性保持率在80％以上，证明细胞存活情况良好。
[0102]
以实施例1～12制作过程中所用的打印速度为横坐标，所制作的无支架组织结构的内径为纵坐标作图，得到图7。从图7中可以看出，在其他条件不变的情况下，随着打印速度的增加，无支架组织结构的内径呈递减趋势。
[0103]
以实施例1、实施例13～21制作过程中所用的泵出压力为横坐标，所制作的无支架组织结构的内径为纵坐标作图，得到图8。从图8中可以看出，在其他条件不变的情况下，随着泵出压力的增加，组织链的内径呈递增趋势。
[0104]
以实施例1、实施例22～24制作过程中所用的针头规格为横坐标，所制作的无支架组织结构的内径为纵坐标作图，得到图9。从图9中可以看出，在其他条件不变的情况下，随着针头尺寸的减小，组织链的内径呈递减趋势。
[0105]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0106]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。