用于抑制β-ENaC表达的RNAi试剂、其组合物和使用方法与流程

用于抑制
β-enac表达的rnai试剂、其组合物和使用方法
1.相关申请的交叉引用本技术要求于2020年5月14日提交的美国临时专利申请序列号63/024,722、以及于2019年10月29日提交的美国临时专利申请序列号62/927,637的优先权，所述美国临时专利申请各自的内容通过引用以其整体并入本文。
2.序列表本技术含有序列表，所述序列表已以ascii格式提交，并且在此通过引用以其整体并入。ascii副本命名为30678-wo_seqlist.txt，且大小为65 kb。
技术领域
3.本公开内容涉及用于抑制β-enac基因表达的rna干扰(rnai)试剂例如双链rnai试剂，包括β-enac rnai试剂的组合物及其使用方法。


背景技术：

4.脊椎动物阿米洛利敏感性上皮钠通道(“enac”或“阿米洛利敏感性钠通道”)是退化蛋白/enac通道超家族的成员，其特点在于细胞内n末端和c末端的两个跨膜结构域、以及其为弗林蛋白酶底物的大细胞外环。该通道是由三种分开的基因编码的三种同源亚基(alpha (α)、beta (β)和gamma (γ))组成的异源三聚体复合物：scnn1a (α)、scnn1b (β)和scnn1g (γ)。所有三种亚基是完全通道活性所需的。由scnn1d编码的第四种亚基(delta (δ))在睾丸和卵巢中表达，并且可能能够在功能上取代这些组织中的alpha (α)亚基。
5.enac在上皮细胞的顶膜上表达，所述上皮细胞特别是在肺、肾远曲小管、胃肠(gi)道、生殖道和眼中的眼表面上皮中。在这些上皮细胞中，enac通道介导细胞外钠离子的流入，所述钠离子然后通过基底外侧钠/钾atp酶从细胞中主动转运，建立渗透梯度并促使上皮腔内的水被吸收到间质内。在肾中，enac介导电解质平衡和血压，并且是全身性小分子利尿剂如阿米洛利的靶。在肺中，气道上皮enac在肺水合的调控和粘液纤毛清除中起关键作用。
6.携带scnn1a、scnn1b或scnn1g中的功能丧失突变的1型假性醛固酮减少症(pha)患者产生过多的气道表面液体，并且具有显著更高的粘液纤毛清除率。相反，气道上皮enac活性在所有基因型的囊性纤维化(cf)患者中都显著升高。增强的enac活性，连同降低的囊性纤维化跨膜传导调节因子(cftr)氯离子通道活性一起，是成为cf肺病患者中的气道脱水和粘液纤毛淤滞的基础的主要致病机制。
7.吸入性小分子enac抑制剂已显示了在cf治疗中的初步前景，但它们的临床发展已受到肺中的短作用持续时间以及与肾enac抑制相关的中靶毒性(高钾血症)的限制。(参见例如，o’riordan等人，27 j. aerosol med. & pulmonary drug dev.，200-208 (2014))。
8.能够抑制β-enac基因(即scnn1b)表达的某些rnai试剂先前已得到鉴定，例如美国专利号8,344,127中公开的那些rnai试剂。然而，具有不同序列和某些化学修饰的其它rnai试剂构建体可能具有优越的治疗性质，其可以用于更有效的治疗中。仍然存在关于具有更
enac基因的一部分。
16.在另一个方面，本公开内容的特点在于组合物，包括药物组合物，其包括能够选择性地和有效地减少β-enac基因表达的一种或多种公开的β-enac rnai试剂。包含本文所述的一种或多种β-enac rnai试剂的组合物可以施用于受试者，例如人或动物受试者，用于治疗(包括预防性治疗或抑制)与增强或升高的enac活性(在本文中也称为增强的enac通道活性水平或升高的enac通道活性水平)相关的症状和疾病。
17.表3和4中提供了可以用于β-enac rnai试剂中的β-enac rnai试剂的有义链和反义链的实例。表5a和5b中提供了β-enac rnai试剂双链体的实例。表2中提供了可以由本文公开的某些β-enac rnai试剂的有义链和反义链组成、或者可以包括在其中的19核苷酸核心段序列的实例。
18.在另一个方面，本公开内容的特点在于用于在体内将β-enac rnai试剂递送至受试者(例如哺乳动物)的上皮细胞的方法。本文还描述的是用于此类方法中的组合物。在一些实施方案中，本文公开的是用于在体内将β-enac rnai试剂递送至受试者的肺上皮细胞的方法。在一些实施方案中，受试者是人受试者。
19.本文公开的方法包括通过本领域已知的任何合适的手段，将一种或多种β-enac rnai试剂施用于受试者，例如人或动物受试者。本文公开的包括一种或多种β-enac rnai试剂的药物组合物可以以多种方式进行施用，取决于是需要局部治疗还是需要全身治疗。施用可以是但不限于例如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、真皮下(例如，经由植入装置)和实质内施用。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物通过吸入(例如干粉吸入或气溶胶吸入)、鼻内施用、气管内施用或口咽抽吸施用进行施用。
20.在一些实施方案中，期望本文所述的β-enac rnai试剂抑制肺上皮中的β-enac基因表达，对于其施用是通过吸入 (例如，通过吸入器装置例如计量吸入器，或喷雾器例如喷射或振动网孔喷雾器，或软雾吸入器)。
21.可以使用本领域已知的任何寡核苷酸递送技术，将一种或多种β-enac rnai试剂递送至靶细胞或组织。在一些实施方案中，通过将rnai试剂与靶向基团共价连接，将β-enac rnai试剂递送至细胞或组织。在一些实施方案中，靶向基团可以包括细胞受体配体，例如整联蛋白靶向配体。整联蛋白是促进细胞外基质(ecm)粘附的跨膜受体家族。特别地，整联蛋白β-v-β-6 (αvβ6)是一种上皮特异性整联蛋白，其已知为ecm蛋白和tgf-β潜在相关肽(lap)的受体，并且在各种细胞和组织中表达。已知整联蛋白αvβ6在受损的肺上皮中高度上调。在一些实施方案中，本文所述的β-enac rnai试剂连接到对于整联蛋白αvβ6具有亲和力的整联蛋白靶向配体。如本文提及的，“αvβ6整联蛋白靶向配体”是对于整联蛋白αvβ6具有亲和力的化合物，其可以用作配体，以促进它与之附着的rnai试剂靶向和递送至所需细胞和/或组织(即，表达整联蛋白αvβ6的细胞)。在一些实施方案中，多个αvβ6整联蛋白靶向配体或αvβ6整联蛋白靶向配体簇连接到β-enac rnai试剂。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂-αvβ6整联蛋白靶向配体缀合物通过受体介导的内吞作用或通过其它手段被肺上皮细胞选择性地内化。
22.可用于递送包括αvβ6整联蛋白靶向配体的β-enac rnai试剂的靶向基团的实例公开于例如国际专利申请公开号wo 2018/085415和国际专利申请公开号wo 2019/089765中，所述国际专利申请各自的内容通过引用以其整体并入本文。
23.靶向基团可以连接到β-enac rnai试剂的有义链或反义链的3'或5'端。在一些实施方案中，靶向基团连接到有义链的3'或5'端。在一些实施方案中，靶向基团连接到有义链的5'端。在一些实施方案中，靶向基团内部连接到rnai试剂的有义链和/或反义链上的核苷酸。在一些实施方案中，靶向基团经由接头连接到rnai试剂。
24.在另一个方面，本公开内容的特点在于包括一种或多种β-enac rnai试剂的组合物，所述β-enac rnai试剂具有表5a和5b中公开的双链体结构。
25.β-enac rnai试剂的使用提供了用于治疗性(包括预防性)治疗疾病或病症的方法，对于所述疾病或病症，enac活性的降低可以提供治疗益处。本文公开的β-enac rnai试剂可以用于治疗各种呼吸系统疾病，包括囊性纤维化、慢性支气管炎、非囊性纤维化支气管扩张、慢性阻塞性肺病(copd)、哮喘、呼吸道感染、原发性纤毛运动障碍和肺癌囊性纤维化。β-enac rnai试剂可以进一步用于治疗例如各种眼部疾病和病症，例如干眼症。此类治疗方法包括将β-enac rnai试剂施用于具有升高或增强的enac活性水平的人类或动物。
26.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与选自以下的核苷酸序列(5
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)相差0或1个核碱基的核碱基序列：aagucgaugaugaucucccca (seq id no:194)；aguugaagauguaacaguugc (seq id no:195)；uuguuguagucacuguagacg (seq id no:198)；uuguuguagucacuguagaag (seq id no:244)；ucguguuguagucacuguagg (seq id no:199)；uguuguugcaguauuucuccc (seq id no:201)；和uguugaagauguaacaguugc (seq id no:203)。
27.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与选自以下的核苷酸序列(5
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)相差不多于1个核苷酸的核苷酸序列：aagucgaugaugaucucccca (seq id no:194)；aguugaagauguaacaguugc (seq id no:195)；uuguuguagucacuguagacg (seq id no:198)；uuguuguagucacuguagaag (seq id no:244)；ucguguuguagucacuguagg (seq id no:199)；uguuguugcaguauuucuccc (seq id no:201)；和uguugaagauguaacaguugc (seq id no:203)；其中所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。
28.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与选自以下的核苷酸序列(5
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)相差0或1个核碱基的核碱基序列：aagucgaugaugaucucccca (seq id no:194)；aguugaagauguaacaguugc (seq id no:195)；uuguuguagucacuguagacg (seq id no:198)；
gscaacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:237)；(v)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) asafsgsufcgfaufgafugfaufcufccfccfsa (seq id no:126)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) usggggagaufcfafucauciacuu (seq id no:238)；(vi)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpusgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:138)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gscaacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:239)；(vii)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gsca_2nacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:240)；(viii)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpasgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:153)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gscaacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:237)；(ix)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gscaacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:239)；(x)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpagfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:154)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gsca_2nacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:240)；或(xi)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gsca_2nacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:241)；其中a、c、g、i和u分别代表2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基肌苷和2'-o-甲基尿苷；af、cf、gf和uf分别代表2
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氟腺苷、2
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氟胞苷、2
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氟鸟苷和2
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氟尿苷；cprpa和cprpu分别代表5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷和5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷，并且s代表硫代磷酸酯键。
31.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括：(i)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) usufsgsufugfuafgufcafcufgufagfacfsg (seq id no:130)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) csgucuacagfufgfacuacaacaa (seq id no:234)；(ii)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) uscfsgsufgufugfuafgufcafcufgufagfsg (seq id no:131)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cscuacagugfafcfuacaacacia (seq id no:235)；(iii)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) usgfsusufgufugfcafgufaufuufcufccfsc (seq id no:135)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gsggagaaaufafcfugcaacaaca (seq id no:236)；(iv)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gscaacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:237)；(v)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) asafsgsufcgfaufgafugfaufcufccfccfsa (seq id no:126)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) usggggagaufcfafucauciacuu (seq id no:238)；(vi)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpusgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:138)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gscaacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:239)；(vii)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gsca_2nacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:240)；(viii)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpasgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:153)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gscaacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:237)；(ix)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gscaacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:239)；(x)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpagfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:154)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gsca_2nacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:240)；或(xi)由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的反义链：修饰的核苷酸序列(5
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) cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)，以及由以下组成、基本上由以下组成或包含以下的有义链：修饰的核苷酸序列(5
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) gsca_2nacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:241)；
其中a、c、g、i和u分别代表2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基肌苷和2'-o-甲基尿苷；af、cf、gf和uf分别代表2
’‑
氟腺苷、2
’‑
氟胞苷、2
’‑
氟鸟苷和2
’‑
氟尿苷；cprpa和cprpu分别代表5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷和5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷，并且s代表硫代磷酸酯键，并且其中分别的有义链进一步包括在核苷酸序列的3'末端处的反向脱碱基残基，并且有义链还包括与5'末端共价连接的靶向配体，其中所述靶向配体包含αvβ6整联蛋白靶向配体。
32.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与下述核苷酸序列(5
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)之一相差0或1个核苷酸的核苷酸序列：aagucgaugaugaucucccca (seq id no:194)；aguugaagauguaacaguugc (seq id no: 195)；uuguuguagucacuguagacg (seq id no: 198)；uuguuguagucacuguagaag (seq id no:244)；ucguguuguagucacuguagg (seq id no: 199)；uguuguugcaguauuucuccc (seq id no: 201)；或uguugaagauguaacaguugc (seq id no: 203；其中所述β-enac rnai试剂进一步包括与反义链至少部分互补的有义链；并且其中所述反义链和有义链两者上的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。
33.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与下述核苷酸序列(5
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)之一相差0或1个核苷酸的核苷酸序列：aagucgaugaugaucucccca (seq id no:194)；aguugaagauguaacaguugc (seq id no: 195)；uuguuguagucacuguagacg (seq id no: 198)；uuguuguagucacuguagaag (seq id no:244)；ucguguuguagucacuguagg (seq id no: 199)；uguuguugcaguauuucuccc (seq id no: 201)；或uguugaagauguaacaguugc (seq id no: 203；其中所述β-enac rnai试剂进一步包括与反义链至少部分互补的有义链；其中所述反义链和有义链两者上的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸；并且其中所述有义链进一步包括在核苷酸序列的3'末端处的反向脱碱基残基，并且所述有义链还包括与5'末端共价连接的靶向配体，其中所述靶向配体包含αvβ6整联蛋白靶向配体。
34.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与下述核苷酸序列(5
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)之一相差0或1个核苷酸的核苷酸序列：aagucgaugaugaucucccca (seq id no:194)；aguugaagauguaacaguugc (seq id no: 195)；uuguuguagucacuguagacg (seq id no: 198)；uuguuguagucacuguagaag (seq id no:244)；
ucguguuguagucacuguagg (seq id no: 199)；uguuguugcaguauuucuccc (seq id no: 201)；或uguugaagauguaacaguugc (seq id no: 203；其中所述β-enac rnai试剂进一步包括与反义链至少部分互补的有义链；其中所述反义链和有义链两者上的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸；并且其中所述有义链进一步包括在核苷酸序列的3'末端处的反向脱碱基残基，并且所述有义链还包括与5'末端共价连接的靶向配体，其中所述靶向配体包含αvβ6整联蛋白靶向配体；并且其中分别的反义链序列定位于反义链的位置1-21处。
35.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链和有义链，其中所述反义链和有义链由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与下述核苷酸序列(5
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)对之一相差0或1个核苷酸的核苷酸序列：uuguuguagucacuguagacg (seq id no:198)和cgucuacagugacuacaacaa (seq id no:217)；或ucguguuguagucacuguagg (seq id no:199)和ccuacagugacuacaacacia (seq id no:219)，其中i代表肌苷(次黄嘌呤)核苷酸；或uguuguugcaguauuucuccc (seq id no:201)和gggagaaauacugcaacaaca (seq id no:222)；或aguugaagauguaacaguugc (seq id no:195)和gcaacuguuacaucuucaacu (seq id no:223)；或aagucgaugaugaucucccca (seq id no:194)和uggggagaucaucauciacuu (seq id no:224)，其中i代表肌苷(次黄嘌呤)核苷酸；或uguugaagauguaacaguugc (seq id no:203)和gcaacuguuacaucuucaaca (seq id no:227)；或uuguuguagucacuguagaag (seq id no:244)和cuucuacagugacuacaacaa (seq id no:245)；或aguugaagauguaacaguugc (seq id no:195)和gc (a
2n
)acuguuacaucuucaacu (seq id no:229)，其中a
2n
代表含有2-氨基腺嘌呤的核苷酸；或uguugaagauguaacaguugc (seq id no:203)和gc (a
2n
)acuguuacaucuucaaca (seq id no:230)，其中a
2n
代表含有2-氨基腺嘌呤的核苷酸；其中所述反义链和有义链两者上的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。
36.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链和有义链，其中所述反义链和有义链由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与下述核苷酸序列(5
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)对之一相差0或1个核苷酸的核苷酸序列：uuguuguagucacuguagacg (seq id no:198)和cgucuacagugacuacaacaa (seq id no:217)；或ucguguuguagucacuguagg (seq id no:199)和ccuacagugacuacaacacia (seq id no:219)，其中i代表肌苷(次黄嘌呤)核苷酸；或uguuguugcaguauuucuccc (seq id no:201)和gggagaaauacugcaacaaca (seq id no:222)；或
aguugaagauguaacaguugc (seq id no:195)和gcaacuguuacaucuucaacu (seq id no:223)；或aagucgaugaugaucucccca (seq id no:194)和uggggagaucaucauciacuu (seq id no:224)；或uguugaagauguaacaguugc (seq id no:203)和gcaacuguuacaucuucaaca (seq id no:227)；或uuguuguagucacuguagaag (seq id no:244)和cuucuacagugacuacaacaa (seq id no:245)；或aguugaagauguaacaguugc (seq id no:195)和gc (a
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)acuguuacaucuucaacu (seq id no:229)，其中a
2n
代表含有2-氨基腺嘌呤的核苷酸；或uguugaagauguaacaguugc (seq id no:203)和gc (a
2n
)acuguuacaucuucaaca (seq id no:230)，其中a
2n
代表含有2-氨基腺嘌呤的核苷酸；其中所述反义链和有义链两者上的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸；并且其中所述有义链进一步包括在3'末端处的反向脱碱基残基，并且所述有义链还包括与5'末端共价连接的靶向配体，其中所述靶向配体包含αvβ6整联蛋白靶向配体。
37.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与下述核苷酸序列(5
′ꢀ→ꢀ3′
)之一相差0或1个核苷酸的修饰的核苷酸序列：asafsgsufcgfaufgafugfaufcufccfccfsa (seq id no:126)；asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)；usufsgsufugfuafgufcafcufgufagfacfsg (seq id no:130)；uscfsgsufgufugfuafgufcafcufgufagfsg (seq id no:131)；usgfsusufgufugfcafgufaufuufcufccfsc (seq id no:135)；和cprpusgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:138)；cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)；cprpasgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:153)；和cprpagfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:154)；其中a、c、g和u分别代表2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基鸟苷和2'-o-甲基尿苷；af、cf、gf和uf分别代表2
’‑
氟腺苷、2
’‑
氟胞苷、2
’‑
氟鸟苷和2
’‑
氟尿苷；cprpa和cprpu分别代表5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷和5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷，并且s代表硫代磷酸酯键，并且其中所述β-enac rnai试剂进一步包括与反义链至少部分互补的有义链；并且其中所述有义链上的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。
38.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与下述核苷酸序列(5
′ꢀ→ꢀ3′
)之一相差0或1个核苷酸的修饰的核苷酸序列：asafsgsufcgfaufgafugfaufcufccfccfsa (seq id no:126)；asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)；usufsgsufugfuafgufcafcufgufagfacfsg (seq id no:130)；uscfsgsufgufugfuafgufcafcufgufagfsg (seq id no:131)；
usgfsusufgufugfcafgufaufuufcufccfsc (seq id no:135)；和cprpusgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:138)；cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)；cprpasgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:153)；和cprpagfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:154)；其中a、c、g和u分别代表2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基鸟苷和2'-o-甲基尿苷；af、cf、gf和uf分别代表2
’‑
氟腺苷、2
’‑
氟胞苷、2
’‑
氟鸟苷和2
’‑
氟尿苷；cprpa和cprpu分别代表5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷和5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷，并且s代表硫代磷酸酯键，并且其中所述β-enac rnai试剂进一步包括与反义链至少部分互补的有义链；并且其中所述有义链上的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸；并且其中所述有义链进一步包括在核苷酸序列的3'末端处的反向脱碱基残基，并且所述有义链还包括与5'末端共价连接的靶向配体，其中所述靶向配体包含αvβ6整联蛋白靶向配体。
39.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链和有义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：与下述核苷酸序列(5
′ꢀ→ꢀ3′
)对之一相差0或1个核苷酸的修饰的核苷酸序列：usufsgsufugfuafgufcafcufgufagfacfsg (seq id no:130)和csgucuacagfufgfacuacaacaa (seq id no:234)；uscfsgsufgufugfuafgufcafcufgufagfsg (seq id no:131)和cscuacagugfafcfuacaacacia (seq id no:235)；usgfsusufgufugfcafgufaufuufcufccfsc (seq id no:135)和gsggagaaaufafcfugcaacaaca (seq id no:236)；asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)和gscaacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:237)；或asafsgsufcgfaufgafugfaufcufccfccfsa (seq id no:126)和usggggagaufcfafucauciacuu (seq id no:238)；cprpusgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:138)和gscaacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:239)；asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)和gsca_2nacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:240)；cprpasgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:153)和gscaacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:237)；cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)和gscaacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:239)；cprpagfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:154)和gsca_2nacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:240)；cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)和gsca_2nacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:241)；其中a、c、g、i和u分别代表2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基肌苷和2'-o-甲基尿苷；af、cf、gf和uf分别代表2
’‑
氟腺苷、2
’‑
氟胞苷、2
’‑
氟鸟苷和2’‑
氟尿苷；cprpa和cprpu分别代表5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷和5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷，并且s代表硫代磷酸酯键。
40.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链和有义链，其由以下组成、基本上由以下组成或包含以下：下述核苷酸序列(5
′ꢀ→ꢀ3′
)对之一：usufsgsufugfuafgufcafcufgufagfacfsg (seq id no:130)和csgucuacagfufgfacuacaacaa (seq id no:234)；uscfsgsufgufugfuafgufcafcufgufagfsg (seq id no:131)和cscuacagugfafcfuacaacacia (seq id no:235)；usgfsusufgufugfcafgufaufuufcufccfsc (seq id no:135)和gsggagaaaufafcfugcaacaaca (seq id no:236)；asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)和gscaacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:237)；或asafsgsufcgfaufgafugfaufcufccfccfsa (seq id no:126)和usggggagaufcfafucauciacuu (seq id no:238)；cprpusgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:138)和gscaacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:239)；asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:127)和gsca_2nacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:240)；cprpasgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:153)和gscaacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:237)；cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)和gscaacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:239)；cprpagfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:154)和gsca_2nacuguufafcfaucuucaacu (seq id no:240)；cprpugfuufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no:150)和gsca_2nacuguufafcfaucuucaaca (seq id no:241)；其中a、c、g、i和u分别代表2'-o-甲基腺苷、2'-o-甲基胞苷、2'-o-甲基鸟苷、2'-o-甲基肌苷和2'-o-甲基尿苷；af、cf、gf和uf分别代表2
’‑
氟腺苷、2
’‑
氟胞苷、2
’‑
氟鸟苷和2
’‑
氟尿苷；cprpa和cprpu分别代表5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷和5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷，并且s代表硫代磷酸酯键；并且其中有义链进一步包括在核苷酸序列的3'末端处的反向脱碱基残基，并且有义链还包括与5'末端共价连接的靶向配体，其中所述靶向配体包含αvβ6整联蛋白靶向配体。
41.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其包括与选自以下(5
′ꢀ→ꢀ3′
)的核苷酸序列相差0或1个核碱基的核碱基序列：aagucgaugaugaucuccc (seq id no:60)；aguugaagauguaacaguu (seq id no: 15)；uuguuguagucacuguaga (seq id no: 27)；ucguguuguagucacugua (seq id no: 30)；uguuguugcaguauuucuc (seq id no: 53)；或
uguugaagauguaacaguu (seq id no: 16)。
42.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其包括与选自以下(5
′ꢀ→ꢀ3′
)的核苷酸序列相差0或1个核碱基的核碱基序列：aagucgaugaugaucuccc (seq id no:60)；aguugaagauguaacaguu (seq id no: 15)；uuguuguagucacuguaga (seq id no: 27)；ucguguuguagucacugua (seq id no: 30)；uguuguugcaguauuucuc (seq id no: 53)；或uguugaagauguaacaguu (seq id no: 16)；其中所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。
43.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链，其包括与选自以下(5
′ꢀ→ꢀ3′
)的核苷酸序列相差0或1个核碱基的核碱基序列：aagucgaugaugaucuccc (seq id no:60)；aguugaagauguaacaguu (seq id no: 15)；uuguuguagucacuguaga (seq id no: 27)；ucguguuguagucacugua (seq id no: 30)；uguuguugcaguauuucuc (seq id no: 53)；或uguugaagauguaacaguu (seq id no: 16)；其中所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸，并且其中分别的序列定位于反义链的核苷酸位置1-19 (5
′ꢀ→ꢀ3′
)处。
44.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链和有义链，其各自包括与选自以下(5
′ꢀ→ꢀ3′
)的核苷酸序列对相差0或1个核碱基的核碱基序列：uuguuguagucacuguaga (seq id no:27)和ucuacagugacuacaacaa (seq id no:80)；或ucguguuguagucacugua (seq id no:30)和uacagugacuacaacacia (seq id no:86)，其中i代表肌苷(次黄嘌呤)核苷酸；或uguuguugcaguauuucuc (seq id no:53)和gagaaauacugcaacaaca (seq id no:106)；或aguugaagauguaacaguu (seq id no:15)和aacuguuacaucuucaacu (seq id no:68)；或aagucgaugaugaucuccc (seq id no:60)和gggagaucaucauciacuu (seq id no:115)，其中i代表肌苷(次黄嘌呤)核苷酸；或uguugaagauguaacaguu (seq id no:16)和aacuguuacaucuucaaca (seq id no:69)；或aguugaagauguaacaguu (seq id no:15)和(a
2n
)acuguuacaucuucaacu (seq id no:242)，其中a
2n
代表含有2-氨基腺嘌呤的核苷酸；或uguugaagauguaacaguu (seq id no:16)和(a
2n
)acuguuacaucuucaaca (seq id no:243)，其中a
2n
代表含有2-氨基腺嘌呤的核苷酸。
45.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂包括反义链和有义链，其各自包
括与选自以下(5
′ꢀ→ꢀ3′
)的核苷酸序列对相差0或1个核碱基的核碱基序列：uuguuguagucacuguaga (seq id no:27)和ucuacagugacuacaacaa (seq id no:80)；或ucguguuguagucacugua (seq id no:30)和uacagugacuacaacacia (seq id no:86)，其中i代表肌苷(次黄嘌呤)核苷酸；或uguuguugcaguauuucuc (seq id no:53)和gagaaauacugcaacaaca (seq id no:106)；或aguugaagauguaacaguu (seq id no:15)和aacuguuacaucuucaacu (seq id no:68)；或aagucgaugaugaucuccc (seq id no:60)和gggagaucaucauciacuu (seq id no:115)，其中i代表肌苷(次黄嘌呤)核苷酸；或uguugaagauguaacaguu (seq id no:16)和aacuguuacaucuucaaca (seq id no:69)；或aguugaagauguaacaguu (seq id no:15)和(a
2n
)acuguuacaucuucaacu (seq id no:242)，其中a
2n
代表含有2-氨基腺嘌呤的核苷酸；或uguugaagauguaacaguu (seq id no:16)和(a
2n
)acuguuacaucuucaaca (seq id no:243)，其中a
2n
代表含有2-氨基腺嘌呤的核苷酸；和其中所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。
46.如本文使用的，术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”意指连接的核苷的聚合物，所述核苷各自可以独立地为修饰的或未修饰的。
47.如本文使用的，“rnai试剂”(也称为“rnai触发剂”)意指含有rna或rna样(例如化学修饰的rna)寡核苷酸分子的组合物，所述寡核苷酸分子能够以序列特异性方式降解或抑制(例如，在适当的条件下降解或抑制)靶mrna的信使rna(mrna)转录物的翻译。如本文使用的，rnai试剂可以通过rna干扰机制(即，通过与哺乳动物细胞的rna干扰途径机制(rna诱导沉默复合物或risc)的相互作用而诱导rna干扰)、或通过任何替代机制或途径来起作用。尽管认为如该术语在本文中使用的，rnai试剂主要通过rna干扰机制来起作用，但所公开的rnai试剂不受任何特定的途径或作用机制的束缚或限制。本文公开的rnai试剂由有义链和反义链构成，并且包括但不限于：短(或小)干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微小rna(mirna)、短发夹rna(shrna)和切丁酶(dicer)底物。本文所述的rnai试剂的反义链与待靶向的mrna(即β-enac mrna)至少部分互补。rnai试剂可以包括一个或多个修饰的核苷酸和/或一个或多个非磷酸二酯键合。
48.如本文使用的，当提及给定基因的表达时，术语“沉默”、“降低”、“抑制”、“下调”或“敲减”，意指如通过基因在其中转录的细胞、细胞群、组织、器官或受试者中，由基因转录的rna水平或者由mrna翻译的多肽、蛋白质或蛋白质亚基的水平测量的，与未如此治疗的第二细胞、细胞群、组织、器官或受试者相比，当细胞、细胞群、组织、器官或受试者用本文所述的rnai试剂进行治疗时，所述基因的表达是降低的。
49.如本文使用的，术语“序列”和“核苷酸序列”意指使用标准命名法，用连续字母来描述的核碱基或核苷酸的连续或次序。
50.如本文使用的，“碱基”、“核苷酸碱基”或“核碱基”是其为核苷酸的组分的杂环嘧
啶或嘌呤化合物，并且包括主要的嘌呤碱基腺嘌呤和鸟嘌呤，以及主要的嘧啶碱基胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。核碱基可以进一步进行修饰，以包括但不限于通用碱基、疏水性碱基、混杂碱基、尺寸扩展的碱基和氟化碱基。(参见例如，modified nucleosides in biochemistry，biotechnology and medicine，herdewijn，p.编辑wiley-vch，2008)。此类修饰的核碱基(包括包含修饰的核碱基的亚磷酰胺化合物)的合成是本领域已知的。
51.如本文使用的，并且除非另有说明，否则当用于描述与第二核碱基或核苷酸序列(例如，rnai试剂的反义链或单链反义寡核苷酸)有关的第一核碱基或核苷酸序列(例如，rnai试剂的有义链或靶向mrna)时，术语“互补的”意指包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸，在某些标准条件下，与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸杂交(在哺乳动物生理条件下(或者在其它方面合适的体内或体外条件下)形成碱基配对氢键)，并且形成双链体或双螺旋结构的能力。本领域普通技术人员将能够选择对于杂交测试最适当的条件集合。互补序列包括沃森-克里克碱基对或非沃森-克里克碱基对，并且至少在满足上述杂交要求的程度上，包括天然或修饰的核苷酸或核苷酸模拟物。序列同一性或互补性不依赖于修饰。例如，为了确定同一性或互补性的目的，如本文定义的a和af与u(或t)互补且与a相同。
52.如本文使用的，“完全地互补的”或“完全互补的”意指在核碱基或核苷酸序列分子的杂交对中，第一寡核苷酸的邻接序列中的所有(100%)碱基，与第二寡核苷酸的邻接序列中的相同数目的碱基杂交。邻接序列可以包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列的全部或部分。
53.如本文使用的，“部分互补的”意指在核碱基或核苷酸序列分子的杂交对中，第一寡核苷酸的邻接序列中的至少70%但并非全部碱基，与第二寡核苷酸的邻接序列中的相同数目的碱基杂交。邻接序列可以包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列的全部或部分。
54.如本文使用的，“基本上互补的”意指在核碱基或核苷酸序列分子的杂交对中，第一寡核苷酸的邻接序列中的至少85%但并非全部碱基，与第二寡核苷酸的邻接序列中的相同数目的碱基杂交。邻接序列可以包含第一核苷酸序列或第二核苷酸序列的全部或部分。
55.如本文使用的，术语“互补的”、“完全互补的”、“部分互补的”和“基本上互补的”，就rnai试剂的有义链与反义链之间、或rnai试剂的反义链与β-enac mrna的序列之间的核碱基或核苷酸匹配而言使用。
56.如本文使用的，当应用于核酸序列时，术语“基本上相同的”或“基本同一性”意指与参考序列相比，核苷酸序列(或核苷酸序列的一部分)具有至少约85%序列同一性或更多，例如至少90%、至少95%或至少99%同一性。通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列，来确定序列同一性的百分比。百分比通过以下进行计算：确定在其下相同类型的核酸碱基出现在两个序列中的位置数目，以得出匹配位置数目，将匹配位置数目除以比较窗口中的位置总数目，并且将结果乘以100，以得出序列同一性的百分比。本文公开的本发明涵盖了与本文公开的核苷酸序列基本上相同的核苷酸序列。
57.如本文使用的，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”等等，意指为了提供受试者中的一种或多种疾病症状的数目、严重性和/或频率的缓解或减轻而采取的方法或步骤。如本文使用的，“治疗(treat)”和“治疗(treatment)”可以包括受试者中的一种或多种疾病症状的数目、严重性和/或频率的预防、管理、预防性治疗、和/或抑制或降低。
58.如本文使用的，当提及rnai试剂时，短语“引入细胞内”意指将rnai试剂功能性地
递送到细胞内。短语“功能性递送”意指以致使rnai试剂具有预计的生物活性，例如基因表达的序列特异性抑制的方式，将rnai试剂递送至细胞。
59.除非另有说明，否则如本文使用的，符号的使用意指根据本文所述的本发明的范围，可以将任何一个或多个基团与其连接。
60.如本文使用的，术语“异构体”指这样的化合物，其具有相同分子式，但在其原子的键合次序或性质或者其原子在空间中的排列方面不同。其原子在空间中的排列不同的异构体被称为“立体异构体”。并非彼此镜像的立体异构体被称为“非对映异构体”，并且其为不能重叠的镜像的立体异构体被称为“对映异构体”、或有时被称为光学异构体。与四个非相同取代基键合的碳原子被称为“手性中心”。
61.如本文使用的，对于其中存在不对称中心，并且因此产生对映异构体、非对映异构体或其它立体异构构型的每个结构，除非在结构中被特异性地鉴定为具有特定构象，否则本文公开的每个结构预期代表所有此类可能的异构体，包括其光学纯和外消旋形式。例如，本文公开的结构预期涵盖非对映异构体以及单一立体异构体的混合物。
62.如本文的权利要求中使用的，短语“由
……
组成”排除权利要求中未指定的任何要素、步骤或成分。当在本文的权利要求中使用时，短语“基本上由
……
组成”将权利要求的范围限制于指定的材料或步骤、以及不会实质上影响本发明的基本和新型特征的那些材料或步骤。
63.本领域普通技术人员将容易理解且了解，本文公开的化合物和组合物可以具有以质子化或去质子化状态的某些原子(例如，n、o或s原子)，取决于化合物或组合物置于其中的环境。相应地，如本文使用的，本文公开的结构设想了某些官能团，例如oh、sh或nh，可以是质子化或去质子化的。如本领域普通技术人员容易理解的，本文的公开内容预期涵盖所公开的化合物和组合物，而与其基于环境(例如ph)的质子化状态无关。相应地，本文所述的具有不稳定质子或碱性原子的化合物也应该理解为代表相应化合物的盐形式。本文所述的化合物可以是游离酸、游离碱或盐的形式。本文所述化合物的药学上可接受的盐应该理解为在本发明的范围内。
64.如本文使用的，当提及两种化合物或分子之间的连接时，术语“连接的”或“缀合的”意指两种化合物或分子通过共价键进行接合。除非另有说明，否则如本文使用的，术语“连接的”和“缀合的”可以指具有或不具有任何中间原子或原子群的第一化合物和第二化合物之间的连接。
65.如本文使用的，术语“包括”在本文中用于意指短语“包括但不限于”，并且可与短语“包括但不限于”互换使用。除非上下文另外明确指出，否则术语“或”在本文中用于意指术语“和/或”，并且可与术语“和/或”互换使用。
66.除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管下文描述了合适的方法和材料，但与本文描述的方法和材料类似或等价的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中。本文提到的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献整体引入作为参考。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不预期是限制性的。
67.根据下述具体实施方式、附图和权利要求，本发明的其它目的、特点、方面和优点
将是显而易见的。
附图说明
68.图1. 本文称为tri-sm2的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示。
69.图2. 本文称为tri-sm1的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示。
70.图3. 本文称为tri-sm6.1的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示。
71.图4. 本文称为tri-sm9的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示。
72.图5. 本文称为tri-sm6的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示。
73.图6. 本文称为tri-sm8的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示。
74.图7. 本文称为tri-sm10的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示。
75.图8. 本文称为tri-sm11的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示。
76.图9. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad06598的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合，如实施例6中更充分地描述的。
77.图10. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07217的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-7”)，如实施例8和11中更充分地描述的。
78.图11. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07099的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-5”)，如实施例7和11中更充分地描述的。
79.图12. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07255的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-16”)，如实施例10中更充分地描述的。
80.图13. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07253的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-14”)，如实施例10中更充分地描述的。
81.图14. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07252的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-13”)，如实施例10中更充分地描述的。
82.图15. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07251的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-12”)，如实施例9中更充分地描述的。
83.图16. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07250的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-11”)，如实施例9中更充分地描述的。
84.图17. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07240的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-10”)，如实施例9中更充分地描述的。
85.图18. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad06599的绵羊中的粘液纤毛
清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-9”)，如实施例8中更充分地描述的。
86.图19. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad07217的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂具有半胱氨酸-马来酰亚胺接头、在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-8”)，如实施例8中更充分地描述的。
87.图20. 施用在等渗盐水配制中的β-enac rnai试剂ad06598的绵羊中的粘液纤毛清除水平，所述β-enac rnai试剂在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(称为“aperc-2”)，如实施例7中更充分地描述的。
88.图21a. β-enac rnai试剂ad06495的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad06495具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
89.在图21a至21l中使用下述缩写：a、c、g和u是2'-o-甲基修饰的核苷酸；af、cf、gf和uf是2'-氟修饰的核苷酸；o是磷酸二酯键合；s是硫代磷酸酯键；invab是反向脱碱基残基(参见表6)；a_2n是2'-o-甲基-2-氨基腺苷修饰的核苷酸(参见表6)；cprpa是5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷修饰的核苷酸(参见表6)，并且cprpu是5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷修饰的核苷酸。
90.图21b. β-enac rnai试剂ad06497的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad06497具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
91.图21c. β-enac rnai试剂ad06501的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad06501具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
92.图21d. β-enac rnai试剂ad06598的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad06598具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
93.图21e. β-enac rnai试剂ad06599的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad06599具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
94.图21f. β-enac rnai试剂ad07099的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad07099具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
95.图21g. β-enac rnai试剂ad07217的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad07217具有置于有义链的5'末端处的(nh2-c6)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
96.图21h. β-enac rnai试剂ad07482的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad07482具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
97.图21i. β-enac rnai试剂ad07250的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)
的示意图，所述ad07250具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
98.图21j. β-enac rnai试剂ad07240的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad07240具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
99.图21k. β-enac rnai试剂ad07453的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad07453具有置于有义链的5'末端处的(nh2-c6)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
100.图21l. β-enac rnai试剂ad07255的修饰的有义链和反义链(参见表3、4、5a和5b)的示意图，所述ad07255具有置于有义链的5'末端处的(trialk14)连接基团(关于化学结构参见表6)，以促进与一种或多种靶向配体例如本文图1到8中描绘的那些靶向配体的键合。
101.图22. 以游离酸形式，与trialk14支架连接基团相连接，在本文中称为tri-sm6.1的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体(在本文中描述为(trism6.1-avb6-ta14))的化学结构表示，其中包含β-enac rnai试剂。
102.图23. 以游离酸形式，进一步包括半胱氨酸-马来酰亚胺接头，与trialk14支架连接基团相连接，在本文中称为tri-sm6.1的三齿αvβ6上皮细胞靶向配体的化学结构表示，其中包含β-enac rnai试剂。
103.图24. 用β-enac rnai试剂转染的培养的原代正常人支气管上皮细胞中的人β-enac (scnn1b)相对mrna表达，如实施例12中更充分地描述的(误差条未显示)。
104.图25a到25d. 在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07482 (称为“aperc-7”)的化学结构表示，以游离酸形式显示。
105.图26a到26d. 在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07482 (称为“aperc-7”)的化学结构表示，以钠盐形式显示。
106.图27a到27d. 在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07099 (称为“aperc-5”)的化学结构表示，以游离酸形式显示。
107.图28a到28d. 在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07099 (称为“aperc-5”)的化学结构表示，以钠盐形式显示。
108.图29a到29d. 在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad06599 (称为“aperc-9”)的化学结构表示，以游离酸形式显示。
109.图30a到30d. 在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad06599 (称为“aperc-9”)的化学结构表示，以钠盐形式显示。
具体实施方式
110.rnai试剂本文描述的是用于抑制β-enac (即scnn1b)基因表达的rnai试剂(本文称为β-enac rnai试剂或β-enac rnai触发剂)。本文公开的每种β-enac rnai试剂包含有义链和反义链。有义链和反义链各自的长度可以是16至49个核苷酸。有义链和反义链可以是相同的长度，或者它们可以是不同的长度。在一些实施方案中，有义链和反义链的长度各自独立地为18至27个核苷酸。在一些实施方案中，有义链和反义链的长度各自均为21-26个核苷酸。在一些实施方案中，有义链和反义链的长度各自为21-24个核苷酸。在一些实施方案中，有义链和反义链的长度各自独立地为19-21个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为约19个核苷酸，而反义链的长度为约21个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为约21个核苷酸，而反义链的长度为约23个核苷酸。在一些实施方案中，有义链的长度为23个核苷酸，且反义链的长度为21个核苷酸。在一些实施方案中，有义链和反义链的长度各自均为21个核苷酸。在一些实施方案中，rnai试剂的有义链和反义链的长度各自独立地为16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38或39个核苷酸。在一些实施方案中，双链rnai试剂具有约16、17、18、19、20、21、22、23或24个核苷酸的双链体长度。
111.表2、3和4中提供了用于形成β-enac rnai试剂的核苷酸序列的实例。包括表2、3和4中的有义链和反义链序列的rnai试剂双链体的实例显示于表5a和5b中。
112.在一些实施方案中，有义链和反义链之间的完全互补性、基本互补性或部分互补性的区域的长度为16-26(例如16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26)个核苷酸，并且出现在反义链的5'端处或附近(例如，该区域可能与反义链的5'端分隔开0、1、2、3或4个核苷酸，所述核苷酸是不完全互补、基本互补或部分互补的)。
113.本文所述的β-enac rnai试剂的有义链包括至少16个连续核苷酸，其与β-enac mrna中相同数目的核苷酸的核心段序列(在本文中也称为“核心段”或“核心序列”)具有至少85%的同一性。在一些实施方案中，有义链核心段序列与反义链中的核心段序列100% (完全)互补或至少约85% (基本上)互补，并且因此，有义链核心段序列与β-enac mrna靶中存在的相同长度的核苷酸序列(有时例如称为靶序列)，通常是完全相同的或至少约85%相同的。在一些实施方案中，该有义链核心段的长度为16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸。在一些实施方案中，该有义链核心段的长度为17个核苷酸。在一些实施方案中，该有义链核心段的长度为19个核苷酸。
114.本文所述的β-enac rnai试剂的反义链包括至少16个连续核苷酸，其与β-enac mrna中相同数目的核苷酸的核心段、以及相应的有义链中相同数目的核苷酸的核心段具有至少85%的互补性。在一些实施方案中，反义链核心段与β-enac mrna靶中存在的相同长度的核苷酸序列(例如靶序列)100% (完全)互补或至少约85% (基本上)互补。在一些实施方案中，该反义链核心段的长度为16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸。在一些实施方案中，该反义链核心段的长度为19个核苷酸。在一些实施方案中，该反义链核心段的长度为17个核苷酸。有义链核心段序列可以与相应的反义核心序列是相同的长度，或者它可以是不同的长度。
115.β-enac rnai试剂的有义链和反义链退火以形成双链体。β-enac rnai试剂的有义
链和反义链可以是彼此部分互补、基本上互补或完全互补的。在互补双链体区域内，有义链核心段序列与反义核心段序列至少85%互补或100%互补。在一些实施方案中，有义链核心段序列含有至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个核苷酸的序列，其与反义链核心段序列的相应16、17、18、19、20、21、22或23个核苷酸序列是至少85%或100%互补的(即β-enac rnai试剂的有义和反义核心段序列具有至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个或至少23个核苷酸的区域，其为至少85%碱基配对或100%碱基配对的。)在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂的反义链与表2或表3中的任何反义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂的有义链与表2或表4中的任何有义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。
116.在一些实施方案中，有义链和/或反义链可以任选地并且独立地含有在核心段序列的3'端、5'端、或3'和5'端两者处的另外的1、2、3、4、5或6个核苷酸(延伸)。反义链的另外核苷酸(如果存在的话)与β-enac mrna中的相应序列可以互补或可以不互补。有义链的另外核苷酸(如果存在的话)与β-enac mrna中的相应序列可以相同或可以不相同。反义链的另外核苷酸(如果存在的话)与相应的有义链的另外核苷酸(如果存在的话)可以互补或可以不互补。
117.如本文使用的，延伸包含在有义链核心段序列和/或反义链核心段序列的5'和/或3'端处的1、2、3、4、5或6个核苷酸。有义链上的延伸核苷酸与相应的反义链中的核苷酸(或核心段序列核苷酸或延伸核苷酸)可以互补或可以不互补。相反，反义链上的延伸核苷酸与相应的有义链中的核苷酸(或核心段核苷酸或延伸核苷酸)可以互补或可以不互补。在一些实施方案中，rnai试剂的有义链和反义链均含有3'和5'延伸。在一些实施方案中，一条链的一个或多个3'延伸核苷酸与另一条链的一个或多个5'延伸核苷酸碱基配对。在其它实施方案中，一条链的一个或多个3'延伸核苷酸与另一条链的一个或多个5'延伸核苷酸并不碱基配对。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂具有带有3'延伸的反义链和带有5'延伸的有义链。在一些实施方案中，延伸核苷酸是未配对的并形成突出端。如本文使用的，“突出端”指位于有义链或反义链的末端处的一个或多个未配对核苷酸段，其不形成本文公开的rnai试剂的杂交或双链体部分的一部分。
118.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含具有长度为1、2、3、4、5或6个核苷酸的3’延伸的反义链。在其它实施方案中，β-enac rnai试剂包含具有长度为1、2或3个核苷酸的3'延伸的反义链。在一些实施方案中，一个或多个反义链延伸核苷酸包含与相应的β-enac mrna序列互补的核苷酸。在一些实施方案中，一个或多个反义链延伸核苷酸包含与相应的β-enac mrna序列不互补的核苷酸。
119.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含具有长度为1、2、3、4或5个核苷酸的3’延伸的有义链。在一些实施方案中，一个或多个有义链延伸核苷酸包含腺苷、尿嘧啶或胸苷核苷酸、at二核苷酸、或者与β-enac mrna序列中的核苷酸相对应或相同的核苷酸。在一些实施方案中，3'有义链延伸包括下述序列之一或由下述序列之一组成，但不限于此：t、ut、tt、uu、uut、ttt或tttt(各自以5'至3'列出)。
120.有义链可以具有3'延伸和/或5'延伸。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含具有长度为1、2、3、4、5或6个核苷酸的5’延伸的有义链。在一些实施方案中，一个或多个有
义链延伸核苷酸包含与β-enac mrna序列中的核苷酸相对应或相同的核苷酸。
121.表2、3和4中提供了用于形成β-enac rnai试剂的序列的实例。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包括表2或3中的任何序列的序列。在某些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包含表3中的任何一种修饰序列、或由其组成。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包括表2或3中的任何序列的核苷酸(5'端
→
3'端)1-17、2-15、2-17、1-18、2-18、1
¬
19、2-19、1-20、2-20、1-21或2-21的序列。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链包括表2或4中的任何序列的序列。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链包括表2或表4中的任何序列的核苷酸(5'端
→
3'端)1-18、1-19、1-20、1
¬
21、2-19、2-20、2-21、3-20、3-21或4-21的序列。在某些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链包含表4中任何一种修饰序列的修饰序列、或由其组成。
122.在一些实施方案中，本文描述的rnai试剂的有义链和反义链含有相同数目的核苷酸。在一些实施方案中，本文描述的rnai试剂的有义链和反义链含有不同数目的核苷酸。在一些实施方案中，rnai试剂的有义链5'端和反义链3'端形成平端。在一些实施方案中，rnai试剂的有义链3'端和反义链5'端形成平端。在一些实施方案中，rnai试剂的两端形成平端。在一些实施方案中，rnai试剂的两端均不是平端。如本文使用的，“平端”指双链rnai试剂的端部，其中两条退火链的末端核苷酸是互补的(形成互补碱基对)。
123.在一些实施方案中，rnai试剂的有义链5'端和反义链3'端形成翻口端(frayed end)。在一些实施方案中，rnai试剂的有义链3'端和反义链5'端形成翻口端。在一些实施方案中，rnai试剂的两端形成翻口端。在一些实施方案中，rnai试剂的两端均不是翻口端。如本文使用的，翻口端指双链rnai试剂的端部，其中两条退火链的末端核苷酸形成一对(即，不形成突出端)，但不互补(即，形成非互补对)。在一些实施方案中，在双链rnai试剂的一条链的端部处的一个或多个未配对核苷酸形成突出端。未配对核苷酸可以在有义链或反义链上，产生3'或5'突出端。在一些实施方案中，rnai试剂含有：平端和翻口端、平端和5'突出端、平端和3'突出端、翻口端和5'突出端、翻口端和3'突出端、两个5'突出端、两个3'突出端、5'突出端和3'突出端、两个翻口端或两个平端。通常，当存在时，突出端位于有义链、反义链、或有义链和反义链两者的3'末端处。
124.本文公开的β-enac rnai试剂也可以包含一个或多个修饰的核苷酸。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链的基本上所有核苷酸和反义链的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。本文公开的β-enac rnai试剂可以进一步包含一个或多个修饰的核苷间键，例如一个或多个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂含有一个或多个修饰的核苷酸和一个或多个修饰的核苷间键。在一些实施方案中，2'-修饰的核苷酸与修饰的核苷间键组合。
125.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂作为盐、混合盐或游离酸制备或提供。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂制备为钠盐。本领域众所周知的此类形式在本文公开的本发明的范围内。
126.修饰的核苷酸当用于各种寡核苷酸构建体中时，修饰的核苷酸可以保存化合物在细胞中的活性，同时增加这些化合物的血清稳定性，并且还可以最小化在寡核苷酸构建体施用后，激活人中的干扰素活性的可能性。
127.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂含有一个或多个修饰的核苷酸。如本文使用的，“修饰的核苷酸”是除核糖核苷酸(2'-羟基核苷酸)外的核苷酸。在一些实施方案中，至少50% (例如，至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、至少97%、至少98%、至少99%或100%)的核苷酸是修饰的核苷酸。如本文使用的，修饰的核苷酸可以包括但不限于脱氧核糖核苷酸、核苷酸模拟物、脱碱基核苷酸、2'-修饰的核苷酸、反向核苷酸、包含修饰的核碱基的核苷酸、桥连的核苷酸、肽核酸(pna)、2',3'-开环(seco)核苷酸模拟物(未锁定的核碱基类似物)、锁定的核苷酸、3'-o-甲氧基(2'核苷间连接的)核苷酸、2'-f-阿拉伯糖核苷酸、5'-me,2'-氟核苷酸、吗啉代核苷酸、乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸、含乙烯基膦酸酯的核苷酸和含环丙基膦酸酯的核苷酸。2'-修饰的核苷酸(即，在五元糖环的2'位置处具有除羟基外的基团的核苷酸)包括但不限于2'-o-甲基核苷酸(也称为2'-甲氧基核苷酸)、2'-氟核苷酸(在本文中也称为2'-脱氧-2'-氟核苷酸)、2'-脱氧核苷酸、2'-甲氧基乙基(2'-o-2-甲氧基乙基)核苷酸(也称为2'-moe)、2'-氨基核苷酸和2'-烷基核苷酸。给定化合物中的所有位置不必是均匀地修饰的。相反，可以在单一β-enac rnai试剂中，或甚至在其单个核苷酸中掺入多于一种修饰。β-enac rnai试剂的有义链和反义链可以通过本领域已知的方法进行合成和/或修饰。在一个核苷酸处的修饰独立于在另一个核苷酸处的修饰修饰的核碱基包括合成的和天然的核碱基，例如5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶以及n-2、n-6和o-6取代的嘌呤(例如2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶或5-丙炔基胞嘧啶)，5-甲基胞嘧啶(5-me-c)，5-羟甲基胞嘧啶，肌苷，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-烷基(例如6-甲基、6-乙基、6-异丙基或6-正丁基)衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-烷基(例如2-甲基、2-乙基、2-异丙基或2-正丁基)及其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫胸腺嘧啶，2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶，胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，5-丙炔基胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，6-偶氮胞嘧啶，6-偶氮胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基、8-硫烷基、8-羟基及其它8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代(例如5-溴)、5-三氟甲基及其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤，7-脱氮腺嘌呤，3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
128.在一些实施方案中，反义链的5'和/或3'端可以包括脱碱基残基(ab)，其也可以被称为“脱碱基位点”或“脱碱基核苷酸”。脱碱基残基(ab)是在糖部分的1'位置处缺少核碱基的核苷酸或核苷。(参见例如，美国专利号5,998,203)。在一些实施方案中，脱碱基残基可以置于核苷酸序列内部。在一些实施方案中，可以将ab或abab加入反义链的3'端。在一些实施方案中，有义链的5'端可以包括一个或多个另外的脱碱基残基(例如，(ab)或(abab))。在一些实施方案中，将uuab、uab或ab加入有义链的3'端。在一些实施方案中，脱碱基(脱氧核糖)残基可以替换为核糖醇(脱碱基核糖)残基。
129.在一些实施方案中，rnai试剂的所有或基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸。如本文使用的，其中存在的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸的rnai试剂，是在有义链和反义链两者中具有的四个或更少(即，0、1、2、3或4个)核苷酸是核糖核苷酸(即，未修饰的)的rnai试剂。如本文使用的，其中存在的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸的有义链，是在有义链中具有的两个或更少(即，0、1或2个)核苷酸是未修饰的核糖核苷酸的有义链。如本文使用的，其中存在的基本上所有核苷酸都是修饰的核苷酸的反义链，是在有义链中具有的两个或更少(即，0、1或2个)核苷酸是未修饰的核糖核苷酸的反义链。在一些实施方案
中，rnai试剂的一个或多个核苷酸是未修饰的核糖核苷酸。关于某些修饰的核苷酸的化学结构在本文的表6中阐述。
130.修饰的核苷间键在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的一个或多个核苷酸通过非标准键合或主链(即，修饰的核苷间键或修饰的主链)进行连接。修饰的核苷间键或主链包括但不限于硫代磷酸酯基团(在本文中表示为小写字母“s”)、手性硫代磷酸酯、硫代磷酸盐(thiophosphate)、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基-磷酸三酯、烷基膦酸酯(例如甲基膦酸酯或3'-亚烷基膦酸酯)、手性膦酸酯、次膦酸酯、氨基磷酸酯(例如3'-氨基氨基磷酸酯、氨基烷基氨基磷酸酯或硫羰氨基磷酸酯)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯、吗啉代键合、具有正常3'-5'键合的硼烷磷酸酯、2'-5'连接的硼烷磷酸酯的类似物或具有反转极性的硼烷磷酸酯，其中相邻的核苷单元对将3'-5'连接至5'-3'或将2'-5'连接至5'-2'。在一些实施方案中，修饰的核苷间键或主链缺少磷原子。缺少磷原子的修饰的核苷间键包括但不限于短链烷基或环烷基糖间键合、混合的杂原子和烷基或环烷基糖间键合、或者一个或多个短链杂原子或杂环糖间键合。在一些实施方案中，修饰的核苷间主链包括但不限于硅氧烷主链，硫化物主链，亚砜主链，砜主链，甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基主链，亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基主链，含烯烃的主链，氨基磺酸酯主链，亚甲基亚氨基和亚甲基肼基主链，磺酸酯和磺酰胺主链，酰胺主链，以及具有混合的n、o、s和ch2组分的其它主链。
131.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链可以含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键，β-enac rnai试剂的反义链可以含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键，或有义链和反义链均可以独立地含有1、2、3、4、5或6个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链可以含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键，β-enac rnai试剂的反义链可以含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键，或有义链和反义链均可以独立地含有1、2、3或4个硫代磷酸酯键。
132.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链含有至少两个硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，硫代磷酸酯核苷间键在从有义链的3'端开始的位置1-3处的核苷酸之间。在一些实施方案中，一个硫代磷酸酯核苷间键在有义链核苷酸序列的5'端处，并且另一个硫代磷酸酯键在有义链核苷酸序列的3'端处。在一些实施方案中，两个硫代磷酸酯核苷间键位于有义链的5'端处，并且另一个硫代磷酸酯键在有义链的3'端处。在一些实施方案中，有义链不包括在核苷酸之间的任何硫代磷酸酯核苷间键，但含有在5'和3'端两者上的末端核苷酸与任选存在的反向脱碱基残基末端帽之间的一个、两个或三个硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，靶向配体经由硫代磷酸酯键与有义链连接。
133.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链含有四个硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，四个硫代磷酸酯核苷间键在从反义链的5'端开始的位置1-3处的核苷酸之间，以及在从5'端开始的位置19-21、20-22、21-23、22-24、23-25或24-26处的核苷酸之间。在一些实施方案中，三个硫代磷酸酯核苷间键位于从反义链的5'端开始的位置1-4之间，并且第四个硫代磷酸酯核苷间键位于从反义链的5'端开始的位置20-21之间。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂含有在反义链中的至少三个或四个硫代磷酸酯核苷间键。
134.加帽残基或部分在一些实施方案中，有义链可以包括一个或多个加帽残基或部分，在本领域中有
时称为“帽”、“末端帽”或“加帽残基”。如本文使用的，“加帽残基”是可以在本文公开的rnai试剂的核苷酸序列的一个或多个末端处掺入的非核苷酸化合物或其它部分。在一些情况下，加帽残基可以为rnai试剂提供某些有益的特性，例如不受核酸外切酶降解的保护。在一些实施方案中，反向脱碱基残基(invab) (在本领域中也称为“反向脱碱基位点”)作为加帽残基添加(参见表a)。(参见例如，f. czauderna，nucleic acids res.，2003，31 (11)，2705-16)。加帽残基是本领域一般已知的，并且包括例如反向脱碱基残基以及碳链，例如末端c3h
7 (丙基)、c6h
13 (己基)或c
12h25 (十二烷基)基团。在一些实施方案中，加帽残基存在于有义链的5'末端、3'末端、或5'和3'末端两者处。在一些实施方案中，有义链的5'端和/或3'端可以包括作为加帽残基的多于一个反向脱碱基脱氧核糖部分。
135.在一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(invab)加入有义链的3'端。在一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(invab)加入有义链的5'端。在一些实施方案中，在靶向配体和rnai试剂的有义链的核苷酸序列之间插入一个或多个反向脱碱基残基或反向脱碱基位点。在一些实施方案中，在rnai试剂的有义链的一个或多个末端处或附近包括一个或多个反向脱碱基残基或反向脱碱基位点，允许rnai试剂增强的活性或其它期望的特性。
136.在一些实施方案中，将一个或多个反向脱碱基残基(invab)加入有义链的5'端。在一些实施方案中，可以在靶向配体和rnai试剂的有义链的核苷酸序列之间插入一个或多个反向脱碱基残基。反向脱碱基残基可以经由磷酸酯、硫代磷酸酯(例如，在本文中显示为(invab)s)、或其它核苷间键进行连接。在一些实施方案中，在rnai试剂的有义链的一个或多个末端处或附近包括一个或多个反向脱碱基残基，可以允许rnai试剂增强的活性或其它期望的特性。在一些实施方案中，可以将反向脱碱基(脱氧核糖)残基替换为反向核糖醇(脱碱基核糖)残基。在一些实施方案中，反义链核心段序列的3'端或反义链序列的3'端，可以包括反向脱碱基残基。在下表6中显示了反向脱碱基脱氧核糖残基的化学结构。
137.β-enac rnai试剂本文公开的β-enac rnai试剂被设计为靶向β-enac基因(例如，seq id no:1 (genbank nm_000336.2)、seq id no:2 (genbank nm_000336.3))上的特异性位置。如本文定义的，当与基因碱基配对时，反义链的5'末端核碱基与其为从基因上的位置开始的下游(朝向3'端) 19个核苷酸的位置对齐时，反义链序列设计为在基因上的给定位置处靶向β-enac基因。例如，如本文表1和2中所示，设计为在位置987处靶向β-enac基因的反义链序列要求，当与该基因碱基配对时，反义链的5'末端核碱基与β-enac基因的位置1005对齐。
138.如本文提供的，β-enac rnai试剂并不要求在反义链的位置1 (5
′→3′
)处的核碱基与该基因互补，条件是反义链和跨越至少16个连续核苷酸的核心段序列的基因存在至少85%的互补性(例如，至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的互补性)。例如，对于本文公开的设计为靶向β-enac基因的位置987的β-enac rnai试剂，β-enac rnai试剂的反义链的5'末端核碱基必须与该基因的位置1005对齐；然而，反义链的5'末端核碱基可以但不要求与β-enac基因的位置1005互补，条件是反义链和跨越至少16个连续核苷酸的核心段序列的基因存在至少85%的互补性(例如，至少85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%的互补性)。如尤其通过本文公开的各种实例所示，该基因通过β-enac rnai试剂的反义链的特异性结合位点(例如，β-enac rnai试剂是否设计为在位
置987、位置1296、位置1798或一些其它位置处靶向β-enac基因)，对于通过β-enac rnai试剂实现的抑制水平是重要因子。
139.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂在表1中所示的β-enac基因序列的位置处或附近靶向β-enac基因。在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂的反义链包括核心段序列，其与表1中公开的靶β-enac 19聚体序列完全互补、基本上互补或至少部分互补。
140.表1. β-enac 19聚体mrna靶序列(取自智人(homo sapiens)钠通道上皮1 β亚基(scnn1b)，genbank nm_000336.2 (seq id no:1)) (本文的基因位置根据作为人scnn1b的参考基因的genbank nm_000336.2提及。在2020年2月3日左右，基因序列更新为nm_000336.3 (seq id no:2)。虽然提及更新的基因可能改变在本文的表1和2中鉴定为提及的“靶向基因位置”的编号，但这对公开的rnai试剂中描述的核苷酸序列没有影响)。
141.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包括反义链，其中反义链(5
′→3′
)的位置19能够与表1中公开的19聚体靶序列的位置1形成碱基对。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包括反义链，其中反义链(5
′→3′
)的位置1能够与表1中公开的19聚体靶序列的位置19形成碱基对。
142.在一些实施方案中，β-enac试剂包括反义链，其中反义链(5
′→3′
)的位置2能够与表1中公开的19聚体靶序列的位置18形成碱基对。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包括反义链，其中反义链(5
′→3′
)的位置2到18能够与位于表1中公开的19聚体靶序列的位置18到2处的相应互补碱基各自形成碱基对。
143.对于本文公开的rnai试剂，在反义链(从5’端
→3’
端)的位置1处的核苷酸可以与β-enac基因完全地互补，或者可以与β-enac基因不互补。在一些实施方案中，在反义链(从5’端
→3’
端)的位置1处的核苷酸是u、a或dt。在一些实施方案中，在反义链(从5’端
→3’
端)的位置1处的核苷酸与有义链形成a:u或u:a碱基对。
144.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包含表2或表3中的任何反义链序
列的核苷酸(从5’端
→3’
端) 2-18或2-19的序列。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链包含表2或表4中的任何有义链序列的核苷酸(从5’端
→3’
端) 1-17、1-18或2-18的序列。
145.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂由以下构成：(i)包含表2或表3中的任何反义链序列的核苷酸(从5’端
→3’
端) 2-18或2-19的序列的反义链，以及(ii)包含表2或表4中的任何有义链序列的核苷酸(从5’端
→3’
端) 1-17或1-18的序列的有义链。
146.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包括下表2中所示的核心19聚体核苷酸序列。
147.表2. beta-enac rnai试剂的反义链和有义链核心段碱基序列(n=任何核碱基；i = 肌苷核苷酸)
包含表2中的核苷酸序列或由表2中的核苷酸序列组成的β-enac rnai试剂的有义链和反义链，可以是修饰的核苷酸或未修饰的核苷酸。在一些实施方案中，具有包含表2中
的任何核苷酸序列或由表2中的任何核苷酸序列组成的有义链和反义链序列的β-enac rnai试剂，全部或基本上全部是修饰的核苷酸。
148.在一些实施方案中，本文公开的 β-enac rnai 试剂的反义链与表2中的任何反义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂的有义链与表2中的任何有义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。
149.如本文使用的，表2中公开的序列中列出的每个n可以独立地选自任何和所有核碱基(包括在修饰的和未修饰的核苷酸两者上发现的核碱基)。在一些实施方案中，表2中公开的序列中列出的n核苷酸具有与在另一条链的相应位置处的n核苷酸互补的核碱基。在一些实施方案中，表2中公开的序列中列出的n核苷酸具有与在另一条链的相应位置处的n核苷酸不互补的核碱基。在一些实施方案中，表2中公开的序列中列出的n核苷酸具有与在另一条链的相应位置处的n核苷酸相同的核碱基。在一些实施方案中，表2中公开的序列中列出的n核苷酸具有与在另一条链的相应位置处的n核苷酸不同的核碱基。
150.表3和表4中提供了某些修饰的β-enac rnai试剂的有义链和反义链。表3中提供了修饰的β-enac rnai试剂的反义链，以及其潜在的未修饰的核碱基序列。表4中提供了修饰的β-enac rnai试剂的有义链，以及其潜在的未修饰的核碱基序列。在形成β-enac rnai试剂时，上表3和表4以及表2中列出的每个潜在的碱基序列中的每个核苷酸，都可以是修饰的核苷酸。
151.本文所述的β-enac rnai试剂通过使反义链与有义链退火而形成。含有表2或表4中列出的序列的有义链，可以与含有表2或表3中列出的序列的任何反义链杂交，条件是两个序列具有在邻接的16、17、18、19、20或21个核苷酸序列上的至少85%互补性的区域。
152.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包含表2或表3中的任何序列的核苷酸序列。
153.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含双链体或由双链体组成，所述双链体具有表2、表3或表4中的任何序列的有义链和反义链的核碱基序列。
154.表3中提供了含有修饰的核苷酸的反义链的实例。表4中提供了含有修饰的核苷酸的有义链的实例。
155.如表3和表4中使用的，下述符号用于指示修饰的核苷酸、靶向基团和连接基团：a = 腺苷-3'-磷酸c = 胞苷-3'-磷酸g = 鸟苷-3'-磷酸u = 尿苷3'-磷酸i = 肌苷3'-磷酸a = 2'-o-甲基腺苷-3'-磷酸as = 2'-o-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯c = 2'-o-甲基胞苷-3'-磷酸cs = 2'-o-甲基胞苷-3'-硫代磷酸酯g = 2'-o-甲基鸟苷-3'-磷酸gs = 2'-o-甲基鸟苷-3'-硫代磷酸酯i = 2'-o-甲基肌苷-3'-磷酸
is = 2'-o-甲基肌苷-3'-硫代磷酸酯t = 2'-o-甲基-5-甲基尿苷-3'-磷酸ts = 2'-o-甲基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯u = 2'-o-甲基尿苷-3'-磷酸us = 2'-o-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯af = 2'-氟腺苷-3'-磷酸afs = 2'-氟腺苷-3'-硫代磷酸酯cf = 2'-氟胞苷-3'-磷酸cfs = 2'-氟胞苷-3'-硫代磷酸酯gf = 2'-氟鸟苷-3'-磷酸gfs = 2'-氟鸟苷-3'-硫代磷酸酯tf ＝ 2'-氟-5'-甲基尿苷-3'-磷酸tfs = 2'-氟-5'-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯uf = 2'-氟尿苷-3'-磷酸ufs = 2'-氟尿苷-3'-硫代磷酸酯dt = 2'-脱氧胸苷-3'-磷酸a
una = 2',3'-开环-腺苷-3'-磷酸a
una
s = 2',3'-开环-腺苷-3'-硫代磷酸酯c
una = 2',3'-开环-胞苷-3'-磷酸c
una
s = 2',3'-开环-胞苷-3'-硫代磷酸酯g
una = 2',3'-开环-鸟苷3'-磷酸g
una
s = 2',3'-开环-鸟苷3'-硫代磷酸酯u
una = 2',3'-开环-尿苷-3'-磷酸u
una
s = 2',3'-开环-尿苷-3'-硫代磷酸酯a_2n = 参见表6a_2ns = 参见表6(invab) = 反向脱碱基脱氧核糖核苷酸-5'-磷酸，参见表6(invab)s = 反向脱碱基脱氧核糖核苷酸-5'-硫代磷酸酯，参见表6s = 硫代磷酸酯键p = 末端磷酸酯(合成时)vpdn = 乙烯基膦酸酯脱氧核糖核苷酸cprpa = 5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷-3'-磷酸(参见表 6)cprpas = 5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基腺苷-3'-硫代磷酸酯(参见表 6)cprpu = 5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷-3'-磷酸(参见表 6)cprpus = 5'-环丙基膦酸酯-2'-o-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯(参见表 6)aalk = 2'-o-炔丙基腺苷-3'-磷酸，参见表 6aalks = 2'-o-炔丙基腺苷-3'-硫代磷酸酯，参见表 6calk = 2'-o-炔丙基胞苷-3'-磷酸，参见表 6calks = 2'-o-炔丙基胞苷-3'-硫代磷酸酯，参见表 6
galk = 2'-o-炔丙基鸟苷-3'-磷酸，参见表 6galks = 2'-o-炔丙基鸟苷-3'-硫代磷酸酯，参见表 6talk = 2'-o-炔丙基-5-甲基尿苷-3'-磷酸，参见表 6talks = 2'-o-炔丙基-5-甲基尿苷-3'-硫代磷酸酯，参见表6ualk = 2'-o-炔丙基尿苷-3'-磷酸，参见表 6ualks = 2'-o-炔丙基尿苷-3'-硫代磷酸酯，参见表 6(alk-ss-c6) = 参见表 6(c6-ss-alk) = 参见表 6(c6-ss-c6) = 参见表 6(6-ss-6) = 参见表 6(c6-ss-alk-me) = 参见表 6(nh2-c6) = 参见表 6(trialk#) = 参见表 6(trialk#)s = 参见表 6如本领域普通技术人员将容易理解的，除非由序列(例如，通过硫代磷酸酯键“s”) 另外指出，否则当存在于寡核苷酸中时，核苷酸单体通过5'-3'-磷酸二酯键互相连接。如本领域普通技术人员将清楚地理解的，如本文公开的修饰的核苷酸序列中所示的，硫代磷酸酯键的包括替换了寡核苷酸中通常存在的磷酸二酯键合。进一步地，本领域普通技术人员将容易理解，在给定寡核苷酸序列的3'端处的末端核苷酸，通常在给定单体的相应3'位置处具有羟基(-oh)而不是离体的磷酸部分。另外，对于本文公开的实施方案，当观察相应的链5
’→3’
时，反向脱碱基残基这样插入，使得脱氧核糖的3'位置在相应链上的先前单体的3'端处连接(参见例如，表6)。此外，如本领域普通技术人员将容易理解且了解的，尽管本文描绘的硫代磷酸酯化学结构通常显示在硫原子上的阴离子，但本文公开的本发明涵盖了所有硫代磷酸酯互变异构体(例如，其中硫原子具有双键且阴离子在氧原子上)。除非本文另外明确指出，否则当描述本文公开的β-enac rnai试剂和β-enac rnai试剂的组合物时，使用本领域普通技术人员的这种理解。
156.与本文公开的β-enac rnai试剂一起使用的靶向基团和连接基团的某些实例包括在下表6中提供的化学结构中。每条有义链和/或反义链可以具有与序列的5'和/或3'端缀合的本文列出的任何靶向基团或连接基团，以及其它靶向基团或连接基团。
157.表3. β-enac rnai 试剂的反义链序列
表4. β-enac试剂的有义链序列
本文公开的β-enac rnai试剂通过使反义链与有义链退火而形成。含有表2或表4中列出的序列的有义链，可以与含有表2或表3中列出的序列的任何反义链杂交，条件是两个序列具有在邻接的16、17、18、19、20或21个核苷酸序列上的至少85%互补性的区域。
158.如上表4中所示，某些示例性β-enac rnai试剂核苷酸序列显示为进一步包括在有
义链的5'末端和3'末端之一或两者处的反应性连接基团。例如，上表4中显示的许多β-enac rnai试剂的有义链序列具有在核苷酸序列的5'端处的(nh2-c6)连接基团或(trialk14)连接基团。类似地，上表4中显示的几个示例性β-enac rnai试剂的有义链核苷酸序列具有在核苷酸序列的3'端处的(6-ss-6)或(c6-ss-c6)连接基团。此类反应性连接基团放置为促进靶向配体、靶向基团和/或pk/pd调节剂与本文公开的β-enac rnai试剂的连接。连接或缀合反应是本领域众所周知的，并且提供了在两个分子或反应物之间的共价键合形成。用于本文的本发明范围中的合适的缀合反应包括但不限于酰胺偶联反应、迈克尔加成反应、腙形成反应、逆需求狄尔斯-阿尔德环加成反应、肟连接和铜(i)-催化或应变促进的叠氮化物-炔烃环加成反应。
159.在一些实施方案中，靶向配体，例如本文公开的实例和附图中所示的整联蛋白靶向配体，可以合成为活化酯例如四氟苯基(tfp)酯，其可以被反应性氨基(例如，nh2-c6)置换，以将靶向配体附着到本文公开的β-enac rnai试剂。在一些实施方案中，靶向配体被合成为叠氮化物，其可以例如经由铜(i)催化或应变促进的叠氮化物-炔烃环加成反应与炔丙基(例如trialk14)或dbco基团缀合。
160.另外，合成了上表4中显示的某些核苷酸序列，其具有在有义链的3'末端处的dt核苷酸，随后为(3
’ꢀ→ꢀ5’
)接头(例如，c6-ss-c6) (参见例如am10033-ss、am10293-ss、am10364-ss和am10365-ss)。在一些实施方案中，接头可以促进与另外组分例如pk/pd调节剂或者一种或多种靶向配体的键合。如本文所述，c6-ss-c6的二硫键首先被还原，从分子中去除dt，其然后可以促进所需pk/pd调节剂的缀合。因此，末端dt核苷酸并非完全缀合的构建体的部分。
161.在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂的反义链与表3中的任何反义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。在一些实施方案中，本文公开的β-enac rnai试剂的有义链与表4中的任何有义链序列相差0、1、2或3个核苷酸。
162.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包含表2或表3中的任何序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包含表2或表3中的任何序列的核苷酸(从5'端
→
3'端) 1-17、2-17、1-18、2-18、1-19、2-19、1-20、2-20、1-21、2-21、1-22、2-22、1-23、2-23、1-24或2-24的序列。在某些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包含表3中的任何一种修饰序列的修饰序列、或由其组成。
163.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链包含表2或表4中的任何序列的核苷酸序列。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链包含表2或表4中的任何序列的核苷酸(从5'端
→
3'端) 1-17、2-17、3-17、4-17、1-18、2-18、3-18、4-18、1-19、2-19、3-19、4-19、1-20、2-20、3-20、4-20、1-21、2-21、3-21、4-21、1-22、2-22、3-22、4-22、1-23、2-23、3-23、4-23、1-24、2-24、3-24或4-24的序列。在某些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链包含表3中的任何一种修饰序列的修饰序列、或由其组成。
164.对于本文公开的rnai试剂，在反义链(从5’端
→3’
端)的位置1处的核苷酸可以与β-enac基因完全地互补，或者可以与β-enac基因不互补。在一些实施方案中，在反义链(从5’端
→3’
端)的位置1处的核苷酸是u、a或dt (或者u、a或dt的修饰形式)。在一些实施方案中，在反义链(从5’端
→3’
端)的位置1处的核苷酸与有义链形成a:u或u:a碱基对。
165.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的反义链包含表2或表3中的任何反义链序
列的核苷酸(从5'端
→
3'端) 2-18或2-19的序列。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有义链包含表2或表4中的任何有义链序列的核苷酸(从5'端
→
3'端) 1-17或1-18的序列。
166.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包括(i)反义链，其包含表2或表3中的任何反义链序列的核苷酸(从5'端
→
3'端) 2-18或2-19的序列，以及(ii)有义链，其包含表2或表4中的任何有义链序列的核苷酸(从5'端
→
3'端) 1-17或1-18的序列。
167.含有表2或表4中列出的序列的有义链，可以与含有表2或表3中列出的序列的任何反义链杂交，条件是两个序列具有在邻接的16、17、18、19、20或21个核苷酸序列上的至少85%互补性的区域。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂具有由表4中任何修饰序列的修饰序列组成的有义链、以及由表3中任何修饰序列的修饰序列组成的反义链。某些代表性的序列配对通过表5a和5b中显示的双链体id no.例示。
168.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含双链体、由双链体组成或基本上由双链体组成，所述双链体通过本文呈现的双链体id no.中的任何一个表示。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂由本文呈现的任何双链体id no.组成。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含本文呈现的任何双链体id no.的有义链和反义链核苷酸序列。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含本文呈现的任何双链体id no.的有义链和反义链核苷酸序列，以及靶向基团、连接基团和/或其它非核苷酸基团，其中所述靶向基团、连接基团和/或其它非核苷酸基团与有义链或反义链共价连接(即，缀合)。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包括本文呈现的任何双链体id no.的有义链和反义链的修饰核苷酸序列。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含本文呈现的任何双链体id no.的有义链和反义链的修饰核苷酸序列，以及靶向基团、连接基团和/或其它非核苷酸基团，其中所述靶向基团、连接基团和/或其它非核苷酸基团与有义链或反义链共价连接。
169.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含反义链和有义链，其具有表2或表5a和5b的任何反义链/有义链双链体的核苷酸序列，并且进一步包含靶向基团。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含反义链和有义链，其具有表2或表5a和5b的任何反义链/有义链双链体的核苷酸序列，并且进一步包含一种或多种αvβ6整联蛋白靶向配体。
170.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含反义链和有义链，其具有表2或表5a和5b的任何反义链/有义链双链体的核苷酸序列，并且进一步包含其为整联蛋白靶向配体的靶向基团。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含反义链和有义链，其具有表2或表5a和5b的任何反义链/有义链双链体的核苷酸序列，并且进一步包含一种或多种αvβ6整联蛋白靶向配体或αvβ6整联蛋白靶向配体簇(例如，三齿αvβ6整联蛋白靶向配体)。
171.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含反义链和有义链，其具有表5a和5b的任何反义链/有义链双链体的修饰核苷酸序列。
172.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含反义链和有义链，其具有表5a和5b的任何反义链/有义链双链体的修饰核苷酸序列，并且进一步包含整联蛋白靶向配体。
173.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂包含表5a和5b的任何双链体、由表5a和5b的任何双链体组成、或基本上由表5a和5b的任何双链体组成。
174.表5a. 具有相应的有义链和反义链id编号的β-enac rnai试剂双链体双链体id反义链id有义链idad06283am08374-asam08373-ss
ad06284am08376-asam08375-ssad06285am08378-asam08377-ssad06286am08380-asam08379-ssad06287am08382-asam08381-ssad06494am08757-asam08756-ssad06495am08759-asam08758-ssad06496am08761-asam08760-ssad06497am08761-asam08762-ssad06498am08763-asam08760-ssad06499am08765-asam08764-ssad06500am08767-asam08766-ssad06501am08769-asam08768-ssad06598am08736-asam08939-ssad06599am08732-asam08940-ssad06600am08747-asam08941-ssad07054am09703-asam08939-ssad07055am09703-asam09705-ssad07095am09758-asam08762-ssad07099am09764-asam09763-ssad07100am09764-asam09765-ssad07217am08736-asam09964-ssad07240am09994-asam09763-ssad07241am09994-asam09995-ssad07242am09996-asam09763-ssad07243am09997-asam09763-ssad07244am09997-asam09995-ssad07250am10004-asam08939-ssad07251am10005-asam08939-ssad07252am10004-asam09964-ssad07253am10005-asam09964-ssad07254am09764-asam10006-ssad07255am09994-asam10006-ssad07280am08736-asam10033-ssad07281am10004-asam10033-ssad07351am10150-asam09763-ssad07473am09764-asam10293-ssad07482am08736-asam10319-ssad07506am09764-asam10364-ssad07507am08736-asam10365-ss
表5b. 对于修饰和未修饰的核苷酸序列，具有相应的有义链和反义链id编号和序列id编号的β-enac rnai试剂双链体
双链体asidas修饰的seqidno:as未修饰的seqidno:ssidss修饰的seqidno:ss未修饰的seqidno:ad06283am08374-as121189am08373-ss161211ad06284am08376-as122190am08375-ss162212ad06285am08378-as123191am08377-ss163213ad06286am08380-as124192am08379-ss164214ad06287am08382-as125193am08381-ss165215ad06494am08757-as129197am08756-ss166216ad06495am08759-as130198am08758-ss167217ad06496am08761-as131199am08760-ss168218ad06497am08761-as131199am08762-ss169219ad06498am08763-as132199am08760-ss168218ad06499am08765-as133190am08764-ss170220ad06500am08767-as134200am08766-ss171221ad06501am08769-as135201am08768-ss172222ad06598am08736-as127195am08939-ss173223ad06599am08732-as126194am08940-ss174224ad06600am08747-as128196am08941-ss175225ad07054am09703-as136202am08939-ss173223ad07055am09703-as136202am09705-ss176226ad07095am09758-as137199am08762-ss169219ad07099am09764-as138203am09763-ss177227ad07100am09764-as138203am09765-ss178227ad07217am08736-as127195am09964-ss179229ad07240am09994-as150203am09763-ss177227ad07241am09994-as150203am09995-ss180227ad07242am09996-as151210am09763-ss177227ad07243am09997-as152210am09763-ss177227ad07244am09997-as152210am09995-ss180227ad07250am10004-as153195am08939-ss173223ad07251am10005-as154195am08939-ss173223ad07252am10004-as153195am09964-ss179229ad07253am10005-as154195am09964-ss179229ad07254am09764-as138203am10006-ss181230ad07255am09994-as150203am10006-ss181230ad07280am08736-as127195am10033-ss182231ad07281am10004-as153195am10033-ss182231ad07351am10150-as155210am09763-ss177227ad07473am09764-as138203am10293-ss183232ad07482am08736-as127195am10319-ss184229ad07506am09764-as138203am10364-ss185232ad07507am08736-as127195am10365-ss186233
在一些实施方案中，β-enac rnai试剂作为盐、混合盐或游离酸制备或提供。在递送至表达β-enac基因的细胞后，本文所述的rnai试剂在体内和/或体外抑制或敲减一种或多种β-enac基因的表达。
175.靶向基团、连接基团、药代动力学/药效学(pk/pd)调节剂和递送媒介物在一些实施方案中，β-enac rnai试剂含有或缀合至一个或多个非核苷酸基团，其包括但不限于靶向基团、连接基团、药代动力学/药效学(pk/pd)调节剂、递送聚合物或递送媒介物。非核苷酸基团可以增强rnai试剂的靶向、递送或附着。非核苷酸基团可以与有义链和/或反义链的3’端和/或5’端共价连接。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂含有与有义
链的3’端和/或5’端连接的非核苷酸基团。在一些实施方案中，非核苷酸基团与β-enac rnai试剂的有义链的5'端连接。非核苷酸基团可以经由接头/连接基团与rnai试剂直接或间接连接。在一些实施方案中，非核苷酸基团经由不稳定的、可切割的或可逆的键或接头与rnai试剂连接。
176.在一些实施方案中，非核苷酸基团增强了它与之附着的rnai试剂或缀合物的药代动力学或生物分布特性，以改善缀合物的细胞或组织特异性分布和细胞特异性摄取。在一些实施方案中，非核苷酸基团增强了rnai试剂的内吞作用。
177.靶向基团或靶向部分增强了它们与之附着的缀合物或rnai试剂的药代动力学或生物分布特性，以改善缀合物或rnai试剂的细胞特异性(在一些情况下，包括器官特异性)分布和细胞特异性(或器官特异性)摄取。靶向基团可以是单价、二价、三价、四价的，或者对于它所针对的靶具有更高的效价。代表性的靶向基团包括但不限于对细胞表面分子具有亲和力的化合物，细胞受体配体，半抗原，抗体、单克隆抗体、抗体片段和抗体模拟物(对细胞表面分子具有亲和力)。在一些实施方案中，使用接头例如peg接头，或者一个、两个或三个脱碱基和/或核糖醇(脱碱基核糖)残基(其在一些情况下可以充当接头)，将靶向基团与rnai试剂连接。
178.具有或不具有接头的靶向基团可以附着到表2、3和4中公开的任何有义链和/或反义链的5'或3'端。具有或不具有靶向基团的接头可以附着到表2、3和4中公开的任何有义链和/或反义链的5'或3'端。
179.本文所述的β-enac rnai试剂可以合成为具有在5'末端和/或3'末端处的反应基团，例如氨基(在本文中也称为胺)。反应基团随后可以使用本领域通常的方法用于附着靶向部分。
180.例如，在一些实施方案中，合成了本文公开的β-enac rnai试剂，其具有在rnai试剂的有义链的5'末端处的nh
2-c6基团。随后可以使末端氨基与例如包括αvβ6整联蛋白靶向配体的基团反应，以形成具有该基团的缀合物。在一些实施方案中，合成了本文公开的β-enac rnai试剂，其具有在rnai试剂的有义链的5'末端处的一个或多个炔基。随后可以使末端炔基与例如包括αvβ6整联蛋白靶向配体的基团反应，以形成具有该基团的缀合物。
181.在一些实施方案中，靶向基团包含整联蛋白靶向配体。在一些实施方案中，整联蛋白靶向配体是αvβ6整联蛋白靶向配体。αvβ6整联蛋白靶向配体的使用促进细胞特异性靶向在其分别的表面上具有αvβ6的细胞，并且整联蛋白靶向配体的结合可以促进它与之连接的治疗剂例如rnai试剂进入细胞内，所述细胞例如上皮细胞，包括肺上皮细胞和肾上皮细胞。整联蛋白靶向配体可以是单体或单价的(例如，具有单个整联蛋白靶向部分)，或者多聚体或多价的(例如，具有多个整联蛋白靶向部分)。可以使用本领域已知的方法，将靶向基团附着到rnai寡核苷酸的3'和/或5'端。例如，在国际专利申请公开号wo 2018/085415和国际专利申请公开号wo 2019/089765中描述了靶向基团，例如αvβ6整联蛋白靶向配体的制备，所述国际专利申请各自的内容以其整体并入本文。
182.在一些实施方案中，靶向基团与β-enac rnai试剂连接，而无需使用另外的接头。在一些实施方案中，靶向基团被设计为具有容易存在的接头，以促进与β-enac rnai试剂的键合。在一些实施方案中，当组合物中包括两种或更多种rnai试剂时，可以使用相同的接头，将两种或更多种rnai试剂连接到其分别的靶向基团。在一些实施方案中，当组合物中包
括两种或更多种rnai试剂时，使用不同的接头，将两种或更多种rnai试剂连接到其分别的靶向基团。
183.在一些实施方案中，连接基团缀合至rnai试剂。连接基团促进了试剂与靶向基团、药代动力学调节剂、递送聚合物或递送媒介物的共价连接。连接基团可以连接至rnai试剂的有义链或反义链的3’端和/或5’端。在一些实施方案中，连接基团连接至rnai试剂的有义链。在一些实施方案中，连接基团缀合至rnai试剂的有义链的5’端或3’端。在一些实施方案中，连接基团缀合至rnai试剂的有义链的5'端。连接基团的实例包括但不限于：c6-ss-c6、6-ss-6、反应基团例如伯胺(例如nh2-c6)和炔烃、烷基、脱碱基残基/核苷酸、氨基酸、三炔烃官能化基团、核糖醇和/或peg基团。某些连接基团的实例在表6中提供。
184.接头或连接基团是两个原子之间的连接，其经由一个或多个共价键，将一个化学基团(例如rnai试剂)或目的区段与另一个化学基团(例如靶向基团、药代动力学调节剂或递送聚合物)或目的区段连接。不稳定键合含有不稳定键。键合可以任选地包括增加两个连接的原子之间的距离的间隔物。间隔物可以进一步增加键合的柔性和/或长度。间隔物包括但不限于烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基和芳炔基；其各自可以含有一个或多个杂原子、杂环、氨基酸、核苷酸和糖。间隔物基团是本领域众所周知的，并且先前的列表并不意味着限制本说明书的范围。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂缀合至聚乙二醇(peg)部分，或者缀合至具有12个或更多个碳原子的疏水基团，例如胆固醇或棕榈酰基。
185.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂连接到一种或多种药代动力学/药效学(pk/pd)调节剂。pk/pd调节剂可以通过改善的细胞受体结合、改善的细胞摄取和/或其它手段，来增加缀合药物的循环时间和/或增加rnai试剂的活性。适用于rnai试剂的各种pk/pd调节剂是本领域已知的。在一些实施方案中，pk/pd调节剂可以是胆固醇或胆固醇基衍生物，或者在一些情况下，pk/pd调节剂可以由烷基、烯基、炔基、芳基、芳烷基、芳烯基或芳炔基构成，所述基团各自可以是线性、分支、环状和/或取代或未取代的。在一些实施方案中，关于这些部分的附着定位在有义链的5'或3'端处，在有义链的任何给定核苷酸的核糖环的2'位置处，和/或在有义链的任何位置处附着至磷酸酯或硫代磷酸酯主链。
186.表2、3和4中列出的任何β-enac rnai试剂的核苷酸序列，无论是修饰的还是未修饰的，都可以含有3'和/或5'靶向基团、连接基团和/或pk/pd调节剂。含有3'或5'靶向基团、连接基团和/或pk/pd调节剂，在表3和4中列出或者在本文其它地方描述的任何β-enac rnai试剂序列，可以可替代地不含有3'或5'靶向基团、连接基团或pk/pd调节剂，或者可以含有不同的3'或5'靶向基团、连接基团或药代动力学调节剂，包括但不限于表6中描绘的那些。表5a和5b中列出的任何β-enac rnai试剂双链体，无论是修饰的还是未修饰的，都可以进一步包含靶向基团或连接基团，包括但不限于表6中所述的那些，并且靶向基团或连接基团可以附着至β-enac rnai试剂双链体的有义链或反义链的3’末端或5’末端。
187.某些修饰的核苷酸、加帽部分和连接基团的实例在表6中提供。
188.表6. 代表各种修饰的核苷酸、加帽部分和连接基团的结构
可替代地，可以使用本领域已知的其它连接基团。在许多情况下，连接基团可以在商业上获得，或者可替代地，掺入商购可得的核苷酸亚磷酰胺内。(参见例如，国际专利申请公开号wo 2019/161213，其通过引用以其整体并入本文)。
189.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂无需与靶向配体或药代动力学/药效学(pk/pd)调节剂缀合进行递送(称为“裸”或“裸rnai试剂”)。
190.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂缀合至靶向基团、连接基团、pk调节剂和/或另一种非核苷酸基团，以促进β-enac rnai试剂递送至选择的细胞或组织，例如体内的上皮细胞。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂缀合至靶向基团，其中所述靶向基团包括整联蛋白靶向配体。在一些实施方案中，整联蛋白靶向配体是αvβ6整联蛋白靶向配体。在一些实施方案中，靶向基团包括一种或多种αvβ6整联蛋白靶向配体。
191.在一些实施方案中，递送媒介物可以用于将rnai试剂递送至细胞或组织。递送媒
介物是改善rnai试剂对细胞或组织的递送的化合物。递送媒介物可以包括以下或由以下组成，但不限于此：聚合物，例如两亲性聚合物、膜活性聚合物、肽、蜂毒肽、蜂毒肽样肽(mlp)、脂质、可逆修饰的聚合物或肽、或者可逆修饰的膜活性多胺。
192.在一些实施方案中，rnai试剂可以与脂质、纳米颗粒、聚合物、脂质体、胶束、dpc或本领域可用于核酸递送的其它递送系统组合。rnai试剂也可以化学缀合至靶向基团、脂质(包括但不限于胆固醇基和胆固醇基衍生物)，封装在纳米颗粒、脂质体、胶束中，缀合至聚合物或dpc (参见例如wo 2000/053722、wo 2008/022309、wo 2011/104169和wo 2012/083185、wo 2013/032829、wo 2013/158141，其各自通过引用并入本文)，通过离子电渗疗法，或者通过掺入本领域可获得的其它递送媒介物或系统内，所述其它递送媒介物或系统例如水凝胶、环糊精、可生物降解的纳米胶囊、生物粘附性微球体或蛋白质载体。在一些实施方案中，rnai试剂可以缀合至对于肺上皮细胞具有亲和力的抗体。在一些实施方案中，rnai试剂可以连接到对于肺上皮细胞或肺上皮细胞上存在的受体具有亲和力的靶向配体。
193.药物组合物和制剂本文公开的β-enac rnai试剂可以制备为药物组合物或制剂(本文也称为“药剂”)。在一些实施方案中，药物组合物包括至少一种β-enac rnai试剂。这些药物组合物可特别用于抑制靶细胞、细胞群、组织或生物中的β-enac mrna表达。药物组合物可以用于治疗患有疾病、病症或状况的受试者，所述疾病、病症或状况将受益于靶mrna水平的降低或靶基因表达的抑制。药物组合物可以用于治疗处于发展疾病或病症的风险中的受试者，所述疾病或病症将受益于靶mrna水平的降低或靶基因表达的抑制。在一个实施方案中，该方法包括将如本文所述的与靶向配体连接的β-enac rnai试剂施用于待治疗的受试者。在一些实施方案中，将一种或多种药学上可接受的赋形剂(包括媒介物、载体、稀释剂和/或递送聚合物)加入包括β-enac rnai试剂的药物组合物中，从而形成适合于体内递送至受试者包括人的药物制剂或药剂。
194.本文公开的包括β-enac rnai试剂的药物组合物和方法减少了细胞、细胞群、细胞群、组织、器官或受试者中的靶mrna水平，其包括通过向受试者施用治疗有效量的本文所述的β-enac rnai试剂，从而抑制受试者中的β-enac mrna表达。在一些实施方案中，受试者先前已被鉴定或诊断为患有至少部分由enac表达介导的疾病或病症。在一些实施方案中，受试者先前已被鉴定或诊断为具有在一种或多种细胞或组织中增强的enac活性。在一些实施方案中，受试者先前已被诊断为患有一种或多种呼吸系统疾病，例如囊性纤维化、慢性支气管炎、非囊性纤维化支气管扩张、慢性阻塞性肺病(copd)、哮喘、呼吸道感染、原发性纤毛运动障碍和肺癌囊性纤维化。在一些实施方案中，受试者先前已被诊断为患有一种或多种眼部疾病，例如干眼症。在一些实施方案中，受试者已患有与一种或多种呼吸系统疾病相关的症状，所述呼吸系统疾病与增强的enac活性相关或由其引起。
195.本公开内容的实施方案包括用于将β-enac rnai试剂递送至体内肺上皮细胞的药物组合物。此类药物组合物可以包括例如与靶向基团缀合的β-enac rnai试剂，所述靶向基团包含整联蛋白靶向配体。在一些实施方案中，整联蛋白靶向配体由αvβ6整联蛋白配体构成。
196.在一些实施方案中，包括β-enac rnai试剂的所述药物组合物用于治疗或管理将受益于enac表达抑制的受试者中的临床表现。在一些实施方案中，将治疗或预防有效量的
一种或多种药物组合物施用于需要此类治疗的受试者。在一些实施方案中，任何公开的β-enac rnai试剂的施用可以用于减少受试者中的疾病症状的数目、严重性和/或频率。
197.在一些实施方案中，所述β-enac rnai试剂任选地与一种或多种另外的(即，第二、第三等)治疗剂组合。第二治疗剂可以是另一种β-enac rnai试剂(例如，靶向β-enac基因内的不同序列的β-enac rnai试剂)。在一些实施方案中，第二治疗剂可以是靶向α-enac基因的rnai试剂。另外的治疗剂也可以是小分子药物、抗体、抗体片段和/或适体。β-enac rnai试剂，连同或不连同一种或多种另外的治疗剂，可以与一种或多种赋形剂组合以形成药物组合物。
198.包括β-enac rnai试剂的所述药物组合物可以用于治疗患有疾病或病症的受试者中的至少一种症状，所述疾病或病症将受益于β-enac mrna表达的降低或抑制。在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的一种或多种药物组合物，所述药物组合物包括β-enac rnai试剂，从而治疗症状。在其它实施方案中，向受试者施用预防有效量的一种或多种β-enac rnai试剂，从而预防或抑制至少一种症状。
199.在一些实施方案中，将一种或多种所述β-enac rnai试剂在药学上可接受的载体或稀释剂中施用于哺乳动物。在一些实施方案中，哺乳动物是人。
200.施用途径是β-enac rnai试剂通过其与身体接触的路径。一般而言，施用药物、寡核苷酸和核酸用于治疗哺乳动物的方法是本领域众所周知的，并且可以应用于本文所述的组合物的施用。本文公开的β-enac rnai试剂可以在对特定途径适当定制的制剂中，经由任何合适的途径进行施用。因此，在一些实施方案中，本文所述的药物组合物经由吸入、鼻内施用、气管内施用或口咽抽吸施用进行施用。在一些实施方案中，药物组合物可以通过例如静脉内、肌内、皮内、皮下、关节内、或腹膜内或局部注射进行施用。
201.可以使用本领域已知的寡核苷酸递送技术，将包括本文所述的β-enac rnai试剂的药物组合物递送至细胞、细胞群、组织或受试者。一般而言，本领域公认的用于递送核酸分子(在体外或体内)的任何合适的方法，可以适于与本文所述的组合物一起使用。例如，可以通过局部施用(例如直接注射、植入或局部施用)、全身施用、或者皮下、静脉内、腹膜内或肠胃外途径，包括颅内(例如脑室内、实质内和鞘内)、肌内、经皮、气道(气溶胶)、鼻、经口、直肠或局部(包括颊和舌下)施用来递送。在一些实施方案中，组合物经由吸入、鼻内施用、口咽抽吸施用或气管内施用进行施用。例如，在一些实施方案中，期望本文所述的β-enac rnai试剂抑制肺上皮中的β-enac基因表达，对于其经由吸入(例如，通过吸入器装置例如计量吸入器，或喷雾器例如喷射或振动网孔喷雾器，或软雾吸入器)的施用是特别合适和有利的。
202.在一些实施方案中，本文所述的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。本文所述的药物组合物配制用于施用于受试者。
203.如本文使用的，药物组合物或药剂包括药理学有效量的至少一种所述治疗化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂。药学上可接受的一种或多种赋形剂是除活性药物成分(api，治疗产品，例如β-enac rnai试剂)外的物质，其有意包括在药物递送系统中。赋形剂在预期的剂量下并不发挥或并不预期发挥疗效。赋形剂可以作用于：a)在制造过程中有助于药物递送系统的加工，b)保护、支持或增强api的稳定性、生物利用度或患者接受度，c)帮助产品鉴定，和/或d)在贮存或使用过程中，增强api递送的总体安全性、有效性的任何其
它属性。药学上可接受的赋形剂可以是或可以不是惰性物质。
204.赋形剂包括但不限于：吸收增强剂、抗粘着剂、消泡剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、载体、包被剂、色素、递送增强剂、递送聚合物、去污剂、葡聚糖、葡萄糖、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填料、调味剂、助流剂、润湿剂、润滑剂、油、聚合物、防腐剂、盐水、盐、溶剂、糖、表面活性剂、悬浮剂、缓释基质、甜味剂、增稠剂、张度剂、媒介物、防水剂和湿润剂。
205.适合于注射用途的药物组合物包括无菌水溶液(当水溶性的时)或分散体，以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor
®ꢀ
eltm (basf，parsippany，nj)或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。它在制造和贮存的条件下应该是稳定的，并且应该针对微生物如细菌和真菌的污染作用进行防腐。载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)及其合适的混合物。适当的流动性可以例如通过以下得到维持：使用包衣例如卵磷脂，在分散体的情况下维持所需粒度，以及使用表面活性剂。在许多情况下，优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇如甘露糖醇、山梨糖醇和氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
206.可以通过将以所需量的活性化合物与根据需要的上文列举成分之一或组合一起掺入适当的溶剂中，随后过滤灭菌，来制备无菌注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入无菌媒介物内，来制备分散体，所述无菌媒介物含有基础分散介质和来自上文列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法包括真空干燥和冷冻干燥，这从其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
207.适合于关节内施用的制剂可以是药物的无菌水性制剂的形式，其可以是微晶形式，例如水性微晶悬浮液的形式。脂质体制剂或可生物降解的聚合物系统也可以用于呈递药物，用于关节内和眼内施用。
208.可以通过将以所需量的活性化合物掺入适当的溶剂中，随后为无菌过滤，来制备适合于吸入施用的制剂。一般而言，用于吸入施用的制剂是在生理ph下的无菌溶液并且具有低粘度(《 5 cp)。可以将盐加入制剂中，以平衡张力。在一些情况下，可以添加表面活性剂或助溶剂，以增加活性化合物的溶解度并改善气溶胶特性。在一些情况下，可以添加赋形剂来控制粘度，以便确保雾化液滴的大小和分布。
209.在一些实施方案中，可以在磷酸钠水性缓冲液中制备适合于吸入施用的药物制剂，其包括本文公开的β-enac rnai试剂(例如，在0.5 mm磷酸二氢钠、0.5 mm磷酸氢二钠的水溶液中配制的β-enac rnai试剂)。
210.活性化合物可以与载体一起制备，所述载体将保护化合物免于从体内快速消除，例如控释制剂，包括植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。此类制剂的制备方法对于本领域技术人员将是显而易见的。脂质体悬浮液也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法，例如如美国专利号4,522,811中所述进行制备。
211.β-enac rnai试剂可以以剂量单位形式在组合物中进行配制，用于施用的容易性和剂量的均匀性。剂量单位形式指物理上离散的单位，其适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量；每个单元含有预定数量的活性化合物，其计算为与所需的药物载体结合产生所需疗效。关于本公开内容的剂量单位形式的规格由以下指定且直接取决于其：活性化合物
的独特特征和待实现的疗效，以及配制此类活性化合物用于个体治疗的领域中固有的局限性。
212.药物组合物可以含有通常在药物组合物中发现的其它的另外组分。此类另外组分包括但不限于：止痒药、收敛药、局部麻醉药或消炎药(例如，抗组胺药、苯海拉明等)。还设想了表达或包含本文定义的rnai试剂的细胞、组织或分离的器官可以用作“药物组合物”。如本文使用的，“药理学有效量”、“治疗有效量”或简单地“有效量”指产生药理学、治疗或预防结果的rnai试剂的量。
213.在一些实施方案中，除施用本文公开的rnai试剂之外，本文公开的方法进一步包括施用第二治疗剂或治疗的步骤。在一些实施方案中，第二治疗剂是另一种β-enac rnai试剂(例如，靶向β-enac靶内的不同序列的β-enac rnai试剂)。在其它实施方案中，第二治疗剂可以是小分子药物、抗体、抗体片段和/或适体。
214.在一些实施方案中，本文描述的是组合物，其包括具有不同序列的至少两种β-enac rnai试剂的组合或混合物(cocktail)。在一些实施方案中，两种或更多种β-enac rnai试剂各自分开且独立地连接到靶向基团。在一些实施方案中，两种或更多种β-enac rnai试剂各自连接到靶向基团，所述靶向基团包括整联蛋白靶向配体或由其组成。在一些实施方案中，两种或更多种β-enac rnai试剂各自连接到靶向基团，所述靶向基团包括αvβ6整联蛋白靶向配体或由其组成。
215.本文描述的是用于将β-enac rnai试剂递送至肺上皮细胞的组合物。此外，本文一般描述了用于将β-enac rnai试剂在体内递送至细胞的组合物，所述细胞包括肾上皮细胞和/或gi或生殖道中的上皮细胞和/或眼中的眼表面上皮细胞。
216.一般地，本文公开的β-enac rnai试剂的有效量在约0.0001至约20 mg/kg体重/沉积剂量的范围内，例如约0.001至约5 mg/kg体重/沉积剂量。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有效量在约0.01 mg/kg至约3.0 mg/kg体重/沉积剂量的范围内。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有效量在约0.03 mg/kg至约2.0 mg/kg体重/沉积剂量的范围内。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有效量在约0.01至约1.0 mg/kg沉积剂量/体重的范围内。在一些实施方案中，β-enac rnai试剂的有效量在约0.50至约1.0 mg/kg沉积剂量/体重的范围内。施用的量也很可能取决于此类变量，如患者的总体健康状况、所递送的化合物的相对生物学功效、药物的制剂、制剂中赋形剂的存在和类型、以及施用途径。另外，应理解，可以将所施用的初始剂量增加到超过上述上限水平，以迅速达到所需的血液水平或组织水平，或者初始剂量可以小于最佳剂量。在一些实施方案中，每天施用一个剂量。在一些实施方案中，每周施用一个剂量。在进一步的实施方案中，每两周、每三周、每月一次或每季度一次(即每三个月一次)施用一个剂量。
217.为了治疗疾病或为了形成用于治疗疾病的药剂或组合物，本文所述的包括β-enac rnai试剂的药物组合物，可以与赋形剂或者第二治疗剂或治疗组合，所述第二治疗剂或治疗包括但不限于：第二或其它rnai试剂、小分子药物、抗体、抗体片段、肽和/或适体。
218.当加入药学上可接受的赋形剂或佐剂中时，所述的β-enac rnai试剂可以包装到试剂盒、容器、包装或分配器内。本文所述的药物组合物可以包装到干粉或气溶胶吸入器、其它计量吸入器、喷雾器、预填充的注射器或小瓶中。
219.治疗和抑制表达的方法
本文公开的β-enac rnai试剂可以用于治疗患有疾病或病症的受试者(例如人或其它哺乳动物)，所述疾病或病症将受益于rnai试剂的施用。在一些实施方案中，本文公开的rnai试剂可以用于治疗将受益于β-enac mrna表达的降低和/或抑制的受试者(例如人)。
220.在一些实施方案中，本文公开的rnai试剂可以用于治疗患有疾病或病症的受试者(例如人)，对于所述疾病或病症，受试者将受益于enac通道活性的降低，包括但不限于例如囊性纤维化、慢性支气管炎、非囊性纤维化支气管扩张、慢性阻塞性肺病(copd)、哮喘、呼吸道感染、原发性纤毛运动障碍和/或肺癌囊性纤维化和/或干眼症。受试者的治疗可以包括治疗性和/或预防性治疗。向受试者施用治疗有效量的本文所述的任何一种或多种β-enac rnai试剂。受试者可以是人、患者或人患者。受试者可以是成人、青少年、儿童或婴儿。本文所述的药物组合物的施用可以是对于人类或动物的。
221.已知增加的enac活性促进气道表面液体脱水并损害粘液纤毛清除。在一些实施方案中，所述的β-enac rnai试剂用于治疗受试者中的至少部分由enac活性水平介导的至少一种症状。向受试者施用治疗有效量的任何一种或多种所述β-enac rnai试剂。在一些实施方案中，向受试者施用预防有效量的任何一种或多种所述rnai试剂，从而通过预防或抑制至少一种症状来治疗受试者。
222.在某些实施方案中，本公开内容提供了用于治疗有此需要的患者中，至少部分由β-enac基因表达介导的疾病、病症、状况或病理状态的方法，其中所述方法包括向患者施用本文所述的任何β-enac rnai试剂。
223.在一些实施方案中，β-enac rnai试剂用于治疗或管理受试者中的临床表现或病理状态，其中所述临床表现或病理状态至少部分由enac表达介导。向受试者施用治疗有效量的本文所述的一种或多种β-enac rnai试剂，或者含β-enac rnai试剂的组合物。在一些实施方案中，该方法包括向待治疗的受试者施用包含本文所述的β-enac rnai试剂的组合物。
224.在一个进一步方面，本公开内容的特点在于治疗(包括预防性或预防治疗)由enac活性增强或升高引起的疾病或症状的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用β-enac rnai试剂，其包括包含表2或表3中的任何序列的序列的反义链。本文还描述的是用于此类方法中的组合物。
225.所述β-enac rnai试剂和/或包括β-enac rnai试剂的组合物可以用于治疗性治疗由增强或升高的enac活性水平引起的疾病或病症的方法中。此类方法包括将如本文所述的β-enac rnai试剂施用于受试者，例如人或动物受试者。
226.在另一个方面，本公开内容提供了用于治疗(包括预防性治疗)至少部分由β-enac表达介导的病理状态(例如状况或疾病)的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的rnai试剂，其包括包含表2或表3中的任何序列的序列的反义链。
227.在一些实施方案中，本文公开的是用于抑制β-enac基因表达的方法，其中所述方法包括向细胞施用rnai试剂，其包括包含表2或表3中的任何序列的序列的反义链。
228.在一些实施方案中，本文公开的是用于治疗(包括预防性治疗)至少部分由β-enac表达介导的病理状态的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的rnai试剂，其包括包含表2或表4中的任何序列的序列的有义链。
229.在一些实施方案中，本文公开的是用于抑制β-enac基因表达的方法，其中所述方
法包括向细胞施用rnai试剂，其包括包含表2或表4中的任何序列的序列的有义链。
230.在一些实施方案中，本文公开的是用于治疗(包括预防性治疗)至少部分由β-enac表达介导的病理状态的方法，其中所述方法包括向受试者施用治疗有效量的rnai试剂，其包括包含表4中的任何序列的序列的有义链、以及包含表3中的任何序列的序列的反义链。
231.在一些实施方案中，本文公开的是用于抑制β-enac基因表达的方法，其中所述方法包括向细胞施用rnai试剂，其包括包含表4中的任何序列的序列的有义链、以及包含表3中的任何序列的序列的反义链。
232.在一些实施方案中，本文公开的是抑制β-enac基因表达的方法，其中所述方法包括向受试者施用β-enac rnai试剂，其包括由表4中的任何序列的核碱基序列组成的有义链、以及由表3中的任何序列的核碱基序列组成的反义链。在其它实施方案中，本文公开的是抑制β-enac基因表达的方法，其中所述方法包括向受试者施用β-enac rnai试剂，其包括由表4中的任何修饰序列的修饰序列组成的有义链、以及由表3中的任何修饰序列的修饰序列组成的反义链。
233.在一些实施方案中，本文公开的是用于抑制细胞中的β-enac基因表达的方法，其中所述方法包括施用一种或多种β-enac rnai试剂，其包含表5a和5b中所示的双链体之一的双链体结构。
234.在一些实施方案中，相对于在施用β-enac rnai试剂之前的受试者、或未接受β-enac rnai试剂的受试者，在所述β-enac rnai试剂施用于其的受试者的某些上皮细胞中，β-enac基因的基因表达水平和/或mrna水平降低了至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%。在一些实施方案中，相对于在施用β-enac rnai试剂之前的受试者、或未接受β-enac rnai试剂的受试者，在所述β-enac rnai试剂施用于其的受试者的某些上皮细胞中，enac水平和/或enac通道活性水平降低了至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或大于99%。受试者中的基因表达水平、蛋白质水平和/或mrna水平在受试者的细胞、细胞群和/或组织中可以是降低的。在一些实施方案中，相对于在施用β-enac rnai试剂之前的受试者、或未接受β-enac rnai试剂的受试者，在所述β-enac rnai试剂已施用于其的受试者的某些上皮细胞中，β-enac mrna水平降低了至少约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。在一些实施方案中，相对于在施用β-enac rnai试剂之前的受试者、或未接受β-enac rnai试剂的受试者，在所述β-enac rnai试剂已施用于其的受试者中的某些上皮细胞中，enac异源三聚体蛋白质复合物的水平降低了至少约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。受试者中的enac水平在受试者的细胞、细胞群、组织、血液和/或其它流体中可以是降低的。例如，在一些实施方案中，相对于在施用β-enac rnai试剂之前的受试者、或未接受β-enac rnai试剂的受试者，在所述β-enac rnai试剂已施用于其的受试者的肺上皮细胞中，β-enac mrna和/或enac异源三聚体蛋白质复合物的水平降低了至少约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。在一些实施方案中，相对于在施用β-enac rnai试剂之前的受试者、或未接受β-enac rnai试剂的受试者，在所述β-enac rnai试剂已施用于其的受试者的肺上皮细胞子集例如气道上皮细胞中，β-enac mrna和/或enac异源三聚体蛋白质复合物的水平和/或enac通道活性水平降低了至少
约30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%。
235.可以通过本领域已知的任何方法，来评价基因表达、mrna和蛋白质水平的降低。β-enac mrna水平、enac通道活性水平和/或enac异源三聚体蛋白复合物水平的降低或减少，在本文中统称为β-enac的降低或减少或者抑制或降低β-enac基因的表达。本文阐述的实施例示出了用于评价β-enac基因表达抑制的已知方法。
236.细胞、组织、器官和非人生物考虑了包括本文所述的至少一种β-enac rnai试剂的细胞、组织、器官和非人生物。细胞、组织、器官或非人生物通过将rnai试剂递送至细胞、组织、器官或非人生物而制备。
237.现在通过下述非限制性实施例来说明上文提供的实施方案和项目。
实施例
238.实施例1. β-enac rnai试剂的合成。
239.根据下述合成了表5a和5b中所示的β-enac rnai试剂双链体：a. 合成。根据在寡核苷酸合成中使用的固相上的亚磷酰胺技术，合成β-enac rnai试剂的有义链和反义链。取决于规模，使用mermade96e
®ꢀ
(bioautomation)、mermade12
®ꢀ
(bioautomation)、或op pilot 100 (ge healthcare)。合成在由可控孔度玻璃(cpg，500
ꢀå
或600
å
，得自prime synthesis，aston，pa，usa)制成的固体支撑物上执行。所有rna和2'-修饰的rna亚磷酰胺都购自thermo fisher scientific (milwaukee，wi，usa)。具体而言，使用的2'-o-甲基亚磷酰胺包括下述：(5'-o-二甲氧基三苯甲基-n
6-(苯甲酰基)-2'-o-甲基-腺苷-3'-o-(2-氰乙基-n,n-二异丙基氨基)亚磷酰胺、5'-o-二甲氧基-三苯甲基-n
4-(乙酰基)-2'-o-甲基胞苷-3'-o-(2-氰乙基-n,n-二异丙基-氨基)亚磷酰胺、(5'-o-二甲氧基三苯甲基-n2-(异丁酰基)-2'-o-甲基鸟苷-3'-o-(2-氰乙基-n,n-二异丙基氨基)亚磷酰胺、以及5'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-o-甲基尿苷-3'-o-(2-氰乙基-n,n-二异丙基氨基)亚磷酰胺。2'-脱氧-2'-氟代亚磷酰胺携带与2'-o-甲基rna亚磷酰胺(amidite)相同的保护基团。5'-二甲氧基三苯甲基-2'-o-甲基-肌苷-3'-o-(2-氰乙基-n,n-二异丙基氨基)亚磷酰胺购自glen research (virginia)。反向脱碱基(3'-o-二甲氧基三苯甲基-2'-脱氧核糖-5'-o-(2-氰乙基-n,n-二异丙基氨基)亚磷酰胺购自chemgenes (wilmington，ma，usa)。使用下述una亚磷酰胺：5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-n6-(苯甲酰基)-2',3'-仲腺苷、2'-苯甲酰基-3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，5'(4,4'二甲氧基三苯甲基)-n-乙酰基-2',3'-仲胞嘧啶、2'-苯甲酰-3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺，5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-n-异丁酰基-2',3'-仲鸟苷，2'-苯甲酰基-3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺和5'-(4,4'-二甲氧基三苯甲基)-2',3'-仲尿苷、2'-苯甲酰基-3'-[(2-氰乙基)-(n,n-二异丙基)]-亚磷酰胺。tfa氨基连接的亚磷酰胺也是商业上购买的(thermofisher)。环丙基膦酸酯亚磷酰胺根据国际专利申请公开号wo 2017/214112进行合成。
[0240]
将含有三炔烃的亚磷酰胺溶解于无水二氯甲烷或无水乙腈(50 mm)中，而将所有其它亚酰胺溶解于无水乙腈(50 mm)中，并且添加分子筛(3
å
)。使用5-苄硫基-1h-四唑(btt，250 mm乙腈溶液)或5-乙硫基-1h-四唑(ett，250 mm乙腈溶液)作为活化剂溶液。偶联
时间为10分钟(rna)、90秒(2' o-me)和60秒(2' f)。为了引入硫代磷酸酯键，采用3-苯基1,2,4-二硫唑啉-5-酮(pos，得自polyorg，inc.，leominster，ma，usa)在无水乙腈中的100 mm溶液。
[0241]
可替代地，在合成后引入三炔烃部分(参见下文部分e)。对于这个途径，有义链用含有伯胺的5'和/或3'末端核苷酸进行官能化。将tfa氨基连接的亚磷酰胺溶解于无水乙腈(50 mm)中，并且添加分子筛(3
å
)。使用5-苄硫基-1h-四唑(btt，250 mm乙腈溶液)或5-乙硫基-1h-四唑(ett，250 mm乙腈溶液)作为活化剂溶液。偶联时间为10分钟(rna)、90秒(2' o-me)和60秒(2' f)。为了引入硫代磷酸酯键，采用3-苯基1,2,4-二硫唑啉-5-酮(pos，得自polyorg，inc.，leominster，ma，usa)在无水乙腈中的100 mm溶液。
[0242]
b. 支撑物结合的寡聚物的切割和脱保护。在固相合成完成之后，干燥的固体支撑物用40重量%的甲胺的水溶液和28%至31%的氢氧化铵溶液(aldrich)的1:1 体积溶液在30℃下处理1.5小时。将溶液蒸发，并且将固体残余物在水中重构(参见下文)。
[0243]
c. 纯化。使用tskgel superq-5pw 13
µ
m柱和shimadzu lc-8系统，通过阴离子交换hplc来纯化粗制的寡聚物。缓冲液a为20 mm tris，5 mm edta，ph 9.0，且含有20%的乙腈，并且缓冲液b与缓冲液a相同，伴随1.5 m氯化钠的添加。记录在260 nm处的uv迹线。将适当的级分合并，然后使用装有sephadex g25细粉的ge healthcare xk 16/40柱，伴随100mm碳酸氢铵，ph 6.7和20%乙腈的运行缓冲液，在尺寸排阻hplc上运行。可替代地，将合并的级分脱盐，并经由切向流过滤交换到适当的缓冲液或溶剂系统内。
[0244]
d. 退火。通过在1
×ꢀ
pbs (磷酸盐缓冲盐水，1
×
，corning，cellgro)中组合等摩尔的rna溶液(有义和反义)，来混合互补链，以形成rnai试剂。将一些rnai试剂冻干并贮存于-15至-25℃下。通过在1
×ꢀ
pbs中，在uv-vis光谱仪上测量溶液的吸光度，来确定双链体浓度。然后将在260 nm处的溶液吸光度乘以换算因子(0.050 mg/(ml
∙
cm))和稀释因子，以确定双链体浓度。
[0245]
e. 三炔烃接头的缀合。在一些实施方案中，三炔烃接头作为亚磷酰胺与树脂上的rnai试剂的有义链缀合(关于示例性三炔烃接头亚磷酰胺的合成参见实施例1g，并且关于亚磷酰胺的缀合参见实施例1a。)。在其它实施方案中，三炔烃接头可以如下所述在从树脂中切割之后缀合至有义链：在退火之前或之后，在一些实施方案中，5'或3'胺官能化的有义链缀合至三炔烃接头。可以用于形成本文公开的构建体的示例性三炔烃接头结构如下：。
[0246]
为了将三炔烃接头与退火的双链体缀合，将胺官能化的双链体以~50-70 mg/ml溶
解于90% dmso/10% h2o中。加入40当量三乙胺，随后为3当量三炔烃-pnp。完成后，将缀合物在1x磷酸盐缓冲盐水/乙腈(1:14比率)的溶剂系统中沉淀两次，并且干燥。
[0247]
f. 靶向配体sm6.1的合成((s)-3-(4-(4-((14-叠氮基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)氧基)萘-1-基)苯基)-3-(2-(4-((4-甲基吡啶-2-基)氨基)丁酰胺基)乙酰胺基)丙酸)将化合物5 (叔丁基(4-甲基吡啶-2-基)氨基甲酸酯) (0.501 g，2.406 mmol，1当量)溶解于dmf (17 ml)中。向混合物中加入nah (0.116 mg，3.01 mmol，1.25当量，在油中的60%分散体)。将混合物搅拌10分钟，然后加入化合物20 (4-溴丁酸乙酯(0.745 g，3.82 mmol，0.547 ml)) (sigma 167118)。3小时后，反应用乙醇(18 ml)猝灭且浓缩。将浓缩物溶解于dcm (50 ml)中，并且用nacl饱和水溶液(1 x 50 ml)洗涤，在na2so4上干燥，过滤且浓缩。产物在梯度为0-5%甲醇的dcm溶液的硅胶柱上进行纯化。
[0248]
将化合物21 (0.80 g，2.378 mmol)溶解于100 ml丙酮: 0.1 m naoh [1:1]中。通过tlc (5%乙酸乙酯的己烷溶液)监测反应。将有机物浓缩掉，并且用0.3m柠檬酸(40 ml)将残余物酸化至ph 3-4。用dcm (3 x 75 ml)提取产物。将有机物合并，在na2so4上干燥，过滤且浓缩。产物无需进一步纯化而使用。
[0249]
在0℃下，向化合物22 (1.1 g，3.95 mmol，1当量)、化合物45 (595 mg，4.74 mmol，1.2当量)和tbtu (1.52 g，4.74 mmol，1.2当量)的无水溶液dmf (10 ml)中，加入二异丙基乙胺(2.06 ml，11.85 mmol，3当量)。将反应混合物升温至室温并搅拌3小时。用饱和nahco3溶液(10 ml)猝灭反应。用乙酸乙酯(3 x 10 ml)提取水相，并且将有机相合并，在无水na2so4上干燥且浓缩。使用硅胶作为固定相，通过combiflash
®
分离产物。lc-ms：计算值[m h] 366.20，实测值367。
[0250]
在0℃下，向化合物61 (2 g，8.96 mmol，1当量)和化合物62 (2.13 ml，17.93 mmol，2当量)的无水dmf (10 ml)溶液中，加入k2co
3 (2.48 g，17.93 mmol，2当量)。将反应混合物升温至室温并搅拌过夜。用水(10 ml)猝灭反应。用乙酸乙酯(3 x 10 ml)提取水相，并且将有机相合并，在无水na2so4上干燥且浓缩。使用硅胶作为固定相，通过combiflash
®
分离产物。
[0251]
在0℃下，向化合物60 (1.77 g，4.84 mmol，1当量)在thf (5 ml)和h2o (5 ml)中的溶液中，分份加入氢氧化锂一水合物(0.61 g，14.53 mmol，3当量)。将反应混合物升温至室温。在室温下搅拌3小时后，通过hcl (6 n)将反应混合物酸化至ph 3.0。用乙酸乙酯(3 x 20 ml)提取水相，并且将有机层合并，在na2so4上干燥且浓缩。lc-ms：计算值[m h] 352.18，实测值352。
[0252]
在78℃下，向化合物63 (1.88 g，6.0 mmol，1.0当量)的无水thf (20 ml)溶液中，逐滴加入n-buli的己烷溶液(3.6 ml，9.0 mmol，1.5当量)。将反应在-78℃再保持1小时。然后在-78℃下，将硼酸三异丙酯(2.08 ml，9.0 mmol，1.5当量)加入混合物内。然后将反应升温至室温并且再搅拌1小时。通过饱和nh4cl溶液(20 ml)猝灭反应，并且将ph调整至3。用etoac (3 x 20 ml)提取水相，并且将有机相合并，在na2so4上干燥且浓缩。
[0253]
将化合物12 (300 mg，0.837 mmol，1.0当量)、化合物65 (349 mg，1.256 mmol，1.5当量)、xphos pd g2 (13 mg，0.0167 mmol，0.02当量)和k3po
4 (355 mg，1.675mmol，2.0当量)在圆底烧瓶中混合。将烧瓶用螺旋盖隔膜密封，然后抽真空并用氮回填(这个过程总共重复3次)。然后，经由注射器加入thf (8 ml)和水(2 ml)。将混合物用氮鼓泡20分钟，并且将反应在室温下保持过夜。用水(10 ml)猝灭反应，并且用乙酸乙酯(3
ꢀ×ꢀ
10 ml)提取水相。使有机相在na2so4上干燥，浓缩，并且使用硅胶作为固定相经由combiflash
®
进行纯化，并且用15% etoac的己烷溶液洗脱。lc-ms：计算值[m h] 512.24，实测值512.56。
[0254]
通过冰浴来冷却化合物66 (858 mg，1.677 mmol，1.0当量)。将hcl的二噁烷溶液(8.4 ml，33.54 mmol，20当量)加入烧瓶内。将反应升温至室温并且再搅拌1小时。通过旋转蒸发器去除溶剂，并且产物无需进一步纯化而直接使用。lc-ms：计算值[m h] 412.18，实测值412.46。
[0255]
在0℃下，向化合物64 (500 mg，1.423 mmol，1当量)、化合物67 (669 mg，1.494 mmol，1.05当量)和tbtu (548 mg，0.492 mmol，1.2当量)的无水dmf (15 ml)溶液中，加入二异丙基乙胺(0.744 ml，4.268 mmol，3当量)。将反应混合物升温至室温并且再搅拌1小时。通过nahco3饱和水溶液(10 ml)猝灭反应，并且用乙酸乙酯(3 x 20 ml)提取产物。将有机相合并，在na2so4上干燥且浓缩。产物通过使用硅胶作为固定相的combiflash
®
进行纯化，并且用3-4%甲醇的dcm溶液进行洗脱。产率为96.23%。lc-ms：计算值[m h] 745.35，实测值746.08。
[0256]
在室温下，向化合物68 (1.02 g，1.369 mmol，1当量)的乙酸乙酯(10 ml)溶液中，加入10% pd/c (0.15 g，50% h2o)。将反应混合物升温至室温，并且通过lc-ms监测反应。将反应在室温下保持过夜。通过celite
®
过滤固体并通过旋转蒸发器去除溶剂。产物无需进一步纯化而直接使用。lc-ms：[m h] 655.31，实测值655.87。
[0257]
在0℃下，向化合物69 (100 mg，0.152 mmol，1当量)和叠氮基-peg
5-ots (128 mg，0.305 mmol，2当量)的无水dmf (2ml)溶液中，加入k2co
3 (42 mg，0.305 mmol，2当量)。在80℃下，将反应混合物搅拌6小时。通过饱和nahco3溶液猝灭反应，并且用乙酸乙酯(3x10 ml)提取水层。将有机相合并，在na2so4上干燥且浓缩。lc-ms：计算值[m h] 900.40，实测值901.46。
[0258]
在室温下，向化合物72 (59 mg，0.0656 mmol，1.0当量)在thf (2 ml)和水(2 ml)中的溶液中，加入氢氧化锂(5 mg，0.197 mmol，3.0当量)。在室温下，将混合物再搅拌1小时。通过hcl (6n)将ph调整至3.0，并且用etoac (3 x 10 ml)提取水相。将有机相合并，在na2so4上干燥且浓缩。将tfa (0.5 ml)和dcm (0.5 ml)加入残余物中，并且在室温下将混合物再搅拌3小时。通过旋转蒸发器去除溶剂。lc-ms：计算值[m h] 786.37，实测值786.95。
[0259]
g. trialk 14的合成如上表6中所示的trialk14和(trialk14)s可以使用下文所示的合成路线进行合成。可以使用标准寡核苷酸合成技术，将化合物14作为亚磷酰胺加入有义链中，或可以在酰胺偶联反应中，将化合物22缀合至包含胺的有义链。
[0260]
向3-l夹套反应器中加入500 ml dcm和4 (75.0 g，0.16 mol)。将反应的内部温度冷却至0℃并加入tbtu (170.0 g，0.53 mol)。然后用胺5 (75.5 g，0.53 mol)逐滴处理悬浮液，保持内部温度低于5℃。然后用dipea (72.3 g，0.56 mol)缓慢处理反应，保持内部温度低于5℃。在添加完成后，反应在1小时内升温至23℃，并允许搅拌3小时。加入所有三种试剂的10%的启动装料(kicker charge)，并且允许再搅拌3小时。当剩余《1%的4时，反应被视为完成。将反应混合物用饱和氯化铵溶液(2 x 500 ml)洗涤，并且用饱和碳酸氢钠溶液(500 ml)洗涤一次。然后将有机层在硫酸钠上干燥且浓缩为油。粗制油的质量为188 g，其通过qnmr含有72%的6。将粗制油带入下一步。关于c
46h60
n4o
11
计算的质量= 845.0 m/z。实测的[m h] = 846.0。
[0261]
将含有72重量%化合物6 (86.0 g，0.10 mol)的121.2 g粗制油溶解于dmf (344ml)中，并且用tea (86 ml，20 v/v%)处理，保持内部温度低于23℃。经由hplc方法1 (图2)监测相对于fmoc-胺6消耗的二苯并富烯(dbf)的形成，并且反应在10小时内完成。向溶液中加入戊二酸酐(12.8 g，0.11 mol)，并且中间体胺7在2小时内转换为化合物8。在完成后，在30℃下在减压下去除dmf和tea，得到100 g粗制油。由于化合物7在水中的高溶解度，不能使用水性后处理，并且层析是去除dbf、tmu和戊二酸酐的唯一方式。粗制油(75 g)在teledyne isco combi-flash
®
纯化系统上以三份进行纯化。将粗制油(25 g)装载到330 g硅胶柱上，并且在30分钟内从0
ꢀ–ꢀ
20%甲醇/dcm中洗脱，得到42 g化合物8 (经过3个步骤54%产率)。关于c
36h55
n4o
12
计算的质量 = 736.4m/z。实测的[m h] = 737.0。
[0262]
化合物8 (42.0 g，0.057 mol)在使用之前与10体积的乙腈共汽提，以从层析溶剂中去除任何残留的甲醇。将油重新溶解于dmf (210 ml)中并冷却至0℃。溶液用4-硝基苯酚(8.7 g，0.063 mol)，随后为edc-盐酸盐(12.0 g，0.063 mol)进行处理，并且发现反应在10小时内完成。将溶液冷却至0℃，并且加入10体积的乙酸乙酯，随后为10体积的饱和氯化铵溶液，保持内部温度低于15℃。允许各层分开，并且用卤水洗涤乙酸乙酯层。合并的水层用5体积的乙酸乙酯提取两次。合并的有机层在硫酸钠上干燥且浓缩为油。粗制油(55 g)在teledyne isco combi-flash
®
纯化系统上以三份进行纯化。将粗制油(25 g)装载到330 g硅胶柱上，并且在30分钟内从0
ꢀ–ꢀ
10%甲醇/dcm中洗脱，得到22 g纯9 (化合物22) (50%产
率)。关于c
42h59
n5o
14
计算的质量 = 857.4 m/z。实测的[m h] = 858.0。
[0263]
用三乙胺(11.56g，111.4 mmol)逐滴处理酯9 (49.0 g，57.1 mmol)和6-氨基-1-己醇(7.36 g，6.28 mmol)的二氯甲烷(3体积)溶液。通过在hplc方法1上观察化合物9的消失来监测反应，并且发现反应在10分钟内完成。粗制反应混合物用5体积的二氯甲烷稀释，并且用饱和氯化铵(5体积)和卤水(5体积)洗涤。有机层在硫酸钠上干燥且浓缩为油。使用330 g硅胶柱，在teledyne isco combi-flash
®
纯化系统上纯化粗制油。用100%乙酸乙酯洗脱4-硝基苯酚，并且使用20%甲醇/dcm从柱中冲洗10，得到无色油(39 g，81%产率)。关于c
42h69
n5o
12
计算的质量 = 836.0 m/z。实测的[m h] = 837.0。
[0264]
使醇10与10体积的乙腈共汽提两次，以从层析溶剂中去除任何残留的甲醇，并且再与无水二氯甲烷(kf 《 60 ppm)共汽提一次，以去除痕量水。将醇10 (2.30 g，2.8 mmol)溶解于5体积的无水二氯甲烷(kf 《 50 ppm)中，并且用二异丙基铵盐四氮唑(188 mg，1.1 mmol)进行处理。将溶液冷却至0℃，并且用2-氰乙基n,n,n',n'-四异丙基亚磷酰胺(1.00 g，3.3 mmol)逐滴处理。将溶液从冰浴中取出并在20℃下搅拌。发现反应在3
ꢀ‑ꢀ
6小时内完成。将反应混合物冷却至0℃，并且用10体积的饱和碳酸氢铵/卤水的1:1溶液处理，然后在1分钟内升温至环境温度，并且允许在20℃下再搅拌3分钟。将双相混合物转移到分液漏斗中，并加入10体积的二氯甲烷。将有机层分开，并且用10体积的饱和碳酸氢钠溶液洗涤，以水解未反应的双磷试剂。有机层在硫酸钠上干燥且浓缩为油，得到3.08 g 94重量%的化合物14。关于c
51h86
n7o
13
p计算的质量= 1035.6 m/z。实测的[m h] = 1036。
[0265]
h. 靶向配体的缀合。在退火之前或之后，使5'或3'三齿炔烃官能化的有义链与靶向配体缀合。下述实例描述了靶向配体与退火双链体的缀合：在去离子水中制备0.5m三(3-羟丙基三唑基甲基)胺(thpta)、0.5m五水硫酸铜(ii) (cu(ii)so
4 · 5h2o)的储备溶液和抗坏血酸钠的2m溶液。制备靶向配体在dmso中的75 mg/ml溶液。在含有三炔烃官能化的双链体(3mg，75
µ
l，40mg/ml去离子水溶液，~15,000 g/mol)的1.5 ml离心管中，加入25
ꢀµ
l 1m hepes ph 8.5缓冲液。在涡旋后，加入35
ꢀµ
l dmso，并且使溶液涡旋。将靶向配体加入反应中(6当量/双链体，2当量/炔烃，~15μl)，并且使溶液涡旋。使用ph试纸，检查ph并确认为ph ~8。在分开的1.5 ml离心管中，将50
ꢀµ
l 0.5m thpta与10ul 0.5m cu(ii)so
4 · 5h2o混合，涡旋且在室温下温育5分钟。5分钟后，将thpta/cu溶液(7.2
ꢀµ
l，6当量5:1 thpta:cu)加入
反应小瓶中并涡旋。之后立即将2m抗坏血酸盐(5
ꢀµ
l，50当量/双链体，16.7/炔烃)加入反应小瓶中并涡旋。一旦反应完成(通常在0.5-1小时内完成)，立即通过非变性阴离子交换层析来纯化反应。
[0266]
实施例2. β-enac rnai试剂在大鼠中的体内气管内施用。
[0267]
在研究的第1天时，经由适合于气管内(it)施用的微型喷雾器装置(penn century，philadelphia，pa)，向雄性sprague dawley大鼠施用200微升的等渗盐水，或者0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或2 mg/kg的β-enac rnai试剂ad06284，或者0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或2 mg/kg的β-enac rnai试剂ad06285 (每种rnai试剂未与靶向配体连接并在等渗盐水中配制)。向四(4)只大鼠/组给药。在研究的第8天时处死大鼠，并且在收集和匀浆之后，从两个肺中分离总rna。大鼠β-enac (scnn1b) mrna表达通过基于探针的定量pcr进行定量，针对大鼠gapdh表达进行标准化，并且表示为媒介物对照组的分数(几何平均值， /
‑ꢀ
95%置信区间)。
[0268]
表7. 在实施例2中在处死(第8天)时的平均相对大鼠β-enac mrna表达实施例3. 与上皮细胞靶向配体缀合的β-enac rnai试剂在大鼠中的体内气管内施用。
[0269]
在研究的第1天时，经由适合于气管内(it)施用的微型喷雾器装置(penn century，philadelphia，pa)，向雄性sprague dawley大鼠施用200微升的等渗盐水，或者在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1，参见图3)缀合的0.5 mg/kg、1.0 mg/kg或2.0 mg/kg的β-enac rnai试剂ad06284。向五(5)只大鼠/组给药。在研究的第8天时处死大鼠，并且在收集和匀浆之后，从两个肺中分离总rna。大鼠β-enac (scnn1b) mrna表达通过基于探针的定量pcr进行定量，针对大鼠gapdh表达进行标准化，并且表示为媒介物对照组的分数(几何平均值， /
‑ꢀ
95%置信区间)。
[0270]
表8. 在实施例3中在处死(第8天)时的平均相对rβ-enac mrna表达
实施例4. 与上皮细胞靶向配体缀合的β-enac rnai试剂在大鼠中的体内气管内施用。
[0271]
在研究的第1天时，经由适合于气管内(it)施用的微型喷雾器装置(penn century，philadelphia，pa)，向雄性sprague dawley大鼠施用200微升用作对照的等渗盐水媒介物、或者根据表9中所述的下述给药组的下述β-enac rnai试剂之一：表9. 实施例4中大鼠的给药组
组rnai试剂和剂量1等渗盐水(无rnai试剂)2在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的0.5mg/kgad06284。3在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的0.5mg/kgad06499。4在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的0.5mg/kgad06494。5在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的0.5mg/kgad06495。6在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的0.5mg/kgad06496。7在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的0.5mg/kgad06497。8在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的0.5mg/kgad06498。9在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的0.5mg/kgad06501。
(关于tri-sm6.1的化学结构，参见例如图3)。
[0272]
向在每组中的五(5)只大鼠给药(n＝5)。在研究的第8天时处死大鼠，并且在收集和匀浆之后，从两个肺中分离总rna。大鼠β-enac (scnn1b) mrna表达通过基于探针的定量pcr进行定量，针对大鼠gapdh表达进行标准化，并且表示为媒介物对照组的分数(几何平均值， /
‑ꢀ
95%置信区间)。
[0273]
表10. 在实施例4中在处死(第8天)时的平均相对rβ-enac mrna表达
组id平均相对rβ-enacmrna表达低(误差)高(误差)组1(等渗盐水)1.0000.1610.192组2(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06284)0.8770.1730.216组3(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06499)0.8270.1300.154组4(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06494)0.6230.0720.081组5(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06495)0.8870.0830.092
组6(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06496)0.7750.0920.104组7(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06497)0.5580.0570.064组8(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06498)0.8730.0700.076组9(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06501)0.7500.1520.190
实施例5. 与上皮细胞靶向配体缀合的β-enac rnai试剂在大鼠中的体内气管内施用。
[0274]
在研究的第1天时，经由适合于气管内(it)施用的微型喷雾器装置(penn century，philadelphia，pa)，向雄性sprague dawley大鼠施用200微升用作对照的等渗盐水媒介物、或者根据表11中所述的下述给药组的下述β-enac rnai试剂之一：表11. 实施例5中大鼠的给药组
组rnai试剂和剂量收获日1等渗盐水(无rnai试剂)第8天2在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的1.0mg/kgad06497。第8天3在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的1.0mg/kgad06497。第15天4在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的1.0mg/kgad06497。第22天
(关于tri-sm6.1的化学结构，参见例如图3)。
[0275]
向每组(n=5)中的五(5)只大鼠给药。根据上表11中的时间表，在第8、15或22天时处死大鼠，并且在收集和匀浆之后，从两个肺中分离总rna。β-enac (scnn1b) mrna表达通过基于探针的定量pcr进行定量，针对gapdh表达进行标准化，并且表示为媒介物对照组的分数(几何平均值， /
‑ꢀ
95%置信区间)。
[0276]
表12. 在实施例5中在处死时的平均相对renac mrna表达
组id平均相对rβ-enacmrna表达低(误差)高(误差)组1(等渗盐水，第8天收获)1.0000.0990.110组2(1.0mg/kgtri-sm6.1-ad06497，第8天收获)0.4910.0350.037组3(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06497，第15天收获)0.4970.0610.070组4(0.5mg/kgtri-sm6.1-ad06497，第22天收获)0.4360.0620.073
实施例6. 与上皮细胞靶向配体缀合的β-enac rnai试剂在绵羊中的气溶胶化施用。
[0277]
粘液纤毛清除(mcc)已显示与囊性纤维化(cf)患者中的肺功能改善(fev1)相关联。首先通过吸入气溶胶化的锝标记的硫胶体在正常绵羊中测量mcc，随后为在两个小时内的伽马成像以确定基线水平。在建立基线后三天开始，在研究第1、2和3天时的连续三天内(即三个总剂量)，正常绵羊接受在等渗盐水中配制的，单次每日吸入沉积剂量的0.22 mg/kg或0.5 mg/kg的气溶胶化的β-enac rnai试剂ad06598，所述ad06598在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合(在图9和20中称为aperc-2)。将以10 mg/ml浓度的β-enac rnai试剂ad06598的17.5 ml (0.5 mg/kg)或8.75 ml (0.22 mg/kg)给药体积气溶胶化，并且经由鼻插管施用于绵羊。测试每组中的三只绵羊(n=3)。在第17天时(在最后一个剂量后两周)，再次向绵羊施用气溶胶化的锝标记的硫胶体的吸入，随后为在两个小时内的伽马成像。
[0278]
如图9中所示，β-enac rnai试剂的施用剂量依赖性地显示了在给药后两周高于基
线测量的mcc增加。观察到的mcc加速与改善的气道水合一致。
[0279]
实施例7. 与上皮细胞靶向配体缀合的β-enac rnai试剂在绵羊中的气溶胶化施用。
[0280]
β-enac rnai试剂在绵羊粘液纤毛清除(mcc)模型中进行评估。首先通过吸入气溶胶化的锝标记的硫胶体在正常绵羊中测量mcc，随后为在两个小时内的伽马成像以确定基线水平。在建立基线后三天开始，在研究第1、2和3天时的连续三天内(即三个总剂量)，正常绵羊接受单次吸入沉积剂量的0.5 mg/kg的以下：1)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad06598 (称为aperc-2)；或2)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07099 (称为aperc-5)。将以10 mg/ml浓度的每种分别的β-enac rnai试剂的17.5 ml给药体积气溶胶化，并且经由鼻插管施用于绵羊。用aperc-2测试了一只绵羊(n=1)，并且在aperc-5组中测试了三只绵羊(n=3)。在第14天时(在单次剂量后两周)，再次向绵羊施用气溶胶化的锝标记的硫胶体的吸入，随后为在两个小时内的伽马成像。
[0281]
例如，当完全缀合且退火时，aperc-2具有下述有义链和反义链结构：修饰的有义链(5
’→ꢀ3’
)：(trism6.1-avb6-ta14)gscaacuguufafcfaucuucaacus(invab) (seq id no: 246)修饰的反义链(5
’→ꢀ3’
)：asgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no: 127)关于(trism6.1-avb6-ta14)的结构，参见图22。
[0282]
有义链潜在的碱基序列(5
’→ꢀ3’
)gcaacuguuacaucuucaacu (seq id no: 223)反义链潜在的碱基序列(5
’→ꢀ3’
)aguugaagauguaacaguugc (seq id no: 195)进一步地，例如，当完全缀合且退火时，aperc-5具有下述有义链和反义链结构：修饰的有义链(5
’→ꢀ3’
)：(trism6.1-avb6-ta14)gscaacuguufafcfaucuucaacas(invab) (seq id no: 187)修饰的反义链(5
’→ꢀ3’
)：cprpusgfsusufgafagaugufaafcafgufugfsc (seq id no: 138)关于(trism6.1-avb6-ta14)的结构，参见图22。关于aperc-5的完整化学结构，参见图27a到27d (游离酸)和28a到28d (钠盐)。
[0283]
有义链潜在的碱基序列(5
’→ꢀ3’
)gcaacuguuacaucuucaaca (seq id no: 227)反义链潜在的碱基序列(5
’→ꢀ3’
)uguugaagauguaacaguugc (seq id no: 203)如图20中所示，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad06598 (aperc-2)的施用，显示了在给药后两周高于基线测量的mcc增加。例如，
rnai试剂ad07217 (aperc-7)的施用，显示了在给药后两周高于基线测量的mcc增加，在第14天的两小时扫描时间点具有超过基线的78%增加。
[0290]
类似地，如图19中所示，具有半胱氨酸-马来酰亚胺接头、与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07217 (aperc-8)的施用，显示了在第14天的两小时扫描时间点，超过基线的110%增加。
[0291]
如图18中所示，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad06599 (aperc-9)的施用显示了，在第14天的两小时扫描时间点，超过基线的58%增加。
[0292]
实施例9. 与上皮细胞靶向配体缀合的β-enac rnai试剂在绵羊中的气溶胶化施用。
[0293]
β-enac rnai试剂在绵羊粘液纤毛清除(mcc)模型中进行评估。首先通过吸入气溶胶化的锝标记的硫胶体在正常绵羊中测量mcc，随后为在两个小时内的伽马成像以确定基线水平。在建立基线后三天开始，在研究第1、2和3天时的连续三天内(即三个总剂量)，正常绵羊接受单次吸入沉积剂量的0.5 mg/kg的以下：1)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07240 (称为aperc-10)；或2)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07250 (称为aperc-11)；或3)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07251 (称为aperc-12)。将以10 mg/ml浓度的每种分别的β-enac rnai试剂的17.5 ml给药体积气溶胶化，并且经由鼻插管施用于绵羊。测试了每组中的一只绵羊(n=1)。在第14天时(在单次剂量后两周)，再次向绵羊施用气溶胶化的锝标记的硫胶体的吸入，随后为在两个小时内的伽马成像。
[0294]
如图17中所示，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07240 (aperc-10)的施用，显示了在第14天的两小时时间点，超过基线的82%增加。如图16中所示，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07250 (aperc-11)的施用，显示了在第14天的两小时时间点，超过基线的134%增加。并且如图15中所示，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07251 (aperc-12)的施用，显示了在第14天的两小时时间点，超过基线的102%增加。
[0295]
实施例10. 与上皮细胞靶向配体缀合的β-enac rnai试剂在绵羊中的气溶胶化施用。
[0296]
β-enac rnai试剂在绵羊粘液纤毛清除(mcc)模型中进行评估。首先通过吸入气溶胶化的锝标记的硫胶体在正常绵羊中测量mcc，随后为在两个小时内的伽马成像以确定基线水平。在建立基线后三天开始，在研究第1、2和3天时的连续三天内(即三个总剂量)，正常绵羊接受单次吸入沉积剂量的0.5 mg/kg的以下：1)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07252 (称为aperc-13)；或2)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07253 (称为aperc-14)；或3)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07255 (称为aperc-16)。将
以10 mg/ml浓度的每种分别的β-enac rnai试剂的17.5 ml给药体积气溶胶化，并且经由鼻插管施用于绵羊。测试了每组中的一只绵羊(n=1)。在第14天时(在单次剂量后两周)，再次向绵羊施用气溶胶化的锝标记的硫胶体的吸入，随后为在两个小时内的伽马成像。
[0297]
如图17中所示，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07252 (aperc-13)的施用，显示了在第14天的两小时时间点，超过基线的62%增加。如图16中所示，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07253 (aperc-14)的施用，显示了在第14天的两小时时间点，超过基线的94%增加。并且如图15中所示，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07255 (aperc-16)的施用，显示了在第14天的两小时时间点，超过基线的102%增加。
[0298]
实施例11. 与上皮细胞靶向配体缀合的β-enac rnai试剂在绵羊中的气溶胶化施用。
[0299]
β-enac rnai试剂在绵羊粘液纤毛清除(mcc)模型中进行评估。首先通过吸入气溶胶化的锝标记的硫胶体在正常绵羊中测量mcc，随后为在两个小时内的伽马成像以确定基线水平。在建立基线后三天开始，在研究第1、2和3天时的连续三天内(即三个总剂量)，正常绵羊接受单次吸入沉积剂量的0.5 mg/kg的以下：1)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07217 (称为aperc-7)；或2)在等渗盐水中配制的，在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的，气溶胶化的β-enac rnai试剂ad07099 (称为aperc-5)。将以10 mg/ml浓度的每种分别的β-enac rnai试剂的17.5 ml给药体积气溶胶化，并且经由鼻插管施用于绵羊。测试了每组中的两只绵羊(n=2)。在第21天时(在单次剂量后三周)，再次向绵羊施用气溶胶化的锝标记的硫胶体的吸入，随后为在两个小时内的伽马成像。
[0300]
如图10中所示，在第21天，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07217 (aperc-7)的施用，继续显示了在两小时扫描时间点超过基线的17%增加。并且如图11中所示，在第21天，与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07099 (aperc-5)的施用，继续显示了在当天两小时扫描时间点超过基线的56%增加。
[0301]
实施例12. 用β-enac rnai试剂转染的培养的原代正常人支气管上皮细胞中的人β-enac (scnn1b)相对mrna表达。
[0302]
在96孔组织培养板中培养来自正常人肺的原代支气管上皮细胞(10,000个细胞/孔)。rnaimax转染试剂用于与以下一起转染细胞：在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad06598 (称为aperc-2)、在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07099 (称为aperc-5)、或在有义链的5'末端处与三齿小分子αvβ6上皮细胞靶向配体(tri-sm6.1)缀合的β-enac rnai试剂ad07217 (称为aperc-7)。在转染48小时后，分离总rna，并且通过cells-to-ct提取，由细胞生成cdna，并且通过基于探针的定量pcr来定量scnn1b mrna表达，针对大鼠gapdh表达进行标准化，并且表示为仅lipofectamine (未转染的)对照组的分数(几何平均值， /
‑ꢀ
95%置信区间)。如图24中所示，用公开的β-enac rnai试剂的转染导致培养的正常人支气管上皮细胞中scnn1b mrna表达的有力剂量依赖性沉
默。
[0303]
其它实施方案应理解，尽管本发明已与其具体实施方式结合进行描述，但前述说明书预期说明而不是限制本发明的范围，所述本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其它方面、优点和修改在所附权利要求的范围内。