一种废旧芯片重新处理再利用的方法与流程

1.本发明属于芯片再生利用领域，具体涉及一种废旧芯片重新处理再利用的方法。


背景技术：

2.基于高通量测序基本原理，在孕妇血浆中的游离dna片段两端加上通用的测序接头，构建好可以用于测序的测序文库。利用乳液pcr技术对测序文库进行扩增，形成测序模板，通过对阳性模板进行富集以达到测序要求。
3.利用半导体测序系统通过在半导体芯片的微孔中固定dna链，dna聚合酶以单链dna为模板，按碱基互补原理，合成互补的dna链。dna链每延伸一个碱基时，就会释放一个质子，导致局部ph变化，离子传感器检测ph变化，并将化学信号转换成数字信号，从而可以实时判读碱基，最终获得每个dna片段的碱基序列。利用生物信息分析把这些序列定位到人类基因组参考图谱上，计算出样本的游离dna序列被分配到每条染色体上的具体数值比例。当胎儿的某条染色体数目增加时，其对应的游离dna序列数量会小幅增加，通过半导体测序技术和生物信息学数据分析可以检测出这种微量变化，从而获得染色体数目的信息，进而实现对21三体综合征，18三体综合征和13三体综合征进行快速的产前辅助诊断。但是，利用半导体测序由于试剂、样本等原因会出现测序失败的情况，具体原因如下：1)模板序列富集步骤中1m naoh和洗脱液配制错误，导致双链dna无法碱变性为单链dna，则不能进行碱基互补配对，测序失败；2)清洗芯片时，氮气没有完全把异丙醇吹干，芯片里面有残留的异丙醇，导致polyclonal偏高，low quality增加，usable reads偏低，测序失败；3)上样测序步骤，测序试剂配制错误，使异丙醇残留，导致polyclonal偏高，low quality增加，usable reads偏低，测序失败；4)退火缓冲液、测序引物加入错误，退火反应程序设置错误，导致测序引物无法连接到单链dna模板上，测序失败；5)酶反应液配制错误，无碱基互补配对所必须的测序聚合酶，测序失败。现有方法在半导体测序失败或失效之后，由于用过的半导体芯片中dna呈双链结构，无法准确识别和测序，只能用新的半导体芯片进行二次检测，废半导体芯片通常作为废弃物处理，提高了医学检测成本，造成了资源浪费。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种废旧芯片重新处理再利用的方法。
5.本发明的技术方案概述如下：
6.一种废旧芯片重新处理再利用的方法，包括以下步骤：
7.s1：用ab溶液清洗测序失败的废旧芯片3-5次，每次清洗，ab溶液用量为80-150ul；
8.所述ab溶液由退火缓冲液和无核酸酶水按照(0.75-1.25)：1的体积比混合配制而成；
9.s2：分两次将200-250ul洗脱液加入芯片孔中，25℃室温孵育3-5min；
10.所述洗脱液由吐温溶液和naoh溶液按照(6-8)：1的体积比混合配制而成；
11.s3：再用ab溶液清洗芯片3-5次，每次清洗，ab溶液用量为80-150ul；
12.s4：将35-45ul测序引物和30-35ul退火缓冲液混合均匀后，配制成65-80ul退火体系，再将其加入芯片孔中，再放到pcr仪进行退火；
13.s5：用80-150ul的ab溶液清洗芯片3-5次后，将60-70ul酶反应液加入芯片孔中，25℃室温孵育4-8min后，上机测序；
14.所述酶反应液由55-63μl ab溶液和5-7μl测序聚合酶配制而成。
15.优选的是，所述废旧芯片中含有9-20个上次测序失败的待测序样本。
16.优选的是，所述待测序样本总体积为50-60μl。
17.优选的是，所述ab溶液由退火缓冲液和无核酸酶水按照1：1的体积比混合配制而成。
18.优选的是，所述洗脱液由吐温溶液和naoh溶液按照7：1的体积比混合配制而成。
19.优选的是，所述吐温溶液质量浓度为1-5％。
20.优选的是，所述naoh溶液浓度为0.8-1.2m。
21.优选的是，所述退火反应条件为：93-97℃变性1.5-3min，36-38℃退火1.5-3min，18-22℃保存。
22.优选的是，所述退火反应条件为：95℃变性2min，37℃退火2min，20℃保存。
23.优选的是，所述测序聚合酶的酶活力为10-20u/μl。
24.本发明的有益效果：
25.1、本发明采用ab溶液清洗测序过的芯片，可将上次测序过程中加入的聚合酶、碱基、产生的磷酸根离子等表面杂质冲洗干净，还能将s2洗脱过程中，产生的另一条无用的单链dna和洗脱液清除。
26.2、本发明洗脱液加入芯片孔里，室温孵育3-5min，根据碱变性的原理，使双链dna解螺旋为单链dna，以备后面上机测序，使其在后续步骤中不断地以单链dna为模板进行碱基互补配对，达到精准测序的目的。
27.3、本发明退火体系打到芯片里，放到pcr仪进行退火，高温加热使异丙醇挥发，解决了因异丙醇在芯片里残留所致的测序失败问题，同时使测序引物连接到单链dna模板上，以备后面上机测序，解决了因退火体系(退火缓冲液和测序引物)加入错误的测序失败问题。
28.4、本发明酶反应液加入芯片孔里，25℃室温孵育4-8min，通过步骤s2、s4的处理后再重新酶孵育，解决了因酶反应液配制错误所致的测序失败问题。
29.5、本发明通过对测序失败的废旧芯片进行处理利用，使废芯片能重新测序，实现废旧芯片的循环再生，节约资源，避免造成浪费。
附图说明
30.图1为废旧芯片重新处理再利用的方法流程图；
31.图2为对比例1未处理前的废旧芯片测序结果质控分析图；
32.图3为实施例1处理的废旧芯片测序结果质控分析图；
33.图4为对比例2未处理前的废旧芯片测序结果质控分析图；
34.图5为实施例2处理的废旧芯片测序结果质控分析图；
35.图6为对比例3处理的废旧芯片测序结果质控分析图；
36.图7为实施例3处理的废旧芯片测序结果质控分析图。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
38.本发明提供一实施例的废旧芯片重新处理再利用的方法，包括以下步骤：
39.s1：用ab溶液清洗测序失败的废旧芯片3-5次，每次清洗，ab溶液用量为80-150ul；所述废旧芯片中含有9-20个上次测序失败的待测序样本，且待测序样本的总体积为50-60μl；
40.所述ab溶液由退火缓冲液和无核酸酶水按照(0.75-1.25)：1的体积比混合配制而成；进一步地，所述ab溶液由退火缓冲液和无核酸酶水按照1：1的体积比混合配制而成；
41.s2：分两次将200-250ul洗脱液加入芯片孔中，25℃室温孵育3-5min；
42.所述洗脱液由吐温溶液和为naoh溶液按照(6-8)：1的体积比混合配制而成；进一步地，所述洗脱液由质量浓度为1-5％的吐温溶液和0.8-1.2m naoh溶液按照7：1的体积比混合配制而成；
43.s3：再用ab溶液清洗芯片3-5次，每次清洗，ab溶液用量为80-150ul；
44.s4：将35-45ul测序引物和30-35ul退火缓冲液混合均匀后，配制成65-80ul退火体系，再将其加入芯片孔中，再放到pcr仪进行退火；所述退火反应条件为：93-97℃变性1.5-3min，36-38℃退火1.5-3min，18-22℃保存；进一步地，所述退火反应条件为：95℃变性2min，37℃退火2min，20℃保存；
45.s5：用80-150ul的ab溶液清洗芯片3-5次后，将60-70ul酶反应液加入芯片孔中，25℃室温孵育4-8min后，上机测序；
46.所述酶反应液由55-63μl ab溶液和5-7μl酶活力为10-20u/μl的测序聚合酶配制而成。
47.对本发明实施例的检测结果有效性进行质控控制，需同时以下标准，则测序成功，检测结果有效：
48.(1)芯片中每个样本的useable reads数≥3500000；
49.(2)loading＞85％，
50.usable reads＞60％，
51.polyclonal控制在25％-35％范围内，
52.low quality＜10％；
53.total reads(m)＞75％。
54.实施例1-3所用的废旧芯片为上机测试失败后的“测序反应通用试剂盒(半导体法)”中的芯片(试剂盒货号：s10010-4c8r，规格：4c8r/套，购于东莞博奥木华基因科技有限公司)。
55.实施例1所选用的废旧芯片中含有16个上次测序失败的待测序样本，且待测序样本的总体积为50μl；先将未处理前的该组废旧芯片直接上机测序，作为对比例1。
56.实施例1
57.一种废旧芯片重新处理再利用的方法，包括以下步骤：
58.s1：用ab溶液清洗含有16个总体积为50μl待测序样本的测序失败废旧芯片3-5次，ab溶液用量为80ul；
59.所述ab溶液由500μl退火缓冲液和500μl无核酸酶水配制而成，即按照1：1的体积比混合配制而成；
60.s2：分两次将200ul洗脱液加入芯片孔中，25℃室温孵育3min；
61.所述洗脱液由280μl质量浓度为3％的吐温溶液和40μl的1m naoh溶液配制而成，即按照7：1的体积比混合配制而成；
62.s3：再用ab溶液清洗芯片3次，每次清洗，ab溶液用量为80ul；
63.s4：将35ul测序引物和30ul退火缓冲液混合均匀后，配制成65ul退火体系，再将其加入芯片孔中，再放到pcr仪进行退火，退火反应条件为：95℃变性2min，37℃退火2min，20℃保存；
64.s5：用80ul的ab溶液清洗芯片3次后，将60ul酶反应液加入芯片孔中，25℃室温孵育5min，直接上机测序；
65.所述酶反应液由55μl ab溶液和5μl酶活力为10u/μl的测序聚合酶配制而成。
66.表1列出实施例1及对比例1重新测序后的质控结果：
67.表1
[0068] loadingusable readspolyclonallow qualitytotal reads(m)实施例1945138.91671.3对比例1947623.40.3105.8
[0069]
表2列出实施例1及对比例1重新测序后的每个样本的useable reads数：
[0070]
表2
[0071] 实施例1对比例1样本146317972381929样本254969692935820样本353282122970239样本455253743040149样本559305322863247样本658498223272822样本763032933458675样本851112982648790样本951504652587411样本1049415092380938样本1147965782575243样本1247224142579176样本1349417402475150样本14133690476439180样本15130855656095477样本1650469442214824
[0072]
结合表1-2及图2-3(图2为对比例1未处理前的废旧芯片测序结果质控分析图；图3为实施例1处理的废旧芯片测序结果质控分析图)知，对比例1未处理的废旧芯片上机测序失败，检测不合格，实施例1处理后的废旧芯片成功测序，检测结果有效。
[0073]
实施例2所选用的废旧芯片中含有16个上次测序失败的待测序样本，且待测序样本的总体积为55μl；先将未处理前的该组废旧芯片直接上机测序，作为对比例2。
[0074]
实施例2
[0075]
s1：用ab溶液清洗含有16个总体积为55μl待测序样本的测序失败废旧芯片4次，每次清洗，ab溶液用量为100ul；
[0076]
所述ab溶液由500μl退火缓冲液和500μl无核酸酶水配制而成，即按照1：1的体积比混合配制而成；
[0077]
s2：分两次将200ul洗脱液加入芯片孔中，25℃室温孵育4min；
[0078]
所述洗脱液由280μl质量浓度为4％的吐温溶液和40μl的1m naoh溶液配制而成，即按照7：1的体积比混合配制而成；
[0079]
s3：再用ab溶液清洗芯片4次，每次清洗，ab溶液用量为100ul；
[0080]
s4：将40ul测序引物和30ul退火缓冲液混合均匀后，配制成70ul退火体系，再将其加入芯片孔中，再放到pcr仪进行退火，退火反应条件为：95℃变性2min，37℃退火2min，20℃保存；
[0081]
s5：用100ul的ab溶液清洗芯片4次后，将65ul酶反应液加入芯片孔中，25℃室温孵育5min后，上机测序；
[0082]
所述酶反应液由59μl ab溶液和6μl酶活力为15u/μl的测序聚合酶配制而成。
[0083]
表3列出实施例2及对比例2重新测序后的质控结果：
[0084]
表3
[0085] loadingusable readspolyclonallow qualitytotal reads(m)实施例2946831.70.393.7对比例2945536.813.675.5
[0086]
表4列出实施例2及对比例2重新测序后的每个样本的useable reads数：
[0087]
表4
[0088]
[0089][0090]
结合表3-4及图4-5(图4为对比例2未处理前的废旧芯片测序结果质控分析图；图5为实施例2处理的废旧芯片测序结果质控分析图)知，对比例2未处理的废旧芯片上机测序失败，检测不合格，实施例2处理后的废旧芯片成功测序，检测结果有效。
[0091]
实施例3所选用的废旧芯片中含有16个上次测序失败的待测序样本
[0092]
实施例3
[0093]
s1：用ab溶液清洗含有16个总体积为60μl待测序样本的测序失败废旧芯片5次，每次清洗，ab溶液用量为150ul；
[0094]
所述ab溶液由500μl退火缓冲液和500μl无核酸酶水配制而成，即按照1：1的体积比混合配制而成；
[0095]
s2：分两次将250ul洗脱液加入芯片孔中，25℃室温孵育5min；
[0096]
所述洗脱液由280μl质量浓度为5％的吐温溶液和40μl的1m naoh溶液配制而成，即按照7：1的体积比混合配制而成；
[0097]
s3：再用ab溶液清洗芯片5次，每次清洗，ab溶液用量为150ul；
[0098]
s4：将45ul测序引物和35ul退火缓冲液混合均匀后，配制成80ul退火体系，再将其加入芯片孔中，再放到pcr仪进行退火，退火反应条件为：95℃变性2min，37℃退火2min，20℃保存；
[0099]
s5：用150ul的ab溶液清洗芯片5次后，将70ul酶反应液加入芯片孔中，25℃室温孵育8min后，上机测序；
[0100]
所述酶反应液由63μl ab溶液和7μl酶活力为20u/μl的测序聚合酶配制而成。
[0101]
对比例3与实施例3相同：区别在于，对比例3无s2、s3操作步骤，即未采用洗脱液孵育处理。
[0102]
表5列出实施例3及对比例3重新测序后的质控结果：
[0103]
表5
[0104] loadingusable readspolyclonallow qualitytotal reads(m)实施例3967525.2-0.1106.1对比例3965439.311.376.2
[0105]
表6列出实施例3及对比例3重新测序后的每个样本的useable reads数：
[0106]
表6
[0107]
[0108][0109]
结合表5-6及图6-7(图6为对比例3处理的废旧芯片测序结果质控分析图；图7为实施例3处理的废旧芯片测序结果质控分析图)知，由于对比例2未采用洗脱液进行dna双链解旋处理，上机测序失败，检测结果无效，实施例3处理后的废旧芯片成功测序，检测结果有效。
[0110]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。