一种以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法与流程

1.本发明属于功能性低聚糖制备技术领域，特别涉及一种以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法。


背景技术：

2.低聚果糖（fructooligosaccharides，fos）是一种由蔗糖分子通过β
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2,1糖苷键与1
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3个短链果糖基单元结合而成的线性杂低聚糖，主要由蔗果三糖（1
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kestose，gf2）、蔗果四糖（nystose，gf3）和蔗果五糖 （1
f
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fructofuranosyl nystose，gf4）组成。作为一种国际公认的益生元，具有促进肠道有益菌群（如双歧杆菌和乳酸菌）增殖、抑制大肠杆菌等有害细菌生长、维持肠道内菌群稳定和保持人体健康的独特作用。此外，由于其具有的低热值、降血脂、促进微量元素吸收等优良特性，在食品和保健品等相关行业中得到了广泛应用。
3.依据原料和生产方式的差异，低聚果糖可以分为菊粉型低聚果糖和蔗糖型低聚果糖。其中，菊粉型低聚果糖是以天然菊芋或菊苣为底物通过水解得到，其产品中杂质较多；蔗糖型低聚果糖是利用蔗糖为底物通过果糖基转移酶转化得到，由于其在生产效率、产品质量等方面均优于菊粉型低聚果糖，是目前工业上的主要生产方法。
4.以蔗糖为底物生产低聚果糖，由于产物对果糖基转移酶的抑制作用，只能获得纯度为55%
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60%的低聚果糖产品（g型，低聚果糖占干物质50%以上），产品中仍含有大量的葡萄糖、少量的果糖和未完全反应的蔗糖。这些残糖严重影响低聚果糖的生理功效和应用范畴，尤其是在糖尿病患者这一领域内使用受限明显。因此，要获得高纯度的低聚果糖产品（p型，低聚果糖占干物质90%以上），通常需要在g型产品的基础上，采用各种方法进一步纯化。
5.为此研究人员在高纯度低聚果糖生产方面开展了相关工作。检索到相关的文献如下：1、申请号为00130200.0的中国专利，公开了一种高纯度低聚果糖制备方法，该方法采用黑曲霉菌种，经二级培养得到果糖转移酶，加入浓度为30％～50％的蔗糖溶液中，在酶化罐内调ph值为5～8，于62～70℃下进行一次酶化接触反应，反应进行8～10小时，一次酶化的产品进行一次纳滤处理，纳滤后的滤出液糖浆进行二次酶化，然后将酶化的糖浆再进行二次纳滤处理，获得含量大于90%的高纯度低聚果糖。
6.2、申请号为200710021605.9中国专利，公开了一种高纯度低聚果糖的生产法，该方法采用蔗糖为原料，经工业化酶法转化生产，得到含量为55％左右的普通级低聚果糖；接着利用生物转化原理，采用酵母转化消除普通级低聚果糖中的葡萄糖，使低聚果糖的含量达到75％以上；再利用离子交换色谱分离和膜分离技术相结合，去除其中其它成份，使产品中的低聚果糖含量达到95％以上。
7.3、申请号为200810030332.9中国专利，公开了一种高纯度低聚果糖的制备方法，该方法先制备固定化果糖基转移酶、 固定化葡萄糖氧化酶和固定化过氧化氢模拟酶；然后利用上述制备的酶用间歇式或连续式的生产方法制备含量大于75%的高纯度低聚果糖。
8.4、申请号为201510203832.8的中国专利，公开了一种生产高纯度低聚果糖的方
法，该方法采用连续自控的色谱工艺分离，回收一次色谱分离后含有低聚果糖、蔗糖、葡萄糖的提取液，经过二次色谱分离出其中的蔗糖和低聚果糖，再经过酶促转化使其中的蔗糖成分生成低聚果糖，并将此物料循环用作一次色谱的原料，从而降低高纯度低聚果糖的原料单耗。
9.5、申请号为201710074040.4的中国专利，公开了一种利用分子筛
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模拟移动床制备高纯度低聚果糖的方法，该方法取普通级低聚果糖液为原料，用纯水稀释；在稀糖液加入活性炭和聚合硫酸铝组成的复合吸附剂，搅拌，过滤，取滤液；滤液通过模拟移动床分离纯化，得高纯度低聚果糖液；将低聚果糖液在超低温真空下减压浓缩，即可得到含量大于95％的低聚果糖。
10.综上可见，目前生产高纯度低聚果糖的方法主要有酵母耗糖法、多酶协同转化法、色谱分离法、膜分离法和分子筛
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模拟移动床法。其中，酵母耗糖法是利用酵母细胞经培养后添加于g型低聚果糖中，经反应后制得含量为75％左右的低聚果糖，需进一步采用色谱分离和膜分离等技术提高低聚果糖含量。该方法存在工艺复杂、生产成本高等缺点。色谱分离法、膜分离法和分子筛
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模拟移动床法，尽管能够制备低聚果糖含量达到95％以上的产品，但是需要采用多次分离和酶转化相结合的操作，在去除葡萄糖的同时，低聚果糖也有一定量损失，且膜和色谱填料是高值易耗品，从而导致其生产成本高。此外，上述方法都是在g型低聚果糖产品的基础上纯化制得p型低聚果糖产品。而多酶协同转化法，尽管可以直接以蔗糖为底物制备含量大于75%的低聚果糖，但产品纯度受限，需进一步采用其它分离纯化技术提高纯度。


技术实现要素：

11.本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法。本方法首先选择能够产生果糖基转移酶的黑曲霉（aspergillus niger）或米曲霉（aspergillus oryzae）制备果糖基转移酶制剂，选择只利用葡萄糖作为碳源而无法水解低聚果糖的酿酒酵母（saccharomyces cerevisiae）或异常威克汉姆酵母（wickerhamomyces anomalue）制备能够消耗葡萄糖的微生物细胞，在此基础上利用蔗糖为底物，先添加果糖基转移酶制剂进行部分转糖苷作用，随后添加能够消耗葡萄糖的微生物细胞，同步进行果糖基转移酶制剂的转糖苷作用和微生物细胞耗糖，从而获得含量大于95％的高纯度低聚果糖。该方法具有工艺简单、成本低、产品纯度和回收率高的优点，极具工业化生产潜力。
12.为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：一种以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法，包括如下步骤：（1）制备果糖基转移酶制剂选择能够产生果糖基转移酶的优良菌株黑曲霉（aspergillus niger）或米曲霉（aspergillus oryzae），在适宜的培养基和培养条件下培养24～48h，培养液经离心或膜分离技术收集含果糖基转移酶的菌丝体，将菌丝体保持完整、或经粉碎制成细胞碎片或粉末、或制成固定化细胞，即为果糖基转移酶制剂；（2）制备能够消耗葡萄糖的微生物细胞选择只利用葡萄糖作为碳源而无法水解低聚果糖的优良菌株酿酒酵母
（saccharomyces cerevisiae）或异常威克汉姆酵母（wickerhamomyces anomalue），在适宜的培养基和培养条件下培养24～48h，培养液经离心收集菌体细胞，将菌体细胞保持完整、或制成固定化细胞；（3）以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖在发酵罐中配制浓度为400～700g/l的蔗糖溶液，装液量40～70%（v/v）；按一定比例添加果糖基转移酶制剂于蔗糖溶液中，在温度45～55℃、转速100～200rpm条件下进行转糖苷作用3～5h；随后按一定比例添加能够消耗葡萄糖的微生物细胞，在温度28～37℃、ph维持5.0～6.0、转速100～500rpm、通气量0.5～2.0vvm的条件下继续作用24～48h；经脱色、过滤即可获得高纯度低聚果糖；经hplc检测低聚果糖含量；所述的果糖基转移酶制剂的添加比例为：0.05～0.2%（w/v）的完整、或经粉碎制成细胞碎片或粉末的菌丝体，或0.5～2%（w/v）的固定化细胞；所述的能够消耗葡萄糖的微生物细胞的添加比例为：10～20%（v/v）的完整菌体细胞或固定化细胞。
13.进一步的，上述的以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法，步骤（1）中，所述的适宜的培养基为：白砂糖100～200g/l，玉米浆干粉10～50g/l，znso
4 1～5g/l；所述的适宜的培养条件为：初始ph值5.0～6.0，培养基装液量40～70%（v/v），接种量1～5%（v/v），搅拌速度100～500rpm，通气量0.5～2.0vvm，培养温度28～37℃；所述的所述膜分离技术为真空抽滤、板框过滤或超滤中的任意一种。
14.上述的以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法中，所述固定化细胞是采用海藻酸钙、壳聚糖或卡拉胶中的任意一种或多种作为固定化载体，以戊二醛作为交联剂制备。
15.上述的以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法，步骤（2）中所述的适宜的培养基为：葡萄糖10～50g/l，麦芽汁1～5%（w/v），酵母膏5～20g/l，mnso
4 0.1～0.5g/l；所述适宜的培养条件为：初始ph值5.0～6.0，培养基装液量40～70%，v/v，接种量5～20%，v/v，搅拌速度100～500rpm，通气量0.5～2.0vvm，培养温度28～37℃。
16.进一步的，所述的麦芽汁是通过如下方法制备：称取100g麦芽，用6层纱布包裹，在沸水中煮1小时，所得麦芽汁定容至1 l，离心取上清液制得浓度为10%（w/v）的麦芽汁，使用时加水稀释成不同浓度的麦芽汁。
17.上述的以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法中，所述蔗糖为白砂糖、黄砂糖、赤砂糖、绵白糖、单晶体冰糖、多晶体冰糖、红糖、黑糖、冰片糖、方糖、糖霜或液体糖浆中的任意一种或多种。
18.与现有技术相比，本发明的有益效果：1、相对于利用g型低聚果糖为原料，采用酵母耗糖法、色谱分离法、膜分离法或分子筛
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模拟移动床法制备高纯度低聚果糖，本发明直接以蔗糖为底物，同步进行果糖基转移酶制剂的转糖苷作用和微生物细胞耗糖，制备高纯度低聚果糖，不仅减少了操作单元，而且具有工艺简单、成本低、产品纯度和回收率高的优点，极具工业化潜力。
19.2、相对于多酶协同转化法，本发明方法制备的高纯度低聚果糖，其含量可达95%以上，无需进一步采用其它分离纯化技术提高纯度。
附图说明
20.图1为采用本发明以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法制备得到的高纯度低聚果糖产品的图片。
具体实施方式
21.下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式并不局限于实施例表示的范围。
22.实施例1一种以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法，包括如下步骤：（1）制备果糖基转移酶制剂选择黑曲霉；培养基为：白砂糖100g/l，玉米浆干粉10g/l，znso41g/l；培养条件为：初始ph值5.0，培养基装液量40%（v/v），接种量1%（v/v），搅拌速度100rpm，通气量0.5vvm，培养温度28℃，培养时间48h；在上述条件下培养后经离心收集含果糖基转移酶的菌丝体，粉碎制成细胞碎片，即得果糖基转移酶制剂。
23.（2）制备能够消耗葡萄糖的微生物细胞选择酿酒酵母；培养基为：葡萄糖10g/l，麦芽汁1%（w/v），酵母膏5g/l，mnso40.1g/l；培养条件为：初始ph值5.0，培养基装液量40%（v/v），接种量5%（v/v），搅拌速度100rpm，通气量0.5vvm，培养温度28℃，培养时间48h；在上述条件下培养后经离心收集菌体细胞，将菌体细胞保持完整。
24.（3）以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖在发酵罐中配制浓度为400g/l的白砂糖溶液，装液量40%（v/v）；将含果糖基转移酶的黑曲霉细胞碎片按0.2%（w/v）的比例添加于白砂糖溶液中，在温度45℃、转速200rpm条件下进行转糖苷作用5h；随后将酿酒酵母完整细胞按10%（v/v）的比例添加，在温度28℃、ph维持5.0、转速100rpm、通气量0.5vvm的条件下继续作用48h；经脱色、过滤即可获得高纯度低聚果糖；经hplc检测低聚果糖含量为95.1%。
25.实施例2一种以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法，包括如下步骤：（1）制备果糖基转移酶制剂选择黑曲霉；培养基为：白砂糖200g/l，玉米浆干粉50g/l，znso45g/l；培养条件为：初始ph值6.0，培养基装液量70%（v/v），接种量5%（v/v），搅拌速度500rpm，通气量2vvm，培养温度37℃，培养时间24h；在上述条件下培养后经真空抽滤收集含果糖基转移酶的菌丝体，采用壳聚糖作为固定化载体，以戊二醛作为交联剂制备固定化细胞，即得果糖基转移酶制剂。
26.（2）制备能够消耗葡萄糖的微生物细胞选择异常威克汉姆酵母；培养基为：葡萄糖50g/l，麦芽汁5%（w/v），酵母膏20g/l，mnso40.5g/l；培养条件为：初始ph值6.0，培养基装液量70%（v/v），接种量20%（v/v），搅拌速度500rpm，通气量2vvm，培养温度37℃，培养时间24h；在上述条件下培养后经离心收集菌体细胞，采用壳聚糖作为固定化载体，以戊二醛作为交联剂制备固定化细胞。
27.（3）以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖
在发酵罐中配制浓度为700g/l的单晶体冰糖溶液，装液量70%（v/v）；将含果糖基转移酶的黑曲霉固定化细胞按2%（w/v）的比例添加于单晶体冰糖溶液中，在温度55℃、转速100rpm条件下进行转糖苷作用3h；随后将异常威克汉姆酵母固定化细胞按20%（v/v）的比例添加，在温度37℃、ph维持6.0、转速500rpm、通气量2vvm的条件下继续作用24h；经脱色、过滤即可获得高纯度低聚果糖；经hplc检测低聚果糖含量为95.5%。
28.实施例3一种以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法，包括如下步骤：（1）制备果糖基转移酶制剂选择米曲霉；培养基为：白砂糖120g/l，玉米浆干粉20g/l，znso41g/l；培养条件为：初始ph值5.0，培养基装液量50%（v/v），接种量1%（v/v），搅拌速度200rpm，通气量1vvm，培养温度30℃，培养时间48h；在上述条件下培养后经离心收集含果糖基转移酶的菌丝体，采用海藻酸钙作为固定化载体，以戊二醛作为交联剂制备固定化细胞，即得果糖基转移酶制剂。
29.（2）制备能够消耗葡萄糖的微生物细胞选择酿酒酵母；培养基为：葡萄糖20g/l，麦芽汁2%（w/v），酵母膏5g/l，mnso40.2g/l；培养条件为：初始ph值5.0，培养基装液量50%（v/v），接种量5%（v/v），搅拌速度200rpm，通气量0.8vvm，培养温度28℃，培养时间48h；在上述条件下培养后经离心收集菌体细胞，采用海藻酸钙作为固定化载体，以戊二醛作为交联剂制备固定化细胞。
30.（3）以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖在发酵罐中配制浓度为400g/l的红糖溶液，装液量50%（v/v）；将含果糖基转移酶的米曲霉固定化细胞按0.5%（w/v）的比例添加于红糖溶液中，在温度55℃、转速100rpm条件下进行转糖苷作用4h；随后将酿酒酵母固定化细胞按20%（v/v）的比例添加，在温度28℃、ph维持5.0、转速200rpm、通气量0.8vvm的条件下继续作用48h；经脱色、过滤即可获得高纯度低聚果糖；经hplc检测低聚果糖含量为95.6%。
31.实施例4一种以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖的方法，包括如下步骤：（1）制备果糖基转移酶制剂选择米曲霉；培养基为：白砂糖180g/l，玉米浆干粉40g/l，znso42g/l；培养条件为：初始ph值6.0，培养基装液量60%（v/v），接种量2%（v/v），搅拌速度500rpm，通气量1.5vvm，培养温度35℃，培养时间40h；在上述条件下培养后经板框过滤收集含果糖基转移酶的菌丝体，将菌丝体保持完整。
32.（2）制备能够消耗葡萄糖的微生物细胞选择异常威克汉姆酵母；培养基为：葡萄糖40g/l，麦芽汁4%（w/v），酵母膏10g/l，mnso40.4g/l；培养条件为：初始ph值5.5，培养基装液量60%（v/v），接种量10%（v/v），搅拌速度400rpm，通气量1vvm，培养温度30℃，培养时间40h；在上述条件下培养后经离心收集菌体细胞，将菌体细胞保持完整。所述的麦芽汁通过如下方法制备：称取100g麦芽，用6层纱布包裹，在沸水中煮1小时，所得麦芽汁定容至1l，离心取上清液制得浓度为10%（w/v）的麦芽汁，使用时加水稀释成所限定的浓度4%（w/v）的麦芽汁。
33.（3）以蔗糖为底物制备高纯度低聚果糖
在发酵罐中配制浓度为500g/l的白砂糖溶液，装液量60%（v/v）；将含果糖基转移酶的米曲霉完整细胞按0.05%（w/v）的比例添加于白砂糖溶液中，在温度50℃、转速150rpm条件下进行转糖苷作用3h；随后将异常威克汉姆酵母完整细胞按15%（v/v）的比例添加，在温度30℃、ph维持5.5、转速400rpm、通气量1vvm的条件下继续作用40h；经脱色、过滤即可获得高纯度低聚果糖；经hplc检测低聚果糖含量为96.2%。