miR164h-5p在调控玉米丝黑穗病抗性中的应用

mir164h-5p在调控玉米丝黑穗病抗性中的应用
技术领域
1.本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及mir164h-5p在调控玉米丝黑穗病抗性中的应用。


背景技术：

2.玉米丝黑穗病是由丝轴黑粉菌(sporisorium reilianum f.sp.zeae)引起的真菌性土传病害，该菌属担子菌亚门，轴黑粉菌属，可侵染玉米、高粱等。丝轴黑粉菌的冬孢子有三种方式进行越冬，分别为土壤地表越冬、种子表面越冬和病残体越冬。其菌丝形成方式多为担子和侧生担孢子，担孢子包括两种亲和交配型“ ”和
“‑”
，将其制备成混合菌液后形成的双核菌丝可侵染寄主组织，菌丝与玉米处于共生状态，因此该病菌属于活体营养型致病菌。
3.在感病植株的雌穗雄穗部位，双核菌丝大量繁殖厚垣孢子，直到完成生命周期，这使得雌穗雄穗的活性氧和生长素急剧上升，从而使感病植株顶端优势消失，生长素聚集在亚顶端分生组织，造成分蘖的大量增加，同时由于菌丝侵染，引起调控基因表达异常，对花器官发育造成影响，进而导致玉米产量下降，而由于发病部位为玉米的花器官，一旦发病即可造成绝产，对生产危害严重。
4.玉米丝黑穗病的发生受品种抗病性、耕作制度以及气候条件等诸多因素的影响，所以此病害防治难度较大。目前，生产上主要采取以农业措施如调整播期、加强田间管理等为主，药剂防治为辅的综合防治措施。但是上述防治措施存在费工费时、易造成环境污染且防治效果差等不足，培育和种植抗病品种是防治玉米丝黑穗病的有效途径。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术存在的问题，本发明的目的是提供mir164h-5p在调控玉米丝黑穗病抗性中的应用。
6.本发明对丝轴黑粉菌侵染的玉米进行了抗性鉴定和测序分析，发现mir164h-5p参与玉米丝黑穗病的调控，mir164h-5p可能与玉米丝黑穗病的抗性相关。
7.第一方面，本发明提供mir164h-5p或包括mir164h-5p的生物材料在调控玉米抗丝黑穗病能力中的应用。
8.本发明进一步提供mir164h-5p或包括mir164h-5p的生物材料在培育抗丝黑穗病玉米品种中的应用。
9.进一步地，所述应用为通过降低mir164h-5p在玉米中的表达水平，提高玉米的抗丝黑穗病能力。
10.进一步地，所述mir164h-5p的前体序列为如seq id no.1所示的核苷酸序列。
11.进一步地，所述mir164h-5p的成熟序列为如seq id no.2所示的核苷酸序列。
12.进一步地，所述生物材料为表达盒、载体或转基因细胞。
13.第二方面，本发明提供一种调控植物抗丝黑穗病功能的方法，包括：
14.调控植物中mir164h-5p的表达水平，提高所述植物的抗丝黑穗病能力；
15.所述mir164h-5p的成熟序列为如seq id no.2所示的核苷酸序列。
16.进一步地，通过转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖抑制所述玉米中mir164h-5p的表达。
17.进一步地，所述植物为玉米。
18.本发明具备如下有益效果：
19.本发明对丝轴黑粉菌侵染的玉米进行了抗性鉴定和测序分析，发现mir164h-5p的表达水平与玉米丝黑穗病的发病程度呈正相关。后续经过验证发现在抑制玉米中的mir164h-5p表达后，玉米的抗丝黑穗病能力显著提高，这对于玉米抗丝黑穗病功能的分子生物学机制的研究具有重要意义。
20.本发明对于mir164h-5p功能的研究为创制抗玉米丝黑穗病新材料提供了新的途径，也为后续研究奠定了遗传材料基础，为玉米抗丝黑穗病基因资源储备提供了良好的信息平台。
附图说明
21.图1为本发明实施例1提供的mir164h-5p启动子的侧翼序列分析结果。
22.图2为本发明实施例1提供的重组质粒pcambia1301-mir164h-pro鉴定图；其中，m为marker，w为水，1和2为重组农杆菌阳性质粒。
23.图3为本发明实施例1提供的拟南芥组织特异性gus染色图；其中a、b为叶片，c、d为叶片，e为种皮。
24.图4为本发明实施例1提供过表达载体pcub-mir164oe的检测结果；其中，m为2000的maker，1为pcr产物，2为阳性对照，3为阴性对照。
25.图5为本发明实施例1提供过表达转基因后代植株试纸条检测结果；其中，1为b104受体对照；2-22为转基因株oe-1～oe-21。
26.图6为本发明实施例1提供的抑制表达载体ptf101.1-mir164ts的检测结果，其中，m为trans 2k plus，1为pcr产物，2为阳性对照，3为阴性对照。
27.图7为本发明实施例1提供的抑制表达转基因株系的试纸条检测结果，其中1为b104受体对照；2-15为转基因株系：ts-1～ts-6、ts-11～ts-13、ts-15、ts-17～ts-20。
28.图8为本发明实施例2提供的受体对照与转基因株系针刺中胚轴法接种发病症状示意图；其中，a-c为受体对照自交系b104接种水后2d、6d、8d的症状，d-f为受体对照自交系b104接种菌液2d、6d、8d的症状，g-i为mir164h-5p过表达转基因株系接种水后2d、6d、8d的症状，j-l为mir164h-5p过表达转基因株系接种菌液后2d、6d、8d的症状，m-o为mir164h-5p抑制表达转基因株系接种水后2d、6d、8d的症状，p-r为mir164h-5p抑制表达转基因株系接种菌液后2d、6d、8d的症状。
29.图9为本发明实施例3提供的针刺中胚轴法接种过表达转基因后代株系中mir164h-5p表达量图。
30.图10为本发明实施例3提供的浸泡胚根法接种过表达转基因后代株系中mir164h-5p表达量图。
31.图11为本发明实施例3提供的针刺中胚轴法接种抑制表达转基因后代株系中
mir164h-5p表达量图。
32.图12为本发明实施例3提供的浸泡胚根法接种抑制表达转基因后代株系中mir164h-5p表达量图。
具体实施方式
33.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
34.在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
35.实施例1
36.1、mir164h-5p启动子分析
37.本发明以玉米自交系b73refgen_v4为参考序列，选取mir164h-5p前体序列上游约2000bp的序列作为研究对象(seq id no.10)，通过p1ant care分析mir164h-5p启动子含有的潜在顺式作用元件。分析得到如图1所示的结果，结果显示mir164h-5p启动子内除了含有启动子必需的核心元件tata-box和caat-box外，还含有myc、w-box、abre、tga-element和g-box。
38.2、重组质粒pcambia1301-mir164h-pro构建及转化。
39.本发明根据mir164h-5p上游启动子区序列，分别设计加入酶切位点bamh i和nco i的载体接头的引物(seq id no.3-4)。采用infusion的方式将启动子扩增片段连接到pcambia1301中构建重组质粒pcambia1301-mir164h-pro。
40.采用热激法将重组质粒pcambia1301-mir164h-pro转化农杆菌eha105感受态细胞，挑取重组农杆菌单菌落扩繁，提取质粒dna进行pcr鉴定，鉴定结果如图2所示。
41.将重组质粒pcambia1301-mir164h-pro转化的农杆菌采用蘸花法转化拟南芥，收获成熟的t0代拟南芥种子，点播种植于含有1％潮霉素浓度的ms固体培养基中，进行筛选。转化成功的拟南芥具有潮霉素抗性，能够正常生长，未转化成功的拟南芥则长的相对较弱，甚至死亡。
42.对正常生长的拟南芥幼苗进行组织化学染色，染色结果如图3所示，其中a、b为叶片，c、d为叶片；e为种皮。结果显示叶片和种皮有颜色反应，表明mir164h-5p启动子可驱动gus基因在植物叶片和种皮上表达。
43.3、过表达载体pcub-mir164oe的构建及检测
44.本发明根据mir164h-5p的前体序列(seq id no.1)，将其两端分别加上酶切位点bamh i，合成mir164oe片段。
45.经bamh i进行单酶切植物表达载体pcub质粒(该载体自身带有筛选标记基因bar，可用于后期的快速检测)，设计同源重组引物(seq id no.5-6)，片段纯化后在infusion连接酶的作用下与mir164oe片段连接，形成重组质粒pcub-mir164oe。
46.采用热激法将过表达载体质粒pcub-mir164oe转化农杆菌eha105感受态细胞，挑取重组农杆菌单菌落扩繁，提取质粒dna进行pcr鉴定。
47.以大肠杆菌阳性质粒作为阳性对照。鉴定结果表明(图4)：重组质粒中均能扩增出约250bp的目的片段，而阴性对照pcub载体则无该特异条带，这表明真核表达载体pcub-mir164oe构建成功，可以用于后续步骤对玉米b104的遗传转化。
48.4、mir164h-5p过表达转基因株系检测
49.通过农杆菌转化法制备得到mir164h-5p过表达转基因株系，选用北京奥创金标公司生产的bar检测试纸条进行检测：取0.1g新鲜的叶片组织充分研磨，放入2ml离心管中，加入1ml seb2缓冲液(试纸条自带)，混匀后加入试纸条进行检测。结果如图5所示：21个过表达载体转化株系均有测试线，说明21个过表达转基因后代能够稳定翻译出bar蛋白。
50.5、mir164h-5p抑制表达载体ptf101.1-mir164ts的构建及检测
51.本发明基于mir164h-5p成熟序列(seq id no.2)，设计与zam-mir164h完全互补的反义序列，用overlap pcr方法扩增全长，序列中间加入-agc、swai酶切位点、-gttgttgttgttatggtctaa-碱基等间隔链接，最终合成海绵体mir164ts的序列(seq id no.7)，仅将引物换为mir164ts同源重组引物(seq id no.8-9)，以合成的mir164ts质粒为模板对其进行pcr反应，回收目的条带。
52.植物表达载体ptf101.1-35s-hsp质粒(含有bar基因)经ecor i进行单酶切，并将合成的海绵体序列mir164ts片段纯化后在infusion连接酶的作用下与ptf101.1-35s-hsp线性化质粒连接，连接产物转化e.coli trans1-t1，构建重组质粒ptf101.1-mir164ts。
53.采用热激法将抑制表达载体质粒ptf101.1-mir164ts转化农杆菌eha105感受态细胞，挑取重组农杆菌单菌落扩繁，提取质粒dna进行pcr鉴定。以大肠杆菌阳性质粒作为阳性对照。
54.结果表明(图6)，重组质粒中均能扩增出约134bp的目的片段，而阴性对照ptf101.1-35s-hsp载体则无该特异条带，说明表达载体ptf101.1-mir164ts构建成功，可以用于后续对玉米b104的遗传转化。
55.6、mir164h-5p抑制表达转基因株系检测
56.通过农杆菌转化法制备得到mir164h-5p抑制表达转基因株系，选用市售的bar检测试纸条检测：取0.1g新鲜的叶片组织充分研磨，放入2ml离心管中，加入1ml seb2缓冲液(试纸条自带)，混匀后加入试纸条进行检测。结果如图7所示，转基因测试线清晰均可见，说明bar基因在14个转基因玉米后代株系中成功翻译成蛋白质。
57.实施例2 mir164h-5p抗玉米丝黑穗病功能鉴定
58.1、转基因株系对玉米丝黑穗病的抗性鉴定
59.以过表达3个独立转基因事件的株系、抑制表达3个独立转基因事件的株系和受体对照b104为材料进行室内人工接种，每个株系50株，3次重复，采用混合交配型丝轴黑粉菌液，进行室内人工接种。
60.当种苗胚芽鞘长约1～2cm时，从沙土中取出种苗，选择长势一致的材料用混合交配型菌液针刺中胚轴下部；转基因受体材料处理相同，但针刺灭菌的蒸馏水。接种后2d，6d和8d分别取中胚轴部位，进行严格清洗拍照。
61.结果如图8所示，接种后2d，对照组的中胚轴可以正常生长，而接种后的b104、过表达转基因株系和抑制表达转基因株系的中胚轴出现小范围的限制性病变；在接种第6d，b104中胚轴开始褐变，过表达转基因株系出现大幅度病变，中胚轴一半呈黄褐色坏死状，而抑制表达转基因株系中胚轴具有很少的病变；在接种第8d，b104中胚轴表现出严重损伤，严重褐变坏死，过表达转基因株系出现了不可逆转的坏死性病变，细胞逐渐凋亡失水，中胚轴呈现半干枯状，而抑制表达转基因株系中胚轴病变很少。上述结果初步说明，与受体对照相
比，过表达mir164h-5p转基因株系丝黑穗病抗性降低，而抑制表达转基因株系则表现为抗病性提高。
62.实施例3转基因株系中mir164h-5p的时空表达模式分析
63.(1)接种方法
64.浸泡胚根法(sir)：当种苗胚芽鞘长约1～2cm时，从沙土中取出种苗，选择长势一致的材料用混合交配型菌液浸泡胚根30min，然后重新置于发芽盒中继续培养。转基因受体材料处理相同，但用灭菌的蒸馏水泡根。
65.针刺中胚轴法(nim)：当种苗胚芽鞘长约1～2cm时，从沙土中取出种苗，选择长势一致的材料用混合交配型菌液针刺中胚轴下部，然后重新置于发芽盒中继续培养，转基因受体材料处理相同，但针刺灭菌的蒸馏水。
66.(2)过表达转基因株系中mir164h-5p的时空表达模式分析
67.以过表达mir164h-5p的3个独立转基因事件为试材，分别采用针刺中胚轴(nim)和浸泡胚根法(sir)进行玉米丝黑穗病人工接种，每个转基因事件取3株进行混合取样，3次重复，取接种处理后0h、12h、1d和6d的中胚轴部位样品。
68.结果显示(图9-图10)：针刺中胚轴法接种(nim)后，过表达转基因株系中mir164h-5p在各取样时间点均极显著上调表达(p《0.01)，峰值在出现在处理后1d；浸泡胚根法接种(sir)后，过表达株系中mir164h-5p在各时间点均显著上调表达(p《0.05)，峰值出现在接种后6d，表明mir164h-5p的表达受丝轴黑粉菌的诱导，且与玉米对丝黑穗病的抗性呈现负相关。
69.(3)抑制表达转基因株系中mir164h-5p的时空表达模式分析
70.以抑制表达的3个独立转基因事件为试材，采用上述两种方法进行玉米丝黑穗病人工接种，每个转基因事件取3株进行混合取样，3次重复，取接种处理后0h、6h、12h、1d、2d、4d、6d和8d后取样中胚轴部位样品。针刺中胚轴法接种(nim)后，在抑制表达转基因株系中则表现为mir164h-5p显著下调表达(p《0.05)，峰值出现在处理后1d；抑制表达株系中则表现为显著下调表达(p《0.05)，峰值出现在接种后6d，表明mir164h-5p的表达受丝轴黑粉菌的诱导，且与玉米对丝黑穗病的抗性呈现负相关。
71.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。