一种新型次氯酸根荧光探针、其制备方法及其用于次氯酸根检测的方法

1.本发明属于有机化合物合成领域，进一步地属于用于分析化学和化学生物学的有机化合物合成领域，具体涉及一种新型次氯酸根荧光探针、其制备方法及其用于次氯酸根检测的方法。


背景技术：

2.次氯酸(hocl/ocl-)作为生物体内活性氧的重要小分子之一，在生物免疫系统中起着重要作用。次氯酸是活性氧(ros)家族中的一员，由髓过氧化物酶(mpo)催化产生，其产生也受到各种可溶性刺激的诱导。它在人类免疫功能系统中扮演着重要的角色，有助于对入侵细菌和病原体进行破坏。研究表明，次氯酸(hocl/ocl-)通过以下机制参与免疫系统：首先，次氯酸与各种蛋白质侧链和肽键进行特异性反应而增强了先天免疫；其次，次氯酸可以氧化和氯化各种生物分子，如胆固醇、脂肪酸、蛋白质、dna和rna 等。这些现象表明次氯酸与多种生物过程有关。但可扩散氧化剂和氯化剂次氯酸的浓度范围为10-5
～10-2
m。高浓度的次氯酸会对健康造成潜在危害，包括组织损伤、细胞内氯酪氨酸残留水平升高和蛋白质修饰等。异常的次氯酸水平会引起氧化应激，最终导致各种疾病，包括肺损伤、动脉粥样硬化、肾脏疾病、神经退行性变和某些癌症。因此，快速、灵敏、选择性检测生物样品中的次氯酸相当重要。
3.近年来，荧光探针作为一种理想的检测工具，与其它检测方法相比，具有灵敏度高、可操作性强、可在体内进行生物成像分析等独特的优势而得到了广泛应用。部分次氯酸根荧光探针结构如下。
[0004][0005]
与其它ros相比，hocl的生物学作用在很大程度上仍未能被深入探索。由于次氯酸的氧化性强、寿命短、生物浓度相对较低，开发合适的次氯酸检测方法也具有挑战性。虽然目前利用次氯酸的氧化能力也开发了许多荧光探针。但是，上述现有的次氯酸探针分子存在易受其它相关物种(例如：醋酸根、卤素离子、亚氯酸根、氯酸根、磷酸氢根、磷酸二氢根、碳酸根、硝酸根和亚硝酸根等阴离子；ag

、al
3
、ba
2
、ca
2
、ni
2
等阳离子；h2o2、o
2-、 onoo-等活性氧化合物)的干扰，导致对次氯酸的检测特异性较差、灵敏度欠理想。


技术实现要素：

[0006]
针对现有的次氯酸荧光探针存在易受其它相关物种干扰(特异性较差) 和灵敏度欠理想的问题，本发明提供一种新型次氯酸根荧光探针、其制备方法及其用于次氯酸根检测的方法，其目的在于提供一种针对次氯酸分子特异性更强、灵敏度更高的荧光探针。
[0007]
式i所示的化合物：
[0008][0009]
本发明还提供式i化合物的制备方法，包括如下步骤；
[0010]
(1)将(2s,3s)-二苯基乙二胺和柠檬酸混合反应，得到(2s,3s)-5-氧代-2,3
-ꢀ
二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶-7-羧酸；
[0011]
(2)将(2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶-7-羧酸进行反应后得到甲基(2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶
ꢀ-
7-羧酸酯；
[0012]
(3)将甲基(2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶-7
-ꢀ
羧酸酯依次与1,4-二溴丁烷和4-甲基吡啶反应，既得式i化合物。
[0013]
优选的，步骤(1)的反应条件为：将(2s,3s)-二苯基乙二胺和柠檬酸在于60-180℃下水热合成。
[0014]
优选的，步骤(1)的反应温度为140℃；和/或，反应时间为0.5-12h，优选为4h；和/或，所述柠檬酸与原料a的摩尔比为1：(0.5～2)，优选为 1：1。
[0015]
优选的，所述步骤(2)的反应条件为：在有机溶剂中加入碱的条件下与甲基碘反应，所述有机溶剂选自dmf，thf、dmso或丙酮，所述碱选自无机碱或有机碱；优选的，无机碱选自k2co3，有机碱选自dbu。
[0016]
优选的，步骤(2)的反应温度为0-40℃，反应时间为3h。
[0017]
优选的，所述步骤(3)中具体包括如下步骤：
[0018]
(3.1)将甲基(2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶
ꢀ-
7-羧酸酯溶于有机溶剂中并加入碱的条件下与1,4-二溴丁烷反应，所述有机溶剂选自dmf，thf、dmso或丙酮，所述碱选自无机碱或有机碱；优选的，无机碱选自k2co3，有机碱选自dbu；优选的，反应温度为40-60℃，反应时间为3-5h；
[0019]
(3.2)将步骤(3.1)得到的产物分离后，溶于mecn或甲苯，并在惰性氛围下加入4-甲基吡啶反应，产物分离后即得式i化合物；优选的，步骤 (3.2)的反应时间为6-12h。
[0020]
本发明还提供式i化合物用于次氯酸根检测的用途。
[0021]
本发明还提供式i化合物检测次氯酸根的方法，包括如下步骤：
[0022]
(1)将式i化合物加入待测样品；
[0023]
(2)通过荧光光谱测试待测样品的激发发射光谱，根据发射光谱的荧光强度计算待测样品中的次氯酸根含量。
[0024]
优选的，式i化合物的使用方式是配制成10-2-10-3
m的母液并加入待测样品中；
[0025]
和/或，所述激发发射光谱的激发波长为425-500nm。
[0026]
本发明提供了一种新的用于次氯酸根检测的荧光探针，相比于现有的其他荧光探针分子，本发明提供的荧光探针分子具有更高的特异性和灵敏度。
[0027]
此外，本发明的荧光探针在合成过程中原料采用柠檬酸，具有廉价和低毒性的优点，且第一步的环合不使用任何有毒溶剂和催化剂，减少生产过程对环境保护的压力。
[0028]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0029]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0030]
图1为本发明提供的荧光探针分子在不同溶剂中的紫外吸收光谱；
[0031]
图2为本发明提供的荧光探针分子在不同溶剂中的荧光光谱；
[0032]
图3为本发明提供的荧光探针分子在不同活性氧溶液的荧光强度；
[0033]
图4为各种离子对本发明提供的荧光探针分子检测次氯酸根的干扰；
[0034]
图5为检出限的测定过程中不同次氯酸根浓度与荧光强度的关系；
[0035]
图6为本发明实施例2中检测水样的结果。
具体实施方式
[0036]
下面通过具体的实施例对本发明的方案作进一步的说明。
[0037]
实施例1：荧光探针分子的合成
[0038]
1、甲基(2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶-7-羧酸酯的合成
[0039]
合成路线如下：
[0040][0041]
将(2s,3s)-二苯基乙二胺和柠檬酸在140℃下，水热合成4h后得到 (2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶-7-羧酸，将其和 k2co3(3mmol，414mg)溶解在dmf(10ml)中并在40℃搅拌30分钟，然后向其中加入mei(300mg，1.1mmol)将混合物在40℃下搅拌3小时，直到通过tlc检测到反应完全。将反应混合物放入水中，用乙酸乙酯(ea) 萃取，在减压下浓缩。粗产物通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/石油醚纯化，得到纯产物。
[0042]
甲基(2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶-7-羧酸酯核磁数据表征为：1h nmr(400mhz,dmso
–
d6)δ8.52(s,1h),7.46
–
7.35 (m,6h),7.35
–
7.32(m,
2h),7.26
–
7.21(m,2h),6.03(d,j＝1.6hz,1h),5.93 (d,j＝1.6hz,1h),5.34(d,j＝2.7hz,1h),4.88(d,j＝2.7hz,1h),3.84(s,3h). hrms(esi)calcd for[c21h18n2o3 h] 346.1317；found:347.1321.
[0043]
甲基(2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶-7-羧酸酯熔点为：108.7-109.8℃
[0044]
2、荧光探针分子的合成
[0045][0046]
将甲基(2s,3s)-5-氧代-2,3-二苯基-1,2,3,5-四氢咪唑[1,2-a]吡啶-7-羧酸酯(692mg，2mmol)和cs2co3(977mg，414mg)溶解在thf(10ml) 中并在60℃搅拌30分钟，然后用1,4-二溴丁烷(648mg，3mmol)将其加入到混合物中，并在40℃下搅拌3h，通过tlc监测。将反应混合物放入水中，用乙酸乙酯(ea)萃取，在减压下浓缩。粗产物通过硅胶色谱法用乙酸乙酯/meoh纯化，得到纯产物。将产物溶解于mecn中，在搅拌下加入等当量的4-甲基吡啶，并在室温在氩气下搅拌12h，通过tlc监测。减压除去溶剂，残余物通过硅胶色谱法用dcm/meoh纯化，得到纯产物。
[0047]
1-(4-((2s,3s)-7-(甲氧羰基)-5-氧代-2,3-二苯基2,3-四氢咪唑[1,2-a]吡啶
ꢀ-
1(5h)-基)丁基)-4-吡啶-1-盐(9):1h nmr(400mhz,dmso
–
d6)δ8.81(d,j ＝6.6hz,2h),7.97(d,j＝6.3hz,2h),7.41(m,6h),7.23(m,2h),7.19
–
7.15 (m,2h),6.09(d,j＝1.4hz,1h),5.93(d,j＝1.4hz,1h),5.31(d,j＝3.0hz, 1h),4.79(d,j＝3.0hz,1h),4.47(t,j＝6.7hz,2h),3.87(s,3h),3.51(m,1h), 2.93(m,1h),2.61(s,3h),1.84
–
1.74(m,2h),1.43(m,2h).
13
c nmr(101 mhz,dmso
–
d6)δ166.19,159.85,159.26,153.19,144.06,143.96,139.63, 139.35,129.77,129.39,129.28,128.82,128.63,126.75,126.08,106.44,79.12, 70.56,66.91,59.71,53.25,49.05,43.26,28.36,23.61,21.84.389.1496 [c31h32n3o3 ] 494.2438；found:494.2433.
[0048]
实施例2：荧光探针分子用于次氯酸根检测
[0049]
1、不同溶剂对荧光(紫外)性质的影响的测试方法
[0050]
1)实验溶剂：分别选取n’n-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、乙酸乙酯、水，甲醇、丙酮、四氢呋喃、乙腈、二氯甲烷等作溶剂，其中这几种样品纯度均符合分析测试要求。
[0051]
2)实验条件：实验温度为室温(25℃)，狭缝宽度＝2.5nm，样品浓度 c＝10-5
m。
[0052]
3)实验步骤:分别称取1-2mg样品溶解于不同溶剂中，得到浓度为10-3
m 的母液，置于冰箱中避光保存备用。测试时将对应的母液取出30μl稀释到 3ml，得到10-5
m的待测液。将待测液在紫外分光光度计上测得吸收光谱及最大吸收值，然后再在荧光光仪器上用该吸收值激发得到发射光谱。实验重复3次。
[0053]
实验结果如图1和图2所示。可以看到在多种溶剂中，本发明提供的荧光探针分子紫外吸收及发射的荧光均在400-550nm范围内。
[0054]
2、不同离子对荧光(紫外)性质的影响的测试方法
[0055]
1)实验溶剂：选取0.1m pbs缓冲液作为实验溶剂。
[0056]
2)离子溶液的配置：
[0057]
a)金属离子及非金属离子均配置0.1m的离子溶液。
[0058]
b)活性氧溶液的配置方法如下：
[0059]
o2·-：用cah2预干燥dmso过夜，然后将预干燥的dmso离心(3000r/min, 20min)得到无水的dmso后，加入ko2超声溶解(保存于-20℃冰箱中)；
[0060]
·
oh：利用氯化亚铁和过量的双氧水现配现用；
[0061]
onoo-：将20ml hcl 20ml hcl(0.6n)和双氧水(0.7n)的混合溶液与20ml亚硝酸钠溶液(0.6n)迅速倒入到冰块上，1s内倒入20ml冷的naoh溶液(1.2n)。溶液颜色由无色变为黄色，然后加入30mg mno2除去多余的双氧水，密封置于冰箱中保存。利用紫外标定其最终浓度(ε
302
＝1670 m-1
cm-1
)；
[0062]
h2o2：用30％的双氧水稀释，通过紫外标定其最终浓度(ε
240
＝43.6m-1
cm -1)；
[0063]
clo-：用5％的naocl稀释；
[0064]
tbhp(tbuooh)：将70％的tbhp溶液稀释至最终浓度为0.1m。
[0065]
3)实验条件：实验温度为室温(25℃)，狭缝宽度＝2.5nm，样品浓度c＝10-5m[0066]
4)实验步骤:分别称取1-2mg样品溶解于不同溶剂中，得到母液浓度为 10-3
m，置于冰箱中避光保存备用。然后将对应的母液取出30μl稀释到3ml 得到10-5
m的待测液。待测液配制两份，其中一份加入步骤2)配制的离子溶液，另外一组作为空白对照，将待测液在紫外分光光度计上测得吸收光谱及最大吸收值，然后再在荧光光仪器上用该吸收值激发得到发射光谱。
[0067]
实验重复3次。
[0068]
实验结果见图3。可以看到，只有在clo-溶液中，待测液的荧光强度显著降低，说明本发明提供的化合物在pbs缓冲液中对离子有良好的选择性，对次氯酸根有特异性识别。
[0069]
3、离子干扰的测试方法
[0070]
实验步骤和实验条件与上述实验2中条件保持一致，但首先加10eq的干扰离子测试其荧光性质以后再加入等当量的次氯酸根再测试其光学性质。实验重复3次。
[0071]
实验结果见图4。可见各种干扰离子对次氯酸根的检测干扰很小。
[0072]
4、检出限的测试方法
[0073]
实验步骤和实验条件与上述实验2中条件保持一致，但首先配置11组空白样并扫描记录，标准偏差σ＝4.69，然后按照0.5、1eq-10eq的顺序加入次氯酸根并测试其光学性质测得斜率k＝281.7。实验重复3次。
[0074]
实验结果见图5，得到检出限dl＝3σ/k＝0.425μm。该检测限远低于细胞内次氯酸根的含量。
[0075]
5、实际水样的检测方法
[0076]
实验步骤和实验条件与上述实验2中条件保持一致，但使用的水样选择去离子水，自来水以及西华大学沱江河里面的水作为检测物质，其中自来水以及沱江水经过简单的过滤处理。加入探针溶液10-5
m然后测荧光性质，然后加入10eq的次氯酸钠溶液测试其荧光性质。实验重复3次。
[0077]
实验结果见图6，可以看到，本发明提供的荧光探针分子在检测水样中的次氯酸根
时表现稳定。
[0078]
综上所述，本发明得到的荧光探针分子对次氯酸根检测具有良好的选择性，抗离子干扰，具有专一性。其次探针的检出限较低，达到0.425μm，远低于细胞内次氯酸根的值，从而使得该荧光探针分子用于次氯酸根检测具有较高的灵敏度。且该探针溶液在试剂水样检测中表现良好。