用于鉴定和验证共有候选抗原和共有抗原特异性T淋巴细胞对的方法和系统

用于鉴定和验证共有候选抗原和共有抗原特异性t淋巴细胞对的方法和系统
技术领域
1.本发明涉及用于鉴定和验证候选抗原和其同类(cognate)抗原特异性t淋巴细胞对的方法和系统，其可用于验证配对抗原和tcr序列的免疫原性活性以及用于表征和/或治疗医学病况。
2.背景
3.最近，免疫疗法的重要性大大增加。在治疗或预防癌症方面尤其如此，但是免疫疗法也应用于其他医学病况，例如过敏。
4.已知各种免疫治疗技术，包括激活免疫疗法，例如基于树突细胞的初免和t细胞过继转移，以及使用t淋巴细胞的自体免疫增强疗法。
5.免疫疗法开发中出现的一个问题是功能性靶抗原和其同类t细胞和/或t细胞受体序列的鉴定。与癌症免疫疗法相关的一种普遍采用的方法是寻找源自肿瘤细胞中体细胞突变的候选新抗原，例如通过对肿瘤dna或rna进行深度测序。这种方法的一个目标是开发基于新抗原的癌症疫苗，其是针对个体患者的突变谱高度定制的。这种高度个性化癌症免疫疗法需要癌症患者提交他们的肿瘤dna进行深度测序，随之完成计算机分析以鉴定可用于界定用于癌症治疗的个体癌症疫苗的候选抗原肽序列。这种方法耗时、复杂、昂贵，并且依赖于对候选肽的抗原性的最佳猜测。重要地，这种方法不能提供快速且同步鉴定同类t细胞和tcr序列。此外，它不适用于快速和/或同步功能性验证可用于开发癌症疗法的这类同类t细胞和tcr序列。这种方法的另一个难点在于虽然癌症是一种通常由致癌突变驱动的疾病，但是界定个体患者的基因谱的突变模式是唯一的，并且大多数体细胞突变的致癌性是未知的，大多数体细胞突变的抗原性也是未知的。最近对癌症相关体细胞突变的抗原性的研究发现，1,000个源自错义突变的候选抗原肽中只有不到1个导致功能性新抗原，此外，该分析并未导致鉴定从中开发定制疗法的t细胞或tcr对。实际上，当在个体癌症患者的水平上检查时，体细胞突变非常罕见，通常存在于不到0.5％的肿瘤细胞中。因此，可能难以鉴定由体细胞突变产生的功能性癌症新抗原。
6.通过活检组织的外显子测序以鉴定癌症相关蛋白中的错义突变来预测潜在的癌症新抗原的目前方法还存在其他限制。在分析外显子测序数据之后，接着使用旨在优先化潜在的抗原肽序列的算法来预测计算机模拟的hla肽；然后利用这些预测的氨基酸序列(通过各种基于肽、rna或dna的方法)开发患者特定的癌症疫苗。这种方法有很大的局限性。由于大多数dna突变不会导致肿瘤驱动事件，肿瘤进化期间不会选择这些“私人突变”，并且在群体水平上观察时，这种“私人突变”既不会积累也不会再发生，因此不会聚类成离散的患者亚组。相反地，有许多显示高度复发的肿瘤驱动突变的示例；例如，黑素瘤中的braf-v600e，肺癌中的egfr激酶结构域突变，乳腺癌中的her2扩增和突变，或胰腺癌、结直肠癌和肺癌中的kras突变。有趣的是观察到上述致癌突变并不是特别具有免疫原性，也没有导致靶向免疫疗法的成功开发。因此，非常需要开发提供快速有效地鉴定和验证癌症患者群体共有的癌症抗原的方法和系统。此外，肽抗原预测算法可能不适用于预测与某些hla等位基
因(例如亚洲人常见的那些)结合的肽。相反，预测与亚洲人特异性hla等位基因结合的肽新抗原可能不适合作为非亚洲人群共同的hla等位基因的结合伴侣。因此，需要的是稳健的系统和方法，其提供对任何候选抗原-hla复合物的评估以便可使用任何hla亚型完成抗原-t淋巴细胞对的筛选。非常需要提供快速有效地鉴定和表征结合并破坏呈递共有抗原的肿瘤的同类抗原定向t细胞伴侣和t细胞受体的系统和方法。总之，仍然需要能够快速鉴定和验证共有癌症抗原和抗原特异性t淋巴细胞的功能性免疫调节对。
7.先前还提出了新抗原可能来自异常调控的mrna剪接事件。然而，经由这种方法开发癌症免疫疗法仍然具有挑战性。例如，很难鉴定肿瘤特异性的mrna剪接事件，这是鉴定癌症相关剪接变体蛋白(svp)必不可少的步骤，svp可作为源自剪接的抗原来源进行评估。开发稳健标示与癌症相关的rna剪接中的变化以使针对存在于疾病和正常组织中的抗原的免疫疗法引起的脱靶毒性风险最小化的系统也是至关重要的。检测源自异常调控的mrna剪接事件的蛋白质变体也存在重大挑战，因为在以低丰度存在的转录本中发现了许多可变剪接事件。即使发现剪接变体翻译成蛋白质的证据时，也不能保证源自全长蛋白质的肽将具有免疫原性活性。
8.因此，通常期望克服或改善一个或多个上述难点。本发明为发现和开发精确免疫疗法的这些问题提供了解决方案。
9.概述
10.本发明基于以下认识：异常调控的前mrna剪接事件是患者亚组之间共有的，并且源自蛋白质剪接形式的肽解决了在免疫疗法中开发新抗原的限制。本文定义的方法教导了一种或多种候选抗原的鉴定和验证，该候选抗原是具有特定医学病况(如，癌症)的患者亚组共有的。这可以允许基于一种或多种经验证的共有候选抗原为该患者亚组快速开发诊断测试和治疗选择。本文定义的方法还教导了结合并识别一种或多种源自异常调控的mrna剪接的共有抗原的一种或多种同类t淋巴细胞和t细胞受体(tcr)的鉴定和验证：该方法进一步教导共有抗原和其同类t淋巴细胞也是具有特定医学病况(如，癌症)的患者亚组共有的。这也可以允许基于一种或多种经验证的共有抗原为该亚组患者快速开发t细胞治疗选择。本文定义的方法还教导了平行验证一对或多对抗原和同类t淋巴细胞。这些对也是具有特定医学病况(如，癌症)的患者亚组共有的。这也可以允许基于一个或多个经验证的免疫治疗对为该患者亚组快速开发基于tcr的治疗选择。
11.先前未证明经由编码序列的变化导致与癌症相关的蛋白质序列变化的异常mrna剪接事件也可能导致癌症患者中抗原肽的呈递。先前也未确定癌症患者中与肿瘤相关的剪接变化是否会导致共有癌症抗原的发展，或这种候选共有抗原肽是否在肿瘤细胞上展示，和/或这种表面展示的hla-肽抗原是否会结合并激活功能上杀死具有共有mrna剪接事件的肿瘤细胞的同类t淋巴细胞。
12.本文公开了鉴定用于表征和/或治疗医学病况的一个或多个共有候选抗原的方法，该共有候选抗原是患有该医学病况的患者亚组共有的，该方法包括：
13.(i)获得来自患有该医学病况的第一组患者的测试样品的转录组数据；
14.(ii)获得一组参照样品的参照转录组数据；
15.(iii)通过将转录组数据与参照转录组数据进行比较，确定与参照样品相比在测试样品亚组的各个样品中转录更高的一个或多个剪接变体；
16.(iv)对于各个所述共有剪接变体，确定存在于共有剪接变体的氨基酸翻译中但不存在于参照样品中转录的同一基因的相应剪接变体的氨基酸翻译中的一个或多个氨基酸序列；以及
17.(v)预测一个或多个共有氨基酸序列或其部分的hla结合，以将一个或多个共有氨基酸序列鉴定为一个或多个共有候选抗原。
18.本文公开了鉴定共有抗原-t淋巴细胞对的方法，该方法包括：
19.a)根据本文定义的方法鉴定共有候选抗原；提供一种或多种各自标记的生物分子，其包含标记物和含有共有候选抗原的肽；
20.b)将一种或多种标记的生物分子与一个或多个包含来自患有医学病况的患者的外周血的样品接触；以及
21.c)从一个或多个样品中鉴定与所述标记的生物分子结合的t淋巴细胞，从而鉴定共有抗原-t淋巴细胞对。
22.本文公开了用于鉴定与根据本文定义的方法鉴定的一个或多个共有候选抗原特异性结合的t淋巴细胞的方法，该方法包括：
23.a)提供一种或多种各自标记的生物分子，其包含标记物和各自的候选抗原；
24.b)将一种或多种标记的生物分子与一个或多个包含来自患有医学病况的分别的患者的外周血的样品接触；以及
25.c)从一个或多个样品中鉴定与所述标记的生物分子结合的t淋巴细胞。
26.本文公开了表征受试者中的医学病况的方法，该方法包括确定根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的水平，其中与参照相比增加的一种或多种共有抗原水平将该医学病况表征为与该一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况。
27.如本文定义的与一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况还表明该医学病况可能对用合适的免疫疗法治疗有应答。
28.本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括(a)确定根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的水平，其中与参照相比增加的一种或多种共有抗原的水平将该受试者中的医学病况表征为与该一种或多种共有抗原表达相关的医学病况，以及(b)治疗发现患有与该一种或多种共有抗原表达相关的医学病况的受试者。
29.本文公开了表征受试者中的医学病况的方法，该方法包括确定与根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原特异性结合的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将该受试者中的医学病况表征为与该一种或多种共有抗原表达相关的医学病况。
30.本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括a)确定与根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原特异性结合的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将该受试者中的医学病况表征为与该一种或多种共有抗原表达相关的医学病况；以及b)治疗发现患有与该一种或多种共有抗原表达相关的医学病况的受试者。
31.本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括：
32.(a)确定与本文定义的一种或多种共有抗原特异性结合的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将该医学病况表征为与该一种或多种共有抗原表达相关的医学病况；
33.(b)分离和离体扩增该t淋巴细胞的群；以及
34.(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗发现与该一种或多种共有抗原表达相关的医学病况。
35.本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括：
36.(a)在患有医学病况的受试者中分离与根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原特异性结合的t淋巴细胞群，并离体扩增该t淋巴细胞群；以及
37.(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的医学病况。
38.本文公开了免疫调节组合物，其包含根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原和药学上可接受的载体。
39.本文公开了刺激受试者中的免疫应答的方法，该方法包括在一定条件下持续足够的时间向受试者施用有效量的根据本文定义的方法的免疫调节组合物以刺激受试者中的免疫应答。
40.本文公开了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是mark3、nbpf9、pard3、zc3hav1、yaf2、camkk1、lrr1、zng670、grina或mzf1剪接变体，hla亚型是hla-a11或hla-a24，并且t淋巴细胞与共有抗原结合。
41.在一个实施方案中，提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是mark3剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有mark3抗原结合。
42.本文公开了包含与共有抗原结合的hla分子的经标记的生物分子，其用于检测与该共有抗原特异性结合的t淋巴细胞的存在或确定其水平。
43.本文公开了与根据本文定义的方法鉴定的共有抗原特异性结合的抗体，其中所述共有抗原与hla分子结合。
44.本文公开了与根据本文定义的方法鉴定的共有抗原结合的t细胞受体(tcr)，其中所述共有抗原与hla分子结合。
45.本文公开了包含编码如本文定义的t细胞受体的核酸的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞能够特异性结合共有抗原或其片段，其中所述共有抗原或其片段与hla分子结合。
46.本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括持续足够的时间且在一定条件下向受试者施用本文定义的tcr或本文定义的工程化免疫细胞以治疗受试者中的医学病况。
47.本文公开了产生抗体的方法，该方法包括：
48.(a)用根据本文定义的方法鉴定的共有抗原免疫动物；
49.(b)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该共有抗原的b细胞；以及
50.(c)产生由该b细胞表达的抗原结合分子。
51.本文公开了药物组合物，其包含本文定义的抗体、溶解性tcr或工程化免疫细胞以及药学上可接受的载体。
52.本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括持续足够的时间且在一定条件下向受试者施用本文定义的药物组合物以治疗受试者中的医学病况。
53.本文公开了鉴定共有抗原-t淋巴细胞对的方法，该方法包括：
54.(i)获得来自患有医学病况的第一组患者的测试样品的转录组数据，其中该组包括多名患者；
55.(ii)获得一组参照样品的参照转录组数据；
56.(iii)通过将转录组数据与参照转录组数据进行比较，确定与参照样品相比在测试样品亚组的各个样品中转录更高的一个或多个剪接变体，
57.(iv)对于各个所述共有剪接变体，确定一个或多个存在于该剪接变体的氨基酸翻译中但不存在于参照样品中转录的同一基因的相应剪接变体的氨基酸翻译中的氨基酸序列；
58.(v)预测一个或多个共有氨基酸序列或其部分的hla结合，以将一个或多个氨基酸序列鉴定为一个或多个共有候选抗原；
59.(vi)提供一种或多种标记的生物分子，其包含标记物和含有共有候选抗原的肽；
60.(vii)使一种或多种标记的生物分子与一个或多个包含来自患有医学病况的患者的外周血的样品接触；
61.(viii)从一个或多个样品中鉴定与所述标记的生物分子结合的t淋巴细胞，从而鉴定共有抗原-t淋巴细胞对。
62.附图简述
63.下文仅通过非限制性示例的方式参考附图描述本发明的实施方案，其中：
64.图1(a)是用于鉴定表征和/或治疗医学病况的候选抗原的方法的流程图。
65.图1(b)是用于鉴定抗原特异性t淋巴细胞的方法的流程图。
66.图2是用于鉴定表征和/或治疗医学病况的共有候选抗原的方法的示意性工作流程。
67.图3显示正常和肿瘤样品中psi值分布的脊状图示例。显示了10个剪接事件的脊状图。在其中一些示例中，“异常值”以虚线框显示。这些“异常值”是具有与其余肿瘤样品不同的psi值的肿瘤样品。
68.图4显示来自具有肿瘤和正常样品的组的两名患者的sashimi图示例。sashimi图显示映射到外显子接合处/连接处(junction)以及外显子本身的测序读段的密度。基于测序读段密度，可能推断样品中表达的剪接变体同等型。显示的数字是指跨越剪接点(splice junction)的读段数目。在本示例中，基于sashimi图，正常样品(编号以“n”结尾)显示跳跃的剪接变体同等型的表达增加，而肿瘤样品(编号以“t”结尾)显示具有中间外显子纳入的剪接变体同等型的表达增加。
69.图5说明观察到的剪接事件类型及其相应的潜在候选抗原区。观察到五种类型的剪接事件；即：sie-跳跃/纳入事件；mxe-外显子的可变使用；ire-内含子保留事件；a5e-可变5'剪接事件；和a3e-可变3'剪接事件。这些剪接事件中的每一个都可产生两种剪接同等型，其中一种更可能与癌症相关。序列的添加(通过外显子或内含子或其部分的差异使用)可能导致翻译框的变化(图中右侧由’显示，例如a’)。这可能对用于随后预测hla结合肽的抗原区(在该图中由浅灰色线显示)有影响。
70.图6(a)是描述确定剪接改变是否导致蛋白质序列变化以及剪接同等型之间不同的氨基酸区以鉴定潜在的hla结合肽的方法的示意图。对于各个剪接事件，确定外显子1的翻译框，如果它是非编码的或它是编码的但包含终止密码子，则将其丢弃。如果是编码的，
则外显子1基于起始密码子的位置或根据数据库(如，ensembl)为该外显子获得的翻译框进行翻译。对于两种同等型(同等型1和2)都这样完成。抗原区(i)通过剪接模式的变化是否导致翻译框的变化和(ii)通过比较两种同等型的蛋白质序列来确定，在图6(b)中更详细地显示。(b)是说明用于确定剪接事件的潜在候选抗原区的氨基酸序列的方法示例。每个剪接事件产生两种剪接同等型(肿瘤相关[ta]和非肿瘤相关[n])，并显示潜在候选抗原区(加下划线的文本，由两个组分组成：n末端和c末端)。侧翼区(a-h)加剪接位点接合处的氨基酸(j)的长度等于hla结合肽的长度(本示例中为9)。分别比较各个剪接同等型剪接位点的n末端和c末端，以确定n末端和c末端侧翼区长多少个氨基酸。如果剪接事件导致框的变化，则c末端侧翼区由最后一个外显子的所有氨基酸序列组成。迭代比较两种剪接同等型下划线区的氨基酸序列(从接合氨基酸j
t
和jn开始，接着是a
t1
和a
n1
等)。如果它们相同，则从肿瘤相关同等型的侧翼区(a
tx
，其中x指最外面的氨基酸，在本示例中从a开始至h)去除氨基酸；否则进程停止。抗原区由连接剪接事件的n末端和c末端区比较的结果组成。此外，如果剪接事件导致纳入来自内含子或外显子或其部分包含的附加序列，则潜在候选抗原区将含有来自这些序列的翻译的氨基酸序列。假设我们寻找：(i)9个氨基酸长的潜在hla结合肽；(ii)已表明与肿瘤相关的外显子跳跃同等型；(iii)肿瘤相关和非肿瘤相关的剪接同等型接合处的氨基酸相同(j
t
＝jn)；以及(iv)剪接事件不引起翻译框的变化。来自这组假设的潜在候选抗原区显示在底部(示例最终输出)，其用于肿瘤相关的外显子跳跃事件。在本示例中，潜在候选抗原区包括从最初8个氨基酸长的侧翼区两端去除一个侧翼氨基酸。
[0071]
图7是显示制备hla四聚体-剪接变体候选抗原复合物以表征源自癌症患者的t淋巴细胞的示意图。
[0072]
图8是用于鉴定候选抗原以表征和/或治疗医学病况的示例系统的框图；和
[0073]
图9是图8的系统的抗原预测设备的示例架构的框图。
[0074]
图10是显示用于从胃癌中的剪接获得抗原的工作流程示意图。简言之，使用miso对来自胃癌(gc)患者的rna-seq数据进行剪接改变的分析。将选择标准(前0.5％的剪接事件、至少20％的剪接变化(δpsi)、贝叶斯因子》20和至少3名患者发生)应用于数据以生成剪接事件列表。然后我们寻找导致蛋白质序列变化的剪接事件。随后将这些由改变的剪接产生的蛋白质区域(291个蛋白质区域)用于预测能与hla a11结合的8-11个氨基酸长的肽(总共39,876个肽)。将netmhcpan3用于预测hla结合，并且选出153个对hla a11具有高亲和力的肽(排序《＝0.5％)。通过去除相似的肽，该列表进一步减少到77个肽。
[0075]
图11是显示19名患者组中鉴定的gc肿瘤相关剪接改变的总结的示意图和图示：(a)胃癌中发现的剪接改变类型的总结。具体地，发现有5种不同类型的剪接事件被解调控，即：外显子跳跃/纳入、外显子的可变使用、内含子保留、以及可变5'和可变3'剪接位点。这些事件大多数是外显子跳跃/纳入；(b)gc-ase的分布：源自mark3剪接的肽抗原的普遍性。gc中鉴定的剪接事件的发生率和psi的柱状图。
[0076]
图12是显示以下的图示：(a)来自gc患者中的gc ta-ase数据集cytof筛选的mark3肽的鉴定。显示患者sc020具有与源自mark3异常剪接的肽反应的ctl的柱状图。左下图显示患者sc020中由mark3剪接变体肽(svp)染色的细胞聚类。右侧图显示识别mark svp的ctl表型，使用激活、衰老标志物和耗竭标志物；以及(b)使用荧光标记的a11 mhc四聚体确认mark3肽。
[0077]
图13是显示以下的图示：gc ta-ase肽筛选中的阳性对照肽。cytof筛选中使用的阳性对照。所示肽源自爱泼斯坦-巴尔病毒(epstein barr病毒,ebv)。这些ebv抗原在群体中很常见。柱状图显示在用于筛选gc患者中源自剪接的抗原的同一患者组中这些ctl的频率。
[0078]
图14是显示以下的图示、示意图和照片：(a)mark3 gc肿瘤相关剪接事件中位数δpsi＝-0.335，发生率＝4/19名gc患者。原始gc rna-seq中mark3异常剪接的sashimi图。这些图显示各个样品的映射到外显子的测序读段以及映射到外显子接合处的读段的计数以及psi值。显示正常和肿瘤样品的sashimi图：正常样品编号以“n”结尾，肿瘤样品编号以“t”结尾。在这四对样品中，肿瘤样品中具有增加的备选外显子的纳入。19名患者中有4名发现mark3的改变剪接，并且显示约35％的可变剪接外显子纳入；(b)在此显示获自ensembl grch37.p13的转录本，示出对应于同等型1至4的不同mark3剪接同等型；(c)gc细胞系中mark3异常剪接的rt-pcr验证。上图显示mark3中两种备选外显子的图(外显子24用垂直条纹表示，并且外显子25用斜条纹表示)。具有垂直条纹的外显子编码cytof筛选中检测到的肽(如下方所示)。这两种外显子的可变剪接导致形成四种同等型(1-4)，同等型1和3都包含cytof筛选中检测到的肽。下图是表明与其他细胞系相比，hfe145、snu1、hs738t、hs746t和hgc27中增加了mark3同等型1/3的表达(标星号)的rt-pcr；(d)是显示gc细胞系中mark3剪接同等型1至4的定量的表，显示了每种同等型占总数的百分比。显示了mark3同等型1和3占所有mark3同等型的百分比，具有增加的同等型1和3表达的gc细胞系加下划线。pcr产物在tbe-page凝胶上运行后，通过对dna条带强度的密度测定来完成mark3同等型的定量；以及(e)是验证胃ffpe样品中mark3异常剪接的照片示意图。rt-pcr验证来自胃癌患者(1-20)的ffpe样品和肥胖治疗(bariatric)胃样品(21-26)中的mark3剪接。各个泳道下方指示的数字表示同等型1和3占所有mark3同等型总表达的百分比。20名gc患者中有7名(加下划线的样品)观察到增加的mark剪接同等型的表达，该同等型包含编码已鉴定的mark3剪接变体抗原的外显子。
[0079]
图15是显示以下的照片：(a)来自用或不用mark3肽刺激的健康供体的pbmc中elispot测定ifn-γ的结果。ctl仅在识别其同类抗原时才分泌ifn-γ。从该图中，仅当pbmc用mark3肽刺激时，才观察到分泌ifn-γ的ctl；和(b)mark3 ctl的细胞杀伤测定结果。mark3特异性ctl可以以剂量依赖性方式介导对表达mark3剪接变体抗原和hla-a11的hgc-27细胞系的杀伤。
[0080]
图16是分离mark3特异性cd8 t淋巴细胞和这些细胞的单细胞分选的facs数据的图示。细胞分选前，用抗-cd3、抗-cd8抗体、hla-a*11mark3五聚体和dapi对来自用负载mark3肽的抗原呈递细胞刺激的健康供体的纯化cd8 t细胞进行染色。细胞使用前向(fsc-a)和侧向(ssc-a)散射区域参数进行门控，接着使用fsc-a相比高度(fsc-h)对单细胞进行门控。mark3特异性cd8 t淋巴细胞通过门控dapi阴性活细胞、cd8和cd3的表达以及与hla-a11 mark3五聚体的结合来鉴定。然后将这些mark3特异性cd8 t淋巴细胞分选成单细胞至pcr板中用于随后的tcr鉴定。
[0081]
图17是tcga spliceseq数据库中头颈鳞状细胞癌(hnsc)、肾脏肾透明细胞癌(kirc)和肾脏肾乳头状细胞癌(kirp)的mark3外显子24(tcga spliceseq中的外显子17)的可变剪接的示意图和图示。正常样品显示为条纹框，而肿瘤样品显示为空白框。从该图中，
肿瘤样品显示增加了外显子24纳入。
[0082]
图18是显示cytof筛选(实施例3)中鉴定的包含mark3 sva的mark3同等型的可变剪接同等型的照片示意图：(a)在此显示源自头颈部鳞状细胞癌(hnsc)的细胞系中mark3异常剪接的rt-pcr。本图中表明对应于图14c中所示的同等型1至4的mark3同等型。标星号表明显示增加了mark剪接同等型1和3表达的hnsc细胞系(这些同等型包含cytof筛选中鉴定的mark3 sva肽，实施例3)；(b)显示mark3剪接同等型1至4的定量的表，具有增加了同等型1和3表达的hnsc细胞系加下划线。在tbe-page凝胶上运行pcr产物后，通过密度测定dna条带的强度来完成mark3同等型的定量。
[0083]
图19是显示结肠直肠癌中鉴定和验证共有候选抗原及其同类t细胞的总结的示意图和图示：(a)是显示从结肠直肠癌的剪接中衍生抗原的工作流程示意图。简言之，使用rmats对来自37名结肠直肠癌(crc)患者的rna-seq数据进行剪接改变的分析。将选择标准(至少20％的剪接变化(δpsi)、至少6名患者发生和大于10的剪接点计数)应用于数据以生成剪接事件列表。鉴定导致蛋白质序列变化的剪接事件，然后将这些由改变的剪接产生的蛋白质区(352个候选抗原区)用于预测可与hla a11结合的8-11个氨基酸长的肽(总共62,970个肽)。将netmhcpan3和netmhcpan4用于预测hla结合，并且返回425个对hla a11具有高亲和力的肽(任一算法的排序《＝0.5％)。通过去除相似的肽，该列表进一步减少到102个肽。在来自8名crc患者的pbmc中进行免疫筛选以鉴定抗原特异性t细胞(患者免疫应答)。这使用肽/hla四聚体和cytof进行，并导致针对27个svp的抗原特异性t细胞的鉴定。通过rt-pcr在差异剪接的癌细胞系中确认9个svp的表达。抗原特异性t细胞可在健康供体pbmc中针对这些svp中的3个生成，显示这些靶标是免疫性的。(b)在37名crc患者中观察到剪接改变类型的总结。具体地，发现有4种不同类型的剪接事件被解调控，即：外显子跳跃/纳入(sie)；内含子保留(ire)和可变5'(a5e)和可变3'剪接位点(a3e)。这些事件中的大多数是外显子跳跃/纳入。显示了产生编码序列变化的剪接事件的数目；(c)表明了crc-ase的分布和剪接事件的类型。显示了产生hla-a11肽的crc中鉴定的剪接事件的发生率和δpsi的柱状图。
[0084]
图20提供显示在crc hla-a11四聚体/cytof筛选中鉴定的svp靶标的两个表：(a)在8名crc患者中检测到的hla-a11结合肽的总结。这些患者中与这些靶标结合的cd8阳性t淋巴细胞的频率显示在第一个表中。产生这些svp的剪接事件的发生率、δpsi和类型也显示在第一个表中；(b)序列坐标以及产生svp的肿瘤相关同等型的总结。这些坐标基于人类grch37/hg19组装。
[0085]
图21是在结肠直肠癌中鉴定的肿瘤相关剪接的图示：(a)crc中鉴定的与肿瘤相关并导致蛋白质编码序列变化的剪接改变。每列代表来自crc患者的样品，每行代表单个剪接事件。显示了各个样品的psi值，并且肿瘤相比正常样品的psi值有明显区别。肿瘤相比正常样品之间psi值的这种差异表明，可将这些肿瘤相关剪接变体用于治疗crc患者；(b)显示个体crc患者中存在的共有肿瘤相关剪接变体的数目的柱状图。平均地，大多数患者显示约90个共有肿瘤相关剪接变体，而且这不限于任何分子亚型，也不限于crc患者中的微卫星状态。这与源自体细胞点突变的新抗原不同，后者主要见于msi/cms 1crc患者中。cms＝共识分子亚型；msi＝微卫星不稳定。
[0086]
图22是显示camkk1的可变剪接的示意图、图示和照片示意图：(a)显示来自crc患
者的正常(norm)和肿瘤(tum)样品中camkk1的psi值的点图；(b)显示在来自crc患者的肿瘤以及正常样品中发现的camkk1剪接同等型的sashimi图。与正常样品相比，肿瘤样品显示增加了外显子跳跃。sashimi图显示患者样品的测序读段密度，对于一组正常样品和一组为异常值的肿瘤样品具有足够的接合点计数。(c)人类grch37/hg19组装中存在的camkk1转录本。可变剪接的外显子用方框表示。先前未观察到这种外显子的可变剪接。通过rt-prc检测到的区域如下所示，除本研究中鉴定的外显子外它还包含额外的可变剪接外显子(灰色框)。这两个备选外显子导致4种不同剪接同等型的形成：277bp和163bp剪接同等型(均由ta表示)均包含本研究中鉴定的hla-a11结合肽。163bp剪接同等型(用ta和星号表示)是对应于本研究中检测到的剪接同等型的剪接同等型，如图22(b)的sashimi图所示；(d)crc细胞系以及源自患者的活检材料中camkk1异常剪接的rt-pcr。显示camkk1肿瘤相关剪接变体表达增加的样品标星号表示。对应于肿瘤相关剪接变体的条带由ta表示。较小的pcr条带(163bp)对应于由rmats鉴定的肿瘤相关剪接变体；(e)显示了camkk1的正常相关dna和正常蛋白质序列(seq id no:56和57)。显示了camkk1的肿瘤相关dna序列和肿瘤相关蛋白质序列(seq id no:58和59)。显示了图22(b)中所示剪接同等型的dna和氨基酸序列(标记为肿瘤和正常)。所鉴定的camkk1的外显子跳跃(由alt外显子表示)导致蛋白质序列变化。可变剪接的外显子包含22个核苷酸，该外显子的跳跃导致转录本的蛋白质翻译框变化。这导致新的蛋白质序列和蛋白质的提前终止。图20中鉴定的hla-a11结合肽加下划线；(f)显示来自hnsc患者的正常和肿瘤样品中camkk1的psi值的点图；(g)显示在来自hnsc患者的肿瘤以及正常样品中发现的camkk1剪接同等型的sashimi图。与正常样品相比，肿瘤样品显示增加的外显子跳跃。sashimi图显示患者样品的测序读段密度，对于一组正常样品和一组为异常值的肿瘤样品具有足够的接合点计数。(h)hnsc细胞系中camkk1异常剪接的rt-pcr。显示camkk1肿瘤相关剪接变体表达增加的样品标星号表示。对应于肿瘤相关剪接变体的pcr条带由“ta”表示。
[0087]
图23是显示lrr1的可变剪接的示意图、图示和照片：(a)显示来自crc患者的正常和肿瘤样品中lrr1的psi值的点图。(b)显示在来自crc患者的肿瘤以及正常样品中发现的lrr1剪接同等型的sashimi图。与正常样品相比，肿瘤样品显示增加的外显子跳跃。sashimi图显示患者样品的测序读段密度，对于一组正常样品和一组为异常值的肿瘤样品具有足够的接合点计数。(c)crc细胞系以及源自患者的活检材料中lrr1异常剪接的rt-pcr。显示lrr1肿瘤相关剪接变体表达增加的样品标星号表示。对应于肿瘤相关剪接变体的pcr条带由“ta”表示。(d)显示了lrr1的正常相关dna和正常蛋白质序列(seq id no:60和61)。显示了lrr1的肿瘤相关dna序列和肿瘤相关蛋白质序列(seq id no:62和63)。lrr1肿瘤相关剪接变体中发现的候选抗原区的dna和氨基酸序列与包含可变剪接外显子(图中显示的alt外显子)的剪接变体一起显示。仅显示了可变剪接外显子的部分序列(由段号显示)，并且该外显子的跳跃导致下游外显子的阅读框变化。lrr1的候选抗原区由不同的c末端组成，其长62个氨基酸，并产生可结合两种不同hla等位基因(分别为hla-a11和hla-24)的两种肽(分别为slprfgyrk和syhsipslprf，seq id no:36和seq id no:51)。在crc患者中检测到对这两种肽特异的抗原特异性cd8 t细胞。(e)显示了来自hnsc患者的正常和肿瘤样品中lrr1的psi值的点图。(f)显示来自hnsc患者的肿瘤以及正常样品中发现的lrr1剪接同等型的sashimi图。与正常样品相比，肿瘤样品显示增加的外显子跳跃。sashimi图显示患者样品的
测序读段密度，对于一组正常样品和为异常值的一组肿瘤样品具有足够的接合点计数。(g)hnsc细胞系中lrr1异常剪接的rt-pcr。显示lrr1肿瘤相关剪接变体表达增加的样品标星号表示。对应于肿瘤相关剪接变体的pcr条带由“ta”表示。
[0088]
图24是显示znf670的可变剪接的示意图、图示和照片。(a)显示来自crc患者的正常和肿瘤样品中znf670的psi值的点图。(b)显示来自crc患者的肿瘤以及正常样品中发现的znf670剪接同等型的sashimi图。与正常样品相比，肿瘤样品显示增加的外显子跳跃。sashimi图显示患者样品的测序读段密度，对于一组正常样品和一组为异常值的肿瘤样品具有足够的接合点计数。(c)crc细胞系以及源自患者的活检材料中znf670异常剪接的rt-pcr。显示znf670肿瘤相关剪接变体表达增加的样品用星号表示。(d)人类grch37/hg19组装中存在的znf670转录本。可变剪接的外显子用方框表示。先前未观察到该外显子的可变剪接。(e)显示了znf670的正常相关dna和正常蛋白质序列(seq id no:64和65)。显示了znf670的肿瘤相关dna序列和肿瘤相关蛋白序列(seq id no:66和67)。已鉴定的znf670的外显子跳跃导致蛋白质序列变化。可变剪接的外显子包含98个核苷酸，该外显子跳跃导致转录本的蛋白质翻译框的变化。这种异常剪接事件产生了包含蛋白质c末端变化的新的蛋白质序列。图20中鉴定的hla-a11结合肽加下划线。
[0089]
图25是显示grina的可变剪接的示意图、图示和照片：(a)显示来自crc患者的正常和肿瘤样品中grina的psi值的点图。(b)显示来自crc患者的肿瘤以及正常样品中发现的grina剪接同等型的sashimi图。与正常样品相比，肿瘤样品显示增加的跳跃。sashimi图显示患者样品的测序读段密度，对于一组正常样品和一组为异常值的肿瘤样品具有足够的接合点计数。(c)crc细胞系以及源自患者活检材料中grina异常剪接的rt-pcr。显示grina肿瘤相关剪接变体表达增加的样品用星号表示。对应于肿瘤相关剪接变体的pcr条带由“ta”表示。(d)显示来自hnsc患者的正常和肿瘤样品中grina的psi值的点图。(e)显示来自hnsc患者的肿瘤以及正常样品中发现的grina剪接同等型的sashimi图。与正常样品相比，肿瘤样品显示增加的跳跃。sashimi图显示患者样品的测序读段密度，对于一组正常样品和为异常值的一组肿瘤样品具有足够的接合点计数。(f)hnsc细胞系中grina异常剪接的rt-pcr。显示grina肿瘤相关剪接变体表达增加的样品用星号表示。对应于肿瘤相关剪接变体的pcr条带由“ta”表示。
[0090]
图26是对于鉴定的crc hla-a11 svp产生的抗原特异性cd8 t细胞的facs数据的图示。将来自健康供体(hsa27和hsa38)的pbmc用于生成modc，其随后用于与来自同一供体的cd8阳性t细胞共培养。在modc/cd8 t细胞共培养期间添加在crc hla-a11/cytof筛选中与hla-a11结合并鉴定的svp(lrr1、grina和znf670)(如图20所示)，以刺激针对这些svp的抗原特异性t细胞的扩增。抗原特异性cd8 t细胞使用经apc和pe标记的svp四聚体来检测，这两种荧光染料用于增强检测这些抗原特异性t细胞的特异性。仅在用modc刺激cd8 t细胞后才观察到抗原特异性t细胞(底部行)。相比之下，这些抗原特异性t细胞在未刺激的pbmc的cd8阳性t细胞中不存在。
[0091]
图27提供显示crc hla-a24四聚体/cytof筛选中鉴定的sva靶标的两个表：(a)在10名crc患者中检测到的hla-a24结合肽的总结。表中显示了具有id“1466”的患者中存在的抗原特异性cd8阳性t淋巴细胞的频率。还显示了导致这些sva的剪接事件的发生率、δpsi和类型；(b)序列坐标以及产生sva的肿瘤相关同等型的总结。这些坐标基于人类grch37/
hg19组装。
[0092]
图28是显示mzf1的可变剪接的示意图、图示和照片：(a)显示来自crc患者的正常和肿瘤样品中mzf1的psi值的点图；(b)显示来自crc患者的肿瘤以及正常样品中存在的mzf1剪接同等型的sashimi图。与正常样品相比，肿瘤样品显示增加的内含子保留。sashimi图显示患者样品的测序读段密度，对于一组正常样品和为异常值的一组肿瘤样品具有足够的接合点计数。(c)crc细胞系以及源自患者的活检材料中mzf1异常剪接的rt-pcr。显示mzf1肿瘤相关剪接变体表达增加的样品用星号表示。对应于肿瘤相关剪接变体的pcr条带由“ta”表示。
[0093]
图29是显示在一组31名患者中鉴定的hnsc肿瘤相关剪接改变的总结的图示和示意图：(a)在hnsc中发现的剪接改变类型的总结。具体地，发现有四(4)种不同类型的剪接事件被解调控；即：外显子跳跃/纳入(sie)；内含子保留(ire)；可变5'(a5e)和可变3'剪接位点(a3e)。这些事件大多数是外显子跳跃/纳入。显示了产生编码序列变化的剪接事件的数目；(b)柱状图显示在hnsc中鉴定的剪接事件的发生率和psi变化。表明了hnsc-ase的分布和剪接事件的类型；(c)显示了产生8-11个氨基酸长的肽的剪接事件的数目，这些肽能与hla等位基因如hla-a11、hla-a02和hla-a24(存在于25-50％的群体中)结合。
[0094]
图30是显示crc hla-a11/hla-a24四聚体/cytof筛选中鉴定的svp靶标的表(如实施例13和实施例21所述)，其也见于hnsc中存在的肿瘤相关剪接变体中。表中显示了在hnsc患者中导致这些sva的剪接事件的发生率、δpsi和类型。
[0095]
发明详述
[0096]
本发明的实施方案总体涉及鉴定由可变剪接事件产生的hla结合肽，其能够形成用于呈递至t淋巴细胞的肽-hla(phla)复合物。通过该方法的实施方案鉴定的肽可被称为剪接变体抗原。实施方案还涉及识别这类phla复合物的t淋巴细胞(本文中又称为抗原特异性t淋巴细胞)的鉴定。有利地，当前公开的实施方案鉴定在多于一名患有医学病况的患者之间共有的剪接变体抗原，而不是寻求鉴定患者特异性的抗原。
[0097]
使用诸如质谱流式细胞术的方法筛选抗原特异性t淋巴细胞变得非常简单，因为可能制备源自癌症患者的剪接变体抗原的单一文库，并寻找在患者亚组之间共有的抗原。此外，一旦已知患者之间共有的抗原，就有可能开发筛选测试来鉴定属于该亚组的患者，并使用抗原特异性t淋巴细胞开发合适的免疫疗法。然后可将这类免疫疗法施用于已确定该疗法在治疗特定癌症中可能有效的患者亚组。
[0098]
用于鉴定候选抗原的方法
[0099]
本文公开了鉴定一种或多种共有候选抗原以表征和/或治疗医学病况的方法，该方法包括：
[0100]
(i)从患有该医学病况的第一组患者中获得测试样品的转录组数据；
[0101]
(ii)获得一组参照样品的参照转录组数据；
[0102]
(iii)通过将转录组数据与参照转录组数据进行比较，确定与参照样品相比在测试样品的亚组的每个样品中转录更高的一种或多种剪接变体；
[0103]
(iv)对于每种所述共有剪接变体，确定存在于共有剪接变体的氨基酸翻译中而不存在于参照样品中转录的同一基因的相应剪接变体的氨基酸翻译中的一个或多个氨基酸序列；以及
[0104]
(v)预测一个或多个共有氨基酸序列或其部分的hla结合，以将一个或多个共有氨基酸序列鉴定为一个或多个共有候选抗原。
[0105]
候选抗原
[0106]
本文定义的方法可涉及鉴定一种或多种共有候选抗原以表征和/或治疗医学病况。
[0107]
如本文所用，术语“候选抗原”是指预测能够在动物中诱导免疫应答的多肽或预测编码能够在动物中诱导免疫应答的多肽的核酸(如，rna转录本或mrna)。候选抗原可使用各种技术如cytof进一步测试，其验证候选抗原为抗原(即，能够在动物中诱导免疫应答的多肽或核酸如rna转录本或mrna)或编码能够在动物中诱导免疫应答的多肽。
[0108]
在一些实施方案中，候选抗原是hla结合肽。在一些实施方案中，候选抗原是具有免疫原性的hla结合肽。
[0109]
在一些实施方案中，候选抗原是剪接变体或剪接变体抗原。剪接变体或剪接变体抗原可以是hla结合肽并且可以是免疫原性的。
[0110]
在一些实施方案中，候选抗原是多于一名患有医学病况的患者中共有的，并且定义患有该医学病况的患者的亚组。因此，候选抗原可被称为“共有候选抗原”。
[0111]
在一些实施方案中，本文定义的医学病况与一种或多种候选抗原的表达相关。
[0112]
如本文所用的术语“剪接变体”可指不同的mrna分子，其是来自从基因座转录的同一初始的前mrna序列差异剪接的结果，基于从初始的前mrna转录本序列的特定外显子或内含子序列的纳入或排除。基于由加工的mrna编码的氨基酸序列，各个分别的剪接变体可与特定多肽相关。
[0113]
术语“剪接变体”还可指由从基因座转录的mrna的剪接变体编码的多肽(又被称为同等型)。因此，单个基因座可编码多种蛋白质(或多肽)剪接变体(或同等型)。
[0114]
剪接变体可以是核酸(如，rna转录本或mrna)或多肽。术语剪接变体也可指剪接变体核酸或多肽的片段。
[0115]
如本文所用，术语“可变剪接事件”指通过可变剪接从同一基因或同一前mrna产生的两个多核苷酸之间存在的任何序列变异。该术语还指包含所述序列变异的多核苷酸，包括剪接同等型或其片段。所述序列变异可由插入或缺失至少一个外显子或外显子的一部分来表征。术语“可变剪接事件”还可包括跳跃外显子事件、互斥事件(或互斥外显子)、备选3’剪接位点、备选5’剪接位点、或内含子保留事件。
[0116]
术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用并且包括通过肽键或经修饰的肽键连接的任何氨基酸的聚合物(二肽或更多肽)。本发明的多肽可包含非肽组分，例如碳水化合物基团。碳水化合物和其他非肽取代基可由产生多肽的细胞添加到多肽中，并且会随细胞类型而变化。多肽在本文中根据其氨基酸主链结构进行定义；诸如碳水化合物基团的取代基通常不具体说明，但仍然可能存在。
[0117]
如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指mrna、rna、cdna或dna。该术语通常指聚合形式的长度至少为10个碱基的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一核苷酸类型的修饰形式)。该术语包括单链和双链形式的dna。
[0118]
癌症
[0119]
本文所指的医学病况可以是癌症。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中的
以下生理病况，其通常部分地以不受调控的细胞生长为特征。如本文所用，术语“癌症”是指非转移性和转移性癌症，包括早期和晚期癌症。“非转移性”是指保持在原发部位并且没有渗入淋巴或血管系统或原发部位以外的组织的癌症。术语“转移性癌症”是指已扩散或能够从身体的一个部位扩散到另一部位的癌症。一般地，非转移性癌症是0期、i期或ii期癌症偶尔也可以是iii期癌症的任何癌症。另一方面，转移性癌症通常是iv期癌症。
[0120]
术语“癌症”包括但不限于乳腺癌、大肠癌、肺癌、小细胞肺癌、胃(胃部)癌、肝癌、血癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头和/或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫肉瘤、卵巢癌、直肠或结肠直肠癌、肛门癌、结肠癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、外阴癌、鳞状细胞癌、阴道癌、霍奇金(hodgkin's)病，非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肿瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、cns肿瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、原发性cns淋巴瘤、骨髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、葡萄膜黑素瘤(又被称为眼内黑素瘤)、睾丸癌、口腔癌、咽癌或其组合。
[0121]
在一些实施方案中，癌症是胃癌、头和颈癌、结肠直肠癌或肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是胃癌或结肠直肠癌。
[0122]
在一些实施方案中，癌症是胃癌。在一些实施方案中，癌症是头和/或颈癌。在一些实施方案中，癌症是结肠直肠癌。在一些实施方案中，癌症是肝细胞癌。在一些实施方案中，癌症是乳腺癌。
[0123]
在一些实施方案中，癌症是以一种或多种共有抗原的表达为特征的癌症。癌症可见于身体的任何部位但由一种或多种共有抗原的表达定义。
[0124]
在一些实施方案中，癌症是转移性癌症。转移性癌症可见于身体的不同部位但以一种或多种共有抗原的表达为特征。
[0125]
在特定癌症类型(如，胃癌)中鉴定一种共有抗原可能有助于表征与同一共有抗原的表达相关的其他癌症类型(如，头和颈癌或结肠癌)。这可能有助于开发与共有抗原的表达相关的不同癌症类型的诊断测试或治疗。
[0126]
map/微管亲和性调节激酶3(mark3)
[0127]
在一些实施方案中，所述医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗该医学病况的共有候选抗原是mark3剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有mark3特异性癌症的癌症患者的亚组，其中mark3特异性癌症与mark3剪接变体的表达相关。该癌症可能位于身体的任何部位，但由mark3剪接变体的表达限定。
[0128]
在一些实施方案中，mark3剪接变体包含具有rnmsfrfik(seq id no:1)序列的肽，或编码具有rnmsfrfik(seq id no:1)序列的肽。
[0129]
在一些实施方案中，mark3剪接变体包含与seq id no:1具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与seq id no:1具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0130]
mark3剪接变体可包含实施例4的表1中所示的一个或多个外显子。
[0131]
在一些实施方案中，mark3剪接变体(核酸)包含外显子24。在一些实施方案中，mark3剪接变体包含外显子23、24、25和26。在一些实施方案中，mark3剪接变体包含外显子23、24和26。
[0132]
在一些实施方案中，本文公开的方法包括确定对应于mark3的同等型1的剪接变体(即，enst00000429436.2、enst00000335102.5或enst00000554627.1)的水平。
[0133]
在一些实施方案中，本文公开的方法包括确定对应于mark3的同等型3的剪接变体(即，enst00000440884.3)的水平。
[0134]
如本文所用，术语“分离的”是指“通过人工”从其自然状态改变；即，如果它存在于自然界中，已从其原始环境中改变或移出，或两者兼有。如本文所公开的mark3剪接变体可以是分离的mark3剪接变体。
[0135]
神经母细胞瘤断点家族成员9(nbpf9)
[0136]
在一些实施方案中，所述医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗该医学病况的共有候选抗原是nbpf9剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有nbpf9特异性癌症的癌症患者的亚组，其中nbpf9特异性癌症与nbpf9剪接变体的表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由nbpf9剪接变体的表达限定。
[0137]
nbpf9剪接变体可能是由于导致保留内含子(chr1:144826287:144826932: )的内含子保留事件，从而产生包含外显子(chr1:144826235:144827105: )的转录本。
[0138]
在一些实施方案中，nbpf9剪接变体包含具有ssfyaleek(seq id no:31)序列的肽，或编码具有ssfyaleek(seq id no:31)序列的肽。
[0139]
在一些实施方案中，nbpf9剪接变体包含与seq id no:31具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与seq id no:31具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0140]
如本文所公开的nbpf9剪接变体可以是分离的nbpf9剪接变体。
[0141]
par-3家族细胞极性调节因子(pard3)
[0142]
在一些实施方案中，所述医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗该医学病况的共有候选抗原是pard3剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有pard3特异性癌症的癌症患者的亚组，其中pard3特异性癌症与pard3剪接变体的表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由pard3剪接变体的表达限定。
[0143]
pard3剪接变体可能是由于备选的使用5'剪接位点而导致包含外显子(chr10:34625127:34625171:-和chr10:34626206:34626354:-)的转录本所致。
[0144]
在一些实施方案中，pard3剪接变体包含具有sqldfvktrk(seq id no:32)序列的肽，或编码具有sqldfvktrk(seq id no:32)序列的肽。
[0145]
在一些实施方案中，pard3剪接变体包含与seq id no:32具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与seq id no:32具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0146]
如本文所公开的pard3剪接变体可以是分离的pard3剪接变体。
[0147]
含锌指ccch型抗病毒蛋白1(zc3hav1)
[0148]
在一些实施方案中，所述医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗该医学病况的共有候选抗原是zc3hav1剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原用于表征和/或治疗患有zc3hav1特异性癌症的癌症患者的亚组，其中zc3hav1特异性癌症与zc3hav1剪接变体的表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由zc3hav1剪接变体的表达限定。
[0149]
zc3hav1剪接变体可能是由于备选的使用5'剪接位点而导致包含外显子(chr7:
138763298:138763399:-和chr7:138763850:138764989:-)的转录本所致。
[0150]
在一些实施方案中，zc3hav1剪接变体包含具有ltmavkaek(seq id no:33)序列的肽，或编码具有ltmavkaek(seq id no:33)序列的肽。
[0151]
在一些实施方案中，zc3hav1剪接变体包含与seq id no:33具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与seq id no:33具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0152]
如本文所公开的zc3hav1剪接变体可以是分离的zc3hav1剪接变体。
[0153]
yy1相关因子2(yaf2)
[0154]
在一些实施方案中，所述医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗该医学病况的共有候选抗原是yaf2剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有yaf2特异性癌症的癌症患者的亚组，其中yaf2特异性癌症与yaf2剪接变体的表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由yaf2剪接变体的表达限定。
[0155]
yaf2剪接变体可能是由于备选的使用3'剪接位点而导致包含外显子(chr12:42604350:42604421:-和chr12:42631401:42631526:-)的转录本所致。
[0156]
在一些实施方案中，yaf2剪接变体包含具有vivsasrtk(seq id no:34)序列的肽，或编码具有vivsasrtk(seq id no:34)序列的肽。
[0157]
在一些实施方案中，yaf2剪接变体包含与seq id no:34具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与seq id no:34具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0158]
如本文所公开的yaf2剪接变体可以是分离的yaf2剪接变体。
[0159]
钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶激酶1(camkk1)
[0160]
在一些实施方案中，所述医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗该医学病况的共有候选抗原是camkk1剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有camkk1特异性癌症的癌症患者的亚组，其中camkk1特异性癌症与camkk1剪接变体表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由camkk1剪接变体的表达限定。
[0161]
camkk1剪接变体可能由于导致外显子(chr17:3784921-3784942:-)跳跃的外显子跳跃/纳入事件所致，其产生了包含外显子(chr17:3785822-3785858:-和chr17:3783640-3783728:-)的转录本。
[0162]
在一些实施方案中，camkk1剪接变体包含具有vtspsrrsk(seq id no:35)序列的肽，或编码具有vtspsrrsk(seq id no:35)序列的肽。
[0163]
在一些实施方案中，camkk1剪接变体包含与seq id no:35具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与seq id no:35具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0164]
如本文所公开的camkk1剪接变体可以是分离的camkk1剪接变体。
[0165]
富含亮氨酸的重复蛋白1(lrr1)
[0166]
在一些实施方案中，医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗医学病况的共有候选抗原是lrr1剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有lrr1特异性癌症的癌症患者的亚组，其中lrr1特异性癌症与lrr1剪接变体表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由lrr1剪接变体表达限定。
[0167]
lrr1剪接变体可能由于导致外显子(chr14:50074118-50074839: (seq id no:42))跳跃的外显子跳跃/纳入事件所示，其产生了包含外显子(chr14:50069088-50069186: 和chr14:50080974-50081389: )的转录本。
[0168]
在一些实施方案中，lrr1剪接变体包含具有slprfgyrk(seq id no:36)序列的肽，或编码具有slprfgyrk(seq id no:36)序列的肽。
[0169]
在一些实施方案中，lrr1剪接变体包含与slprfgyrk(seq id no:36)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与slprfgyrk(seq id no:36)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0170]
在一些实施方案中，lrr1剪接变体包含具有syhsipslprf(seq id no:51)序列的肽，或编码具有syhsipslprf(seq id no:51)序列的肽。
[0171]
在一些实施方案中，lrr1剪接变体包含与syhsipslprf(seq id no:51)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与syhsipslprf(seq id no:51)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0172]
如本文所公开的lrr1剪接变体可以是分离的lrr1剪接变体。
[0173]
锌指蛋白670(znf670)
[0174]
在一些实施方案中，医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗医学病况的共有候选抗原是znf670剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有znf670特异性癌症的癌症患者的亚组，其中znf670特异性癌症与znf670剪接变体表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由znf670剪接变体表达限定。
[0175]
znf670剪接变体可能由于导致外显子(chr1:247130997-247131094:-(seq id no:45))跳跃的外显子跳跃/纳入事件所致，其产生了包含外显子(chr1:247151423-247151557:-和chr1:247108849-247109129:-)的转录本。
[0176]
在一些实施方案中，znf670剪接变体包含具有scvspsselk(seq id no:37)序列的肽，或编码具有scvspsselk(seq id no:37)序列的肽。
[0177]
在一些实施方案中，znf670剪接变体包含与scvspsselk(seq id no:37)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与scvspsselk(seq id no:37)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0178]
如本文所公开的znf670剪接变体可以是分离的znf670剪接变体。
[0179]
谷氨酸亲离子受体nmda型亚基相关蛋白1(grina)
[0180]
在一些实施方案中，医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗医学病况的共有候选抗原是grina剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有grina特异性癌症的癌症患者的亚组，其中grina特异性癌症与grina剪接变体表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由grina剪接变体表达限定。
[0181]
grina剪接变体可能是由于导致去除内含子(chr8:145065973:145066412: )的内含子保留事件，其产生不包含内含子(chr8:145065860-145065972: @chr8:145066413-145066541： )的转录本。
[0182]
在一些实施方案中，grina剪接变体包含具有sirqafirk(seq id no:38)序列的肽，或编码具有sirqafirk(seq id no:38)序列的肽。
[0183]
在一些实施方案中，grina剪接变体包含与sirqafirk(seq id no:38)具有至少
80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与sirqafirk(seq id no:38)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0184]
如本文所公开的grina剪接变体可以是分离的grina剪接变体。
[0185]
髓系锌指1(mzf1)
[0186]
在一些实施方案中，医学病况是癌症并且经鉴定用于表征和/或治疗医学病况的共有候选抗原是mzf1剪接变体。换言之，可鉴定共有候选抗原以表征和/或治疗患有mzf1特异性癌症的癌症患者的亚组，其中mzf1特异性癌症与mzf1剪接变体表达相关。癌症可能位于身体的任何位置，但由mzf1剪接变体表达限定。
[0187]
mzf1剪接变体可能是由于导致保留内含子(chr19:59,081,895-59,082,360:-)的内含子保留事件所致，其产生包含内含子保留事件(chr19:59081711-59082796:-)的转录本。
[0188]
在一些实施方案中，mzf1剪接变体包含具有kwppatetl(seq id no:52)序列的肽，或编码具有kwppatetl(seq id no:52)序列的肽。
[0189]
在一些实施方案中，mzf1剪接变体包含与kwppatetl(seq id no:52)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽，或编码与kwppatetl(seq id no:52)具有至少80％(或至少88％)序列同一性的肽。
[0190]
如本文所公开的mzf1剪接变体可以是分离的mzf1剪接变体。
[0191]
参照
[0192]
如本文所指的“参照”可以是取自患有医学病况的受试者的不受该医学病况影响的一个或多个样品(如，非癌细胞)，或者取自另一受试者(例如未患有该医学病况的健康受试者)的一个或多个样品。参照也可以是预定值或样品测量(例如样品中转录本的表达水平)的平均值。
[0193]
样品
[0194]
如本文所用，术语“样品”(或“测试样品”)包括从受试者分离的组织、细胞、体液及其分离物等以及存在于受试者中(即，样品在体内)的组织、细胞和体液等。样品的示例包括：全血、血液(如，血清和血浆)、淋巴液和囊液、痰、粪便、眼泪、粘液、毛发、皮肤、腹水、囊液、尿、乳头渗出物、乳头抽吸物、组织切片(如，活检和尸检样品)、用于组织学目的的冷冻切片、存档样品、外植体和源自患者组织的原代和/或转化细胞培养物等。
[0195]
样品可在一个或多个时间点获得。剪接变体表达水平可任选地与参照进行比较。参照可以是源自未患有医学病况的人的对照样品。可使用一个或多个对照样品。
[0196]
现在参考图1(a)，鉴定用于表征和/或治疗医学病况的一个或多个共有候选抗原的方法100包括从患有该医学病况的第一组患者获得测试样品的转录组数据的步骤102。通常，方法100至少部分地并且在一些实施方案中完全地由一个或多个计算设备的至少一个处理器执行。
[0197]
在某些实施方案中，可根据一个或多个临床参数选择第一组患者。例如，一个或多个临床参数可包括与医学病况(如，疾病亚型，例如肿瘤类型或疾病进展状态)或hla亚型相关的参数。
[0198]
例如，转录组数据可以是测序数据，如全转录组鸟枪法测序(wtss)数据(又被称为rna-seq数据)。某些实施方案将参考wtss数据进行描述，但应理解，可将其他形式的转录组
数据用于该方法的其他实施方案，例如来自测量平台如外显子微阵列、剪接-接合点微阵列或嵌合阵列的探针水平或探针组数据。
[0199]
转录组数据可通过对来自第一组患者的样品进行测序，或通过检索(retrieve)先前从第一组患者产生的转录组数据来获得。例如，转录组数据可存储在计算机可读介质上并经由局部总线或数据通道检索。
[0200]
转录组数据可以是原始序列读段或可由对原始序列读段执行的至少一种操作产生的数据。例如，至少一种操作可包括去除低质量读段的预处理操作。至少一种操作还可包括将序列读段与一个或多个参考序列(如，参考基因组)比对。例如，如图2的工作流程所示，序列读段可使用序列比对器例如star(a.dobin等人(2013)bioinformatics 29,pages 15-21)或bowtie(b.langmead等人(2009)genome biology 10:r25)或任何类似的序列比对工具进行比对。例如，序列比对可以以诸如sam或bam的文件格式输出。
[0201]
在一些实施方案中，序列读段可与剪接-接合点序列比对。剪接-接合点序列可基于已知或预测的外显子-内含子边界获得，和/或可通过与参考基因组的剪接比对来确定。
[0202]
方法100还包括获得一组参照样品的参照转录组数据的步骤104。例如，参照样品可以是取自患有该医学病况的患者的不受该医学病况影响的一个或多个样品(如，非癌性、正常、健康细胞)，或取自未患该医学病况的一个或多个其他受试者的一个或多个样品。
[0203]
对于测试样品的转录组数据，转录组数据可通过对参照样品进行测序或通过检索之前从参照样品中产生的转录组数据来获得。对参照样品的转录组数据执行的预处理操作(包括质量控制和序列读段比对)可与对测试样品的转录组数据执行的类似。
[0204]
在一些实施方案中，步骤102和/或步骤104中的转录组数据可从数据库或预先存在的数据集中获得。这些包括，例如公开可用的数据库如gtex、tcga等。
[0205]
方法100还包括通过将转录组数据与参照转录组数据进行比较确定在测试样品和参照样品之间存在差异剪接的一种或多种第一剪接变体的步骤106。这可通过确定与参照样品相比在测试样品亚组的各个样品中一种或多种剪接变体是否转录更高来完成。
[0206]
例如，如图2的工作流程所示，可使用诸如miso(y.katz等人(2010)nature methods 7(12),pages1009-1015)或rmats(s.shen等人(2014)proc nat acad sci 111(51)e5593-e5601)的工具来进行差异剪接分析，尽管会理解可使用许多其他工具来确定差异剪接。
[0207]
目前使用rna-seq的差异剪接分析利用测序读段密度来确定细胞中表达或使用的同等型(同等型水平)、外显子(外显子水平)或剪接点(剪接点水平)。在同等型水平上，将映射到一个基因的所有测序读段都用于确定细胞中表达的同等型的外显子组成。然后可将其与参照进行比较以确定肿瘤和正常样品之间的差异表达。这可能是极具挑战性的，因为每个基因可能有多种同等型，并且不同同等型可能在各细胞中同时表达。在外显子水平，剪接分析可能涉及确定是否纳入或跳跃了特定序列(内含子[ire]、外显子[sie、mxe)或外显子的部分[a5e、a3e])。这使用外显子及其相应接合点周围的测序读段密度来确定是否存在纳入或排除。差异剪接分析通过肿瘤和正常样品之间的比较来完成。在接合点水平，剪接分析可能涉及确定序列如何连接在一起。仅考虑映射到剪接点的测序读段。然后可将其与参照进行比较以确定肿瘤和正常样品之间剪接点的差异使用。
[0208]
本文公开的方法中的差异剪接分析在外显子水平进行，其中差异剪接分析可包括
从映射到剪接变体外显子的序列读段的密度来确定每个剪接变体的“剪接纳入百分比(percentage spliced in)”(psi或ψ)评分。
[0209]
例如，在包含额外外显子的剪接变体的情况下，psi可使用来评估剪接变体，其中ir是纳入读段(映射到额外外显子以及带有邻近外显子的映射到其剪接点的读段)的数目，并且er是排除读段(映射到邻近外显子之间的剪接点的读段)的数目。ir和er可根据本领域已知的方法进行标准化。这对测试样品和参照样品都进行，并且差异剪接可通过例如计算两个ψ值之间的差异∧ψ并将差异与阈值进行比较，和/或通过使用另一种技术例如计算贝叶斯(bayes)因子(如，使用miso中的savage-dickey密度比)并将贝叶斯因子与阈值进行比较来确定。在一些实施方案中，如果|δψ|超过阈值并且贝叶斯因子超过另一个阈值，例如|δψ|＞0.2且贝叶斯因子大于20，则剪接变体可被称为是差异剪接的。
[0210]
在一些实施方案中，不使用psi评分，可确定差异剪接的替代度量例如“剪接掉百分比(percent spliced out)”评分。例如，可根据(1-ψ)＝er/(ir er)确定剪接掉百分比评分。
[0211]
在一些实施方案中，可将一个或多个另外的过滤操作108应用于称为被差异剪接的剪接变体的组。例如，质量控制操作可通过检查映射到参考序列的读段并且去除不满足预定标准的任何剪接变体的sashimi图(https://www.biorxiv.org/content/10.1101/002576v1)来进行。
[0212]
例如，质量控制操作可包括分析测试样品(如，肿瘤样品)中剪接事件的psi分布来鉴定差异剪接事件。还可进一步检查任何此类差异剪接事件来确定它是否是例如外显子跳跃或纳入事件。
[0213]
通常，来自不受医学病况影响的样品的剪接事件将具有相对狭窄的psi分布。由于肿瘤样品的异质性，来自肿瘤样品的剪接事件也可能具有与参照(正常)样品相似的psi值，但肿瘤样品可能还另外具有与参照样品中的那些不同的剪接事件。因此，在癌症的情况下，可分析肿瘤样品以核对它们是否具有与参照样品不同的psi值。这些被称为“异常值”(图3)。
[0214]
比较所有样品(测试/肿瘤和参照/正常两者)的psi值分布。剪接事件基于两个标准来选择：1)具有与正常样品不同的psi值的肿瘤样品，和2)足够数目的肿瘤样品显示与正常患者不同的剪接，例如外显子跳跃或纳入事件。最后一个标准允许鉴定共有的肿瘤相关剪接事件。
[0215]
在一个示例中，作为过滤操作108的一部分，可将sashimi图用于检查映射到接合点的测序读段(图4)。例如，在存在备选使用位于转录本中间的外显子(两个接合点用于外显子纳入，一个接合点用于跳跃的外显子)的情况下，对于rna-seq数据，预计两个接合点具有相似的计数。如果外显子纳入中只有一个接合点的计数非常偏差，则剪接事件是否真的发生是值得怀疑的。在某些实施方案中，过滤操作108可包括需要在剪接点处计数的阈值数目(如，多于五个计数)以确信在剪接方面存在差异。
[0216]
在另一个示例中，过滤操作可包括选择相比参照样品在测试样品中更频繁存在的剪接变体。在另一个示例中，过滤操作可包括选择以测试样品的至少阈值数目(如，至少2个、至少3个、至少4个或至少5个)或至少阈值比例(如，测试样品的至少1％、至少2％、至少
5％、至少10％、至少15％、或至少20％)发现的剪接变体。这意味着剪接变体是测试样品亚组中共有的。在又一个示例中，过滤操作可包括选择在测试样品中发现但在参照样品中不存在的剪接变体。
[0217]
在一些实施方案中，亚组包括多于阈值数目或多于阈值百分比的测试样品。
[0218]
在一些实施方案中，过滤操作108可包括鉴定经历阅读框变化的剪接变体。有利地，这类剪接变体呈递新的蛋白质序列和/或产生更长的编码序列，并因此导致更多数目的候选肽。
[0219]
在一些实施方案中，方法还包括在步骤(iv)之前，针对各个所述剪接变体确定第一剪接变体相对于同一基因的一个或多个相应剪接变体在阅读框中是否存在变化。
[0220]
方法100包括针对各个剪接变体确定存在于剪接变体的氨基酸翻译中但不存在于参照样品中转录的同一基因的相应剪接变体的氨基酸翻译中的一个或多个氨基酸序列的步骤110。
[0221]
在一些实施方案中，步骤(iv)包括确定剪接变体和同一基因的相应剪接变体之间的非重叠核苷酸序列。
[0222]
这些序列代表潜在候选抗原区，其可用于确定它们是否包含hla结合肽。
[0223]
图5显示不同类型的可变剪接事件的候选抗原区的示例。不同类型的候选抗原区可根据是否发生移框来生成。在图5的每个示例中，下划线部分组成潜在的候选抗原区。
[0224]
例如，对于没有移框的外显子跳跃事件(如图5(a)所示)，候选抗原区可包括跨越侧翼外显子之间接合点(接合点的任一侧)的序列(表示为两个外显子的下划线部分的部分)。另一方面，如果外显子跳跃事件导致移框(如图5(a')所示)，则候选抗原区可包括覆盖整个3'侧翼外显子的另外的序列。
[0225]
在另一个示例中，如图5(i)所示，可变剪接事件可能是存在备选3’剪接位点，并且在没有移框的情况下，候选抗原区跨越各个外显子的部分，具有跨越由于备选3’剪接位点而转录的额外序列的另外的部分。例如，如果如图5(i')所示出现移框，则候选抗原区可能跨越整个3'外显子。
[0226]
因此，可以看出，选择导致移框的可变剪接事件是有利的，因为这些呈递新的蛋白质序列和/或可能产生更长的候选抗原区，伴随有更大的机会定位患者亚组中共有的潜在hla结合肽。
[0227]
用于确定剪接事件是否导致可能产生潜在抗原区的改变的氨基酸序列的方法在图6(a)中示意性地显示。步骤110可包括：
[0228]
确定剪接事件是编码还是非编码；
[0229]
确定外显子1的开放阅读框(这可包括，例如确定是否有起始密码子)；
[0230]
翻译并确定框是否有任何变化(这适用于ire、sie、mxe、a5e和a3e剪接事件中的每一个)；以及
[0231]
比较剪接同等型并确定潜在的候选抗原区。
[0232]
潜在的候选抗原区由剪接事件的侧翼区组成，并且可包括序列的纳入(如，在sie事件中包含中间外显子)。对于各个剪接事件，有两个侧翼区，n末端和c末端。侧翼区的长度受预测的hla结合肽长度的影响。侧翼区的最大长度是hla结合肽的长度减去1。此外，如果剪接改变导致翻译框变化，则c末端侧翼区可包含外显子的整个序列。用于确定剪接事件的
潜在候选抗原区的氨基酸序列的方法如图6(b)所示。
[0233]
如图6(b)所示，对于各个剪接事件，比较剪接同等型并确定潜在候选抗原区的方法可包括：
[0234]
确定侧翼区的氨基酸组成；
[0235]
确定剪接事件是否导致序列的纳入并将这些氨基酸序列包含到潜在候选抗原区中；以及
[0236]
将所有这些氨基酸序列连接在一起以获得潜在候选抗原区。
[0237]
方法100的步骤112可包括使用结合预测工具如netmhcpan(v.jurtz等人(2017)j immunol 199(9):3360-3368)，从候选抗原区的氨基酸翻译预测一种或多种候选hla结合肽。肽hla结合的netmhcpan预测基于这样的算法，其通过比较未知肽的序列与实验确定的与hla结合的肽，对未知肽的预测的亲和力进行排序。netmhcpan的示例性参数和截留值如下：8-11个氨基酸肽用于预测hla结合；以及与hla的高亲和力结合(基于前0.5％的排序)。
[0238]
在一些实施方案中，方法100可包括过滤掉彼此相似的肽以减少候选肽组中的冗余的步骤114。
[0239]
例如，如果hla的基序是：9aa肽的第7位处arg锚定残基，则可能存在长度为8-11aa的肽且其可全部结合该hla分子并且它们会具有不同的结合亲和力的情况。肽的过滤可通过检查这些“相关”肽(蛋白质的相似区域)并保留具有最高预测结合亲和力的肽来完成。
[0240]
在步骤116中，将过滤操作114后剩余的候选抗原(hla结合肽)输出。例如，候选抗原列表可作为文本文件或类似格式输出。在一些实施方案中，步骤116可包括基于它们在hla分子上的预测呈递排序所有剩余的肽，并使用该排序来选择待用于鉴定抗原特异性t淋巴细胞的一组候选抗原。
[0241]
本文定义的方法可包括验证或测试一种或多种共有氨基酸序列的hla结合以将一种或多种共有氨基酸序列鉴定为共有候选抗原。本文定义的方法可包括验证或测试预测的hla-结合肽是否能结合hla分子或结合至hla分子的步骤。这可使用hla-肽结合测定或hla肽洗脱实验来完成。这类测定是本领域技术人员所熟知的。
[0242]
本文定义的方法可包括通过验证或测试预测的hla结合肽是否与t淋巴细胞结合来确定共有抗原的免疫原性的进一步步骤。这可通过以下来完成：1)鉴定特异性结合一种或多种被预测为结合hla的共有候选抗原的t淋巴细胞，2)t淋巴细胞的功能表征，例如检测ifn-γ分泌。这类测定是本领域技术人员所熟知的并且提供了预测的hla-结合肽是免疫原性的且可被t淋巴细胞识别的验证。这样的进一步测试可帮助将一个或多个共有候选抗原鉴定为共有抗原。
[0243]
抗原特异性t淋巴细胞和共有抗原-t淋巴细胞对
[0244]
本文公开了鉴定共有抗原-t淋巴细胞对的方法，该方法包括：
[0245]
a)根据本文定义的方法鉴定共有候选抗原；提供一种或多种各自标记的生物分子，其包含标记物和含有共有候选抗原的肽；
[0246]
b)将一种或多种标记的生物分子与一个或多个含有来自患有医学病况的患者的外周血的样品接触；以及
[0247]
c)从一个或多个样品中鉴定与所述标记的生物分子结合的t淋巴细胞，从而鉴定共有抗原-t淋巴细胞对。
[0248]
共有抗原-t淋巴细胞对的鉴定将共有候选抗原鉴定为共有抗原。
[0249]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对。
[0250]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是mark3剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有mark3抗原结合。
[0251]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是nbpf9剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有nbpf9抗原结合。
[0252]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是pard3剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有pard3抗原结合。
[0253]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是zc3hav1剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有zc3hav1抗原结合。
[0254]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是yaf2剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有yaf2抗原结合。
[0255]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是camkk1剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有camkk1抗原结合。
[0256]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是lrr1剪接变体，hla亚型是hla-a11或hla-a24，并且t淋巴细胞与共有lrr1抗原结合。
[0257]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是znf670剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有znf670抗原结合。
[0258]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是grina剪接变体，hla亚型是hla-a11，并且t淋巴细胞与共有grina抗原结合。
[0259]
本文提供了根据本文定义的方法鉴定的共有抗原-t淋巴细胞对，其中共有抗原是mzf1剪接变体，hla亚型是hla-a24，并且t淋巴细胞与共有mzf1抗原结合。
[0260]
本文公开了鉴定与本文鉴定的一个或多个共有候选抗原特异性结合的t淋巴细胞的方法，该方法包括：
[0261]
(a)提供一种或多种各自标记的生物分子，其包含标记物和各自的候选抗原；
[0262]
(b)将一种或多种标记的生物分子与一个或多个含有来自分别的患有该医学病况的患者的外周血的样品接触；以及
[0263]
(c)从一个或多个样品中鉴定与所述标记的生物分子结合的t淋巴细胞。
[0264]
现在参考图1(b)，描述用于鉴定抗原特异性t淋巴细胞的方法150。应当理解，一旦获得来自第一组患者的转录组数据和参照转录组数据，以上参考图1(a)描述的抗原鉴定方法就基本上完全是在计算机上进行的过程。另一方面，图1(b)的方法150是体外过程，其利用计算机进程100的输出来鉴定第二组患者中的抗原特异性t淋巴细胞。
[0265]
在方法150的步骤152中，可提供一种或多种各自标记的生物分子，每个包括标记物和各自的候选抗原。在一些实施方案中，标记的生物分子可包含例如一种或多种hla多聚体。通常，hla多聚体可以是二聚体直至十聚体。该标记物允许与生物分子结合的t淋巴细胞被鉴定和/或分离(如，通过已知的流式细胞术技术，例如facs)。
[0266]
本文提供了鉴定和表征与根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有候选抗原特异性结合的t淋巴细胞的方法，该方法包括：
[0267]
(a)提供一种或多种各自标记的生物分子，其包含标记物和各自的共有候选抗原；
[0268]
(b)将一种或多种标记的生物分子与一个或多个含有来自分别的患有医学病况的第二组患者的外周血的样品接触；
[0269]
(c)从一个或多个样品中分离与t淋巴细胞结合的标记的生物分子；
[0270]
(d)确定每个共有抗原-t淋巴细胞对的出现频率并将对分配到患者亚组；
[0271]
(e)通过从含有外周血细胞的样品扩增t淋巴细胞级分来分离共有抗原定向的t淋巴细胞；以及
[0272]
(f)证明共有抗原定向的t淋巴细胞能够识别和杀死包含在第一组患者中鉴定的共有剪接变体转录本的肿瘤细胞。
[0273]
在一些实施方案中，扩增的t淋巴细胞级分分离自含有来源自第一组、第二组或任何组患者的外周血细胞的样品。
[0274]
本文提供了标记的生物分子，其包含与候选抗原肽结合的hla分子。hla分子可被生物素化并与链霉亲和素分子结合。在一些实施方案中，标记的生物分子包含与一个链霉亲和素分子结合的四个生物素化hla分子。
[0275]
标签(或标记物)是允许使用本领域技术人员熟知的一系列不同检测方法进行检测的部分。不同的检测方法可使用不同的标签部分；例如，标签可包括荧光团、dna条形码或重金属。在一些实施方案中，标签可包含此类部分的单个单元。在一些实施方案中，标记可以是荧光团或重金属的多个单元的组合。在另一个实施方案中，标记可以是荧光团、dna条形码和重金属的组合。
[0276]
在优选实施方案中，标签是重金属条形码，其由不同重金属例如具有不同原子量的镧系元素的组合组成。标签允许通过诸如cytof仪器的装置检测与t淋巴细胞结合的标记的生物分子。
[0277]
cytof(或质谱流式细胞术)利用飞行时间质谱仪检测带金属标签的抗体或hla多聚体。使用这种技术进行hla多聚体染色的主要优点是能够通过使用重金属条形码同时检测有限样品中的多个事件。
[0278]
在一些实施方案中，提供了用于检测特异性结合共有抗原的t淋巴细胞的标记的生物分子，所述标记的生物分子包含与本文定义的共有抗原结合的hla分子。
[0279]
在一些实施方案中，提供了本文定义的标记的生物分子，其中共有抗原是与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽的核酸，并且其中hla是hla-a11。
[0280]
提供标记的生物分子的文库是有利的，其中每一个都包含候选抗原之一。为此，各个标记的生物分子的标记物可包括条形码，例如重金属条形码，其用于唯一地鉴定相应标记的生物分子。因此，在步骤154中包含文库的样品可与pbmc接触，从而可在单个步骤中有效地筛选所有候选抗原的结合。
[0281]
步骤154中与标记的生物分子接触的pbmc有利地获自患有医学病况的患者，这些患者不是获得转录组数据(用于候选抗原鉴定方法100)的第一组患者的一部分。通过使用独立的患者组用于t淋巴细胞筛选过程150，可更大确信所鉴定的t淋巴细胞与确实共有的候选抗原结合。
[0282]
步骤156中，该方法包括鉴定与t淋巴细胞结合的标记的生物分子。这些与一种或多种标记的生物分子结合的t淋巴细胞可包含对一种或多种特定剪接变体抗原特异的一个
或多个t淋巴细胞亚组。
[0283]
在一个具体示例中，如图7示意性所示，方法150可包括外周血的hla四聚体染色，包括通过细菌表达和纯化负载有uv可切割肽的生物素标记的hla来制备hla四聚体。然后各个共有候选抗原通过uv介导的肽交换加载到hla分子上。添加带重金属条形码的链霉亲和素导致形成包含共有候选抗原的四聚体。来自患有医学病况的一组或多组患者的外周血(如，pbmc)用hla四聚体的池进行染色，然后使用cytof完成分析。
[0284]
步骤156中，该方法可进一步包括对由标记的生物分子鉴定的抗原特异性t淋巴细胞进行免疫分析(immune-profiling)。将标记的抗体用于显示这些t淋巴细胞的表型。例如，如果t淋巴细胞与针对耗竭标志物(如，pd1)的标记的抗体结合，则意味着t淋巴细胞先前已被抗原激活并长期刺激直到它们耗竭。
[0285]
在一些实施方案中，鉴定显示与t淋巴细胞相似的免疫表型的抗原特异性t淋巴细胞可能是有利的，所述t淋巴细胞对通常遇到的病毒抗原如cmv、flu或ebv是特异性的。在大多数人中，这些病毒特异性t淋巴细胞提供免受这些病原体的保护。例如，这些病毒抗原特异性t淋巴细胞经常显示中枢记忆表型，这种表型允许细胞再次遇到病毒抗原时迅速扩增至大量。发现显示与病毒特异性t淋巴细胞相似的免疫表型的抗原特异性t淋巴细胞可能表明抗原特异性t淋巴细胞具有根除表达其同类抗原的肿瘤的活性。此外，这将允许使这些抗原特异性t淋巴细胞优先。
[0286]
步骤156中，该方法还可包括分离这些由标记的生物分子鉴定的抗原特异性t淋巴细胞，为的是鉴定识别共有剪接变体抗原的tcr。
[0287]
步骤152可涉及提供包含单个候选抗原的单标记的生物分子，然后可在该方法的步骤154中将标记的生物分子的样品与来自一个或多个患有医学病况的患者的外周血单核细胞(pbmc)接触，为的是检测癌症患者中该抗原的存在。如果存在，患者可能对靶向所述抗原的免疫疗法有应答。
[0288]
该方法可进一步包括测试t淋巴细胞的生物学功能。该方法可包括在体外测定中测试t淋巴细胞的生物学功能。这类测定是本领域技术人员熟知的并且可包括测试t淋巴细胞对与一种或多种候选抗原表达相关的细胞的细胞杀伤活性。
[0289]
在一些实施方案中，该方法包括表征t淋巴细胞以确定它们是否具有细胞毒性和/或测试共有候选抗原是否具有免疫原性。
[0290]
在一些实施方案中，该方法可进一步包括测试候选抗原和鉴定为与候选抗原结合的t淋巴细胞的生物学功能。用于测试t淋巴细胞的生物学功能的测定是本领域技术人员所熟知的并且可包括elispot测定和/或细胞杀伤测定。这提供了额外的验证：1)抗原呈递在靶细胞(如，癌细胞)的表面；2)t淋巴细胞能识别和靶向抗原；或3)靶向该抗原的t淋巴细胞是功能性的，例如通过执行帮助根除癌细胞的功能。
[0291]
如本文定义的方法可包括验证hla结合肽在患有医学病况的两个不同患者组中的共有性质的进一步步骤。患有医学病况的第一组患者是“发现组”，用于鉴定候选抗原。患有医学病况的第二组患者是“验证组”，用于验证或测试预测的hla结合肽是否与t淋巴细胞结合。这是有利的，因为可更大确信所鉴定的抗原确实是共有的。
[0292]
用于鉴定候选抗原的系统
[0293]
参考图8，用于鉴定共有候选抗原的系统400的一个实施方案包括抗原预测设备
410。系统400还可包括一个或多个测序平台420、422、424，它们经由网络418与抗原预测设备410进行通信。
[0294]
抗原预测设备410适合于至少部分地执行方法100，并且具体地，可经由网络418从一个或多个测序平台420、422、424和/或从一个或多个计算机可读介质获得转录组数据并进行分析，以生成一种或多种候选hla结合肽的预测。
[0295]
图9示出能够执行系统400的抗原预测设备的示例计算设备410。在一些实施方案中，可将多个计算设备410看作是单个应用服务器。
[0296]
计算设备410的组件可以多种方式配置。组件可完全由待在标准计算机服务器硬件上执行的软件来实现，标准计算机服务器硬件可包括一个硬件单元或分布在不同位置的不同计算机硬件单元，它们可通过网络进行通信。一些组件或其部分也可通过专用集成电路(asic)或现场可编程门阵列来实现。
[0297]
在图9所示的示例中，计算设备410是基于32位或64位intel架构的商用服务器计算机系统，由计算设备410实施或执行的进程和/或方法以存储于与计算设备410相关联的非易失性(如，硬盘)计算机可读存储器524上的一个或多个软件组件或模块522的程序指令的形式来实现。软件模块522的至少部分可备选地作为一个或多个专用硬件组件，例如专用集成电路(asic)和/或现场可编程门阵列(fpga)来实现。
[0298]
计算设备410包括至少一个或多个以下标准的商用计算机组件，所有这些都通过总线535互连：
[0299]
(a)随机存取存储器(ram)526；
[0300]
(b)至少一个计算机处理器528，和
[0301]
(c)外部计算机接口530：
[0302]
(i)通用串行总线(usb)接口530a(其中至少一个连接到一个或多个用户界面设备，例如键盘、定点设备(如，鼠标532或触摸板)，
[0303]
(ii)网络接口连接器(nic)530b，其将计算机设备410连接到数据通信网络和/或外部设备；和
[0304]
(iii)显示适配器530c，其连接到显示设备534，如液晶显示器(lcd)面板设备。
[0305]
计算设备410包括多个标准软件模块，包括：
[0306]
(a)操作系统(os)536(如，linux或microsoft windows)；和
[0307]
(b)结构化查询语言(sql)模块542(如，mysql，可获自http://www.mysql.com)，其允许数据(如，输入的转录组数据和/或输出的候选hla结合肽)存储于sql数据库516并从其检索/访问。
[0308]
有利地，数据库516形成计算机可读数据存储器524的一部分。可选择地，数据库516位于远离图8所示的服务器410的位置。
[0309]
软件模块522中的模块和组件之间的边界是示例性的，替代实施方案可合并模块或对模块功能施加备选的分解。例如，本文讨论的模块可分解为待作为多个计算机进程执行的子模块，并且任选地在多台计算机上执行。此外，备选的实施方案可组合特定模块或子模块的多个实体。此外，根据本发明，可组合操作或可将操作的功能分布在额外的操作中。备选地，这类行为可体现在执行此类功能的电路结构中，例如复杂指令集计算机(cisc)的微代码、编程成可编程或可擦除/可编程设备的固件、现场可编程门阵列(fpga)的配置、门
阵列或全定制专用集成电路(asic)的设计等。
[0310]
由抗原预测设备410执行的过程100的流程图的每个块可由(软件模块522的)模块或模块的一部分来执行。该过程可体现在用于配置计算机系统以执行该方法的非瞬态机器可读和/或计算机可读介质中。软件模块可存储于计算机系统存储器内和/或传输到计算机系统存储器以配置执行模块功能的计算机系统。
[0311]
例如，如图9所示，模块522可包括：
[0312]
·
差异剪接模块412，其实施一个或多个差异剪接算法以鉴定在测试样品和参照样品之间差异剪接的一组剪接变体(如，miso412a和/或rmats 412b)；
[0313]
·
序列鉴定模块414，对于组中的各个剪接变体，其确定该剪接变体和同一基因的相应的第二剪接变体之间的非重叠序列；和
[0314]
·
肽结合模块416，其从非重叠序列的一个或多个氨基酸翻译预测(如，使用netmhcpan或另一类似预测方法)一个或多个候选hla结合肽。
[0315]
计算设备410通常根据程序(内部存储的指令列表，如特定应用程序和/或操作系统)处理信息，并经由输入/输出(i/o)设备530产生结果的输出信息。计算机进程通常包括执行中(运行中)的程序或程序的一部分、当前程序值和状态信息，以及由操作系统使用的资源以管理进程的执行。父进程可能会产生其他子进程，以帮助执行父进程的整体功能。
[0316]
由于父进程特定地产生子进程以执行父进程的整体功能的一部分，有时可将子进程(和子孙进程等)执行的功能描述为由父进程执行。
[0317]
表征和/或治疗的方法
[0318]
本文公开了表征受试者中的医学病况的方法，该方法包括确定根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的水平(或存在)，其中与参照相比增加的一种或多种共有抗原水平将医学病况表征为与所述一种或多种共有抗原表达相关的医学病况。
[0319]
术语“与参照相比增加的一种或多种共有抗原水平”可指与参照相比，一种或多种共有抗原增加至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％或至少200％或更多。
[0320]
在一些实施方案中，一种或多种共有抗原与hla分子结合并呈递在一个或多个细胞的表面。受试者可用识别一种或多种共有抗原的合适免疫疗法进一步治疗。
[0321]
本文公开了表征受试者中的医学病况的方法，该方法包括确定根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的水平(或存在)，其中与参照相比一种或多种共有抗原水平增加(或一种或多种共有抗原的存在)将医学病况表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的医学病况。
[0322]
合适的免疫疗法包括，例如，自体细胞疗法；基于t细胞受体的疗法；基于抗体的疗法和免疫调节化合物，例如疫苗。
[0323]
在一些实施方案中，医学病况是癌症。
[0324]
本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括(a)确定根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的水平(或存在)，其中与参照相比一种或多种抗原水平增加(或一种或多种共有抗原的存在)将医学病况表征为与一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况，并且(b)治疗发现患有与所述一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况的受试者。
[0325]
本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括(a)确定根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的水平，其中与参照相比一种或多种共有抗原水平增加(或一种或多种共有抗原的存在)将医学病况表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的医学病况，并且(b)治疗发现患有可能对合适的免疫疗法治疗有应答的医学病况的受试者。
[0326]
检测样品中共有抗原(如，hla结合肽或剪接变体)的方法可涉及使用pcr来检测编码共有抗原的剪接变体。pcr使用源自患者样品的组合物和一对特异性结合剪接变体核酸的引物来进行。共有抗原的检测可基于确定pcr产物的大小。或者，检测可基于pcr期间检测标记的探针与特定剪接同等型的结合；例如taqman实时pcr。
[0327]
在另一种方法中，共有抗原可使用对剪接同等型具有选择性的探针的杂交来检测。可将源自患者样品的组合物用于对剪接同等型具有选择性的探针的杂交。探针可结合存在于剪接位点结合处的序列或存在于剪接同等型中的其他序列(如，纳入内含子[ire]、外显子[sie、mxe]或外显子的一部分[a5e、a3e])。
[0328]
在又一种方法中，共有抗原可使用抗体来检测。源自患者样品的组合物可与抗体接触，并且可将免疫组织化学和western印迹用于检测共有抗原。
[0329]
备选地，可将rna-seq数据用于检测共有抗原。
[0330]
上述方法都是本领域普通技术人员所熟知的。
[0331]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中map/微管亲和性调节激酶3(mark3)剪接变体的水平，其中与参照相比增加的mark3剪接变体水平将癌症表征为与该mark3剪接变体的表达相关的癌症。
[0332]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中map/微管亲和性调节激酶3(mark3)剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的mark3剪接变体水平(或mark3剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0333]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中mark3剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的mark3剪接变体水平(或mark3剪接变体的存在)将癌症表征为与该mark3剪接变体表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该mark3剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0334]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中mark3剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的mark3剪接变体水平(或mark3剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0335]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中nbpf9剪接变体的水平，其中与参照相比增加的nbpf9剪接变体水平将癌症表征为与该nbpf9剪接变体的表达相关的癌症。
[0336]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中nbpf9剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的nbpf9剪接变体水平(或nbpf9剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0337]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中nbpf9剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的nbpf9剪接变体(或nbpf9剪接
变体的存在)将癌症表征为与该nbpf9剪接变体的表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该nbpf9剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0338]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中nbpf9剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的nbpf9剪接变体水平(或nbpf9剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0339]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中pard3剪接变体的水平，其中与参照相比增加的pard3剪接变体水平将癌症表征为与该pard3剪接变体的表达相关的癌症。
[0340]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中pard3剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的pard3剪接变体水平(或pard3剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0341]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中pard3剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的pard3剪接变体水平(或pard3剪接变体的存在)将癌症表征为与该pard3剪接变体的表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该pard3剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0342]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中pard3剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的pard3剪接变体水平(或pard3剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0343]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中zc3hav1剪接变体的水平，其中与参照相比增加的zc3hav1剪接变体水平将癌症表征为与该zc3hav1剪接变体的表达相关的癌症。
[0344]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中zc3hav1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的zc3hav1剪接变体水平(或zc3hav1剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0345]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中zc3hav1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的zc3hav1剪接变体水平(或zc3hav1剪接变体的存在)将癌症表征为与该zc3hav1剪接变体表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该zc3hav1剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0346]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中zc3hav1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的zc3hav1剪接变体水平(或zc3hav1剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0347]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中yaf2剪接变体的水平，其中与参照相比增加的yaf2剪接变体水平将癌症表征为与该yaf2剪接变体表达相关的癌症。
[0348]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中yaf2剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的yaf2剪接变体水平(或yaf2剪接变
体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0349]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中yaf2剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的yaf2剪接变体水平(或yaf2剪接变体的存在)将癌症表征为与该yaf2剪接变体表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该yaf2剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0350]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中yaf2剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的yaf2剪接变体水平(或yaf2剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0351]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中camkk1剪接变体的水平，其中与参照相比增加的camkk1剪接变体水平将癌症表征为与该camkk1剪接变体的表达相关的癌症。
[0352]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中camkk1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的camkk1剪接变体水平(或camkk1剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0353]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中camkk1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的camkk1剪接变体水平(或camkk1剪接变体的存在)将癌症表征为与该camkk1剪接变体表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该camkk1剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0354]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中camkk1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的camkk1剪接变体水平(或camkk1剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0355]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中lrr1剪接变体的水平，其中与参照相比增加的lrr1剪接变体水平将癌症表征为与该lrr1剪接变体的表达相关的癌症。
[0356]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中lrr1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的lrr1剪接变体水平(或lrr1剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0357]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中lrr1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的lrr1剪接变体水平(或lrr1剪接变体的存在)将癌症表征为与该lrr1剪接变体的表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该lrr1剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0358]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中lrr1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的lrr1剪接变体水平(或lrr1剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0359]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中znf670剪接变体的水平，其中与参照相比增加的znf670剪接变体水平将癌症表征为与该
znf670剪接变体的表达相关的癌症。
[0360]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中znf670剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的znf670剪接变体水平(或znf670剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0361]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中znf670剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的znf670剪接变体水平(或znf670剪接变体的存在)将癌症表征为与该znf670剪接变体表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该znf670剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0362]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中znf670剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的znf670剪接变体水平(或znf670剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0363]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中grina剪接变体的水平，其中与参照相比增加的grina剪接变体水平将癌症表征为与该grina剪接变体的表达相关的癌症。
[0364]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中grina剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的grina剪接变体水平(或grina剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0365]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中grina剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的grina剪接变体水平(或grina剪接变体的存在)将癌症表征为与该grina剪接变体表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该grina剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0366]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中grina剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的grina剪接变体水平(或grina剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0367]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中mzf1剪接变体的水平，其中与参照相比增加的mzf1剪接变体水平将癌症表征为与该mzf1剪接变体的表达相关的癌症。
[0368]
本文还公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定获自受试者的样品中mzf1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的mzf1剪接变体水平(或mzf1剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症。
[0369]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中mzf1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的mzf1剪接变体水平(或mzf1剪接变体的存在)将癌症表征为与该mzf1剪接变体的表达相关的癌症，以及(b)治疗发现患有与该mzf1剪接变体表达相关的癌症的受试者。
[0370]
本文还公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括(a)确定获自受试者的样品中mzf1剪接变体的水平(或存在)，其中与参照相比增加的mzf1剪接变体水平(或mzf1剪接变体的存在)将癌症表征为可能对合适的免疫疗法治疗有应答的癌症，以及(b)治疗发现
可能对合适的免疫疗法治疗有应答的受试者。
[0371]
组合物
[0372]
组合物可包含具有癌症患者特征性的cdna表达谱的样品cdna和至少一种特异性结合cdna分子的引物或探针，其中样品cdna包含对应于共有抗原的cdna分子。在一些实施方案中，样品cdna是组织或唾液样品cdna。可将引物或探针附接到标记物上。组合物还可包含dna聚合酶。
[0373]
在一些实施方案中，共有抗原是mark3、nbpf9、pard3、zc3hav1、yaf2、camkk1、lrr1、znf670、grina或mzf1剪接变体。
[0374]
组合物还可包含具有癌症患者特征性的rna表达谱的样品rna。组合物可包含至少一种与rna分子结合的引物(如，寡聚dt引物)或探针。组合物还可包含用于产生cdna分子的逆转录酶。
[0375]
组合物还可包含组织切片或已从患者活检样品中提取的蛋白质裂解物，其中组合物可与探针或抗体反应以鉴定共有抗原的存在。
[0376]
pcr
[0377]
术语“聚合酶链式反应”或“pcr”是指体外扩增特定核酸序列的反应，其通过同时对核酸分子互补链进行引物延伸。换言之，pcr是制备侧翼有引物位点的靶核酸的多个拷贝或复制体的反应，这种反应包括以下步骤中的一个或多个重复：(i)使靶核酸变性，(ii)使引物退火至引物位点，和(iii)在核苷三磷酸存在下通过核酸聚合酶延伸引物。通常，反应在热循环仪中通过为每个步骤优化的不同温度进行循环。特定温度、每个步骤的持续时间和步骤之间的变化速率取决于本领域普通技术人员所熟知的许多因素。术语“pcr”涵盖反应的衍生形式，包括但不限于逆转录-pcr、实时pcr、嵌套pcr、定量pcr、多重pcr等。
[0378]
引物
[0379]
如本文所用，术语“引物”是指在引发引物延伸产物合成的条件下，即在合适的缓冲液(“缓冲液”包括ph、离子强度、辅因子等)中存在四种不同核苷三磷酸和聚合酶并且在合适的温度下，当与核酸模板退火时，能够充当dna合成起始点的核苷酸聚合物。
[0380]
本发明的扩增步骤中使用的引物可与靶序列完全互补或基本上互补。
[0381]
通常，引物为12至100个核苷酸，更优选为10至80个核苷酸；更优选为15至30个核苷酸；并且更优选为15至25个核苷酸。
[0382]
如本文公开的方法可包括用一对特异性结合共有抗原核酸的引物检测共有抗原。可将一种或多种引物通过与可检测物质如荧光团偶联来标记。
[0383]
术语“标记的”针对例如引物、抗体或探针而言，旨在涵盖通过将可检测物质与探针偶联(即，物理连接)来直接标记探针，以及通过与另一直接标记的试剂的反应性来间接标记探针。间接标记的示例包括使用荧光标记的二抗检测一抗，以及用生物素末端标记dna探针，从而其可用荧光标记的链霉亲和素检测。
[0384]
探针
[0385]
术语“探针”是指能够选择性地结合意图有特异性的靶分子的任何分子，例如核苷酸转录本或多肽。探针可由本领域技术人员合成，或源自适当的生物制备物。为了检测靶分子，可特定地设计被标记的探针。可用作探针的分子示例包括但不限于rna、dna、蛋白质、抗体和有机分子。在一些实施方案中，探针可以是表面固定的。当使用核酸(如，寡核苷酸)时，
它们可能能够以碱基特异性方式结合到另一条核酸链上。杂交可能发生在互补核酸链之间或包含少量错配区域的核酸链之间。这类探针包括肽核酸和本领域已知的其他核酸类似物和核酸模拟物。
[0386]
如本文所用，术语“杂交”是指由于互补碱基配对而由两条单链核酸形成双链体结构。杂交可发生在互补核酸链之间或包含少量错配区域的核酸链之间。解链温度或“tm”测量核酸双链体的稳定性。tm是50％的碱基对解离时的温度(在限定的离子强度和ph值)。核酸技术领域的技术人员可根据经验确定双链体稳定性，考虑许多变量，包括例如核酸的长度、碱基组成和序列、离子强度和错配碱基对的发生率。
[0387]
抗体
[0388]
本文公开的方法可包括用特异性结合共有抗原的抗体检测共有抗原(如，剪接变体和/或剪接变体抗原)。抗体可通过与诸如荧光团或酶的可检测物质偶联来标记。
[0389]
试剂盒
[0390]
本公开可提供试剂盒的开发和使用，该试剂盒包括用于检测或测量样品中共有抗原(如，剪接变体和/或剪接变体抗原)的水平的试剂(如，抗体、探针或引物)，如本文所定义的。试剂盒还可包括测定试剂和合适的缓冲液。
[0391]
治疗
[0392]
方法可包括向发现患有表达一种或多种共有抗原的癌症的受试者施用抗癌疗法或药剂。抗癌疗法或药剂可包括化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法或其组合。在一些实施方案中，方法可包括检测癌症抗原或靶标的存在以鉴定哪些患者可能是施用抗癌疗法或药剂的合适候选者。
[0393]
确定抗原特异性t淋巴细胞的存在
[0394]
本文公开了表征受试者中的医学病况的方法，该方法包括确定特异性结合根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或与一种或多种共有抗原特异性结合的t淋巴细胞的存在)将医学病况表征为与所述一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况。
[0395]
该方法可包括确定获自受试者的样品中(a)特异性结合根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的t淋巴细胞的水平(或存在)和(b)一种或多种共有抗原的水平(或存在)。在一些实施方案中，该方法可包括仅确定特异性结合根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的t淋巴细胞的水平(或存在)。在另一个实施方案中，该方法可包括确定(a)特异性结合根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的t淋巴细胞的水平(或存在)和(b)这样的抗原特异性t淋巴细胞的表型。
[0396]
本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括a)确定特异性结合根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或特异性结合一种或多种共有抗原的t淋巴细胞的存在)将医学病况表征为与所述一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况；以及b)治疗发现患有与所述一种或多种共有抗原表达相关的医学病况的受试者。
[0397]
在一些实施方案中，提供了包含与共有抗原结合的hla分子的标记的生物分子，其用于检测特异性结合共有抗原的t淋巴细胞的存在或确定其水平。
[0398]
术语“t淋巴细胞”(又被称为t细胞)可指cd4

t淋巴细胞(如，未成熟的cd4

t淋巴细
胞或成熟的cd4

辅助t淋巴细胞)。术语“t淋巴细胞”还可指cd8

t淋巴细胞(如，未成熟的cd8

t淋巴细胞或成熟的cd8

细胞毒性t淋巴细胞)。术语“t淋巴细胞”还可指cd4

t淋巴细胞和cd8

t淋巴细胞的混合物。
[0399]
在一些实施方案中，t淋巴细胞是非幼稚t淋巴细胞。在一些实施方案中，t淋巴细胞是幼稚t淋巴细胞。在一些实施方案中，t淋巴细胞还可指经历过抗原的t淋巴细胞。
[0400]
在一些实施方案中，t淋巴细胞是细胞毒性t淋巴细胞。细胞毒性t淋巴细胞(又被称为细胞毒性t细胞、tc、ctl、t杀伤细胞、溶细胞性t细胞、cd8 t细胞或杀伤性t细胞)是杀伤癌细胞、感染细胞或以其他方式破坏细胞的t淋巴细胞。
[0401]
在一些实施方案中，t淋巴细胞是辅助性t淋巴细胞。辅助性t淋巴细胞是通过释放t细胞细胞因子以调控免疫应答来帮助其他免疫细胞活动的t淋巴细胞。
[0402]
在一些实施方案中，共有抗原或其片段在抗原呈递细胞(如，专职抗原呈递细胞或癌细胞)表面呈递。共有抗原或其片段可与hla分子结合并在抗原呈递细胞或癌细胞的表面呈递。
[0403]
本文所指的hla可指来自mhc i类或mhc ii类的hla。
[0404]
在一个实施方案中，hla分子是选自hla-a11、hla-a02和/或hla-a24的mhc i类分子。
[0405]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合mark3剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该mark3剪接变体的表达相关的癌症。
[0406]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合nbpf9剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该nbpf9剪接变体的表达相关的癌症。
[0407]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合pard3剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该pard3剪接变体的表达相关的癌症。
[0408]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合zc3hav1剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该zc3hav1剪接变体的表达相关的癌症。
[0409]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合yaf2剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该yaf2剪接变体的表达相关的癌症。
[0410]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合camkk1剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该camkk1剪接变体的表达相关的癌症。
[0411]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合lrr1剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该lrr1剪接变体的表达相关的癌症。
[0412]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合znf670剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t
淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该znf670剪接变体的表达相关的癌症。
[0413]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合grina剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该grina剪接变体的表达相关的癌症。
[0414]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合mzf1剪接变体的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将癌症表征为与该mzf1剪接变体的表达相关的癌症。
[0415]
细胞疗法
[0416]
本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括：(a)确定特异性结合根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)将受试者中的医学病况表征为与所述一种或多种共有抗原的表达相关的医学病况；(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；以及(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗发现与所述一种或多种共有抗原表达相关的医学病况。
[0417]
本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括：(a)确定特异性结合根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的t淋巴细胞的水平(或存在)，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平(或t淋巴细胞的存在)表明受试者可能对合适的免疫疗法的治疗有应答；(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；以及(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的医学病况。
[0418]
本文公开了治疗受试者中的医学病况的方法，该方法包括：(a)在患有医学病况的受试者中分离特异性结合根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有抗原的t淋巴细胞群，并离体扩增该t淋巴细胞群；以及(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的医学病况。在一些实施方案中，该医学病况是癌症。
[0419]
所述方法可包括获得外周血单核细胞(pbmc)群。pbmc可用共有抗原刺激，以刺激识别共有抗原的t淋巴细胞的扩增。在一些实施方案中，所述方法可包括获得pbmc以分离单核细胞，其用于分化成树突细胞来刺激识别共有抗原的t淋巴细胞的扩增。在一些实施方案中，该方法可包括获得pbmc以产生ebv转化的b细胞，用于扩增识别共有抗原的t淋巴细胞。在一些实施方案中，可将树突细胞和ebv转化的b细胞的组合用于扩增识别共有抗原的t淋巴细胞。
[0420]
术语“施用”是指接触、应用或提供合适的疗法至患有医学病况的受试者。医学病况可以是癌症并且合适的疗法可以是多种抗癌免疫疗法中的任何一种。
[0421]
如本文所用，术语“治疗/处理”可指(1)预防或延缓一种或多种病症症状的出现；(2)抑制病症或一种或多种病症症状的发展；(3)缓解病症，即导致病症或至少一种或多种病症症状消退；和/或(4)导致病症的一种或多种症状的严重性降低。
[0422]
在本文中可互换使用的术语“患者”、“受试者”、“宿主”或“个体”是指需要治疗或预防的任何受试者，特别是脊椎动物受试者，甚至更特别是哺乳动物受试者。落入本发明范围内的合适的脊椎动物包括但不限于脊索动物门的任何成员，包括灵长类动物(如，人类、猴类和猿类，并且包括，如来自猕猴属(macaca)的猴类物种(如，食蟹猴例如macaca fascicularis和/或恒河猴(猕猴(macaca mulatta))和狒狒(papio ursinus)，以及狨猴
(来自狨属(callithrix)的物种)、松鼠猴(来自松鼠猴属(saimiri)的物种)和绢毛猴(来自柽柳猴属(saguinus)的物种)，以及猿类物种，如黑猩猩(pan troglodytes))，啮齿类(如，小鼠、大鼠、豚鼠)，兔类(如家兔、野兔)，牛科动物(如，家牛)，绵羊类(如，绵羊)，山羊类(如，山羊)，猪类(如，猪)，马类(如，马)，犬类(如，狗)，猫科动物(如，猫)，禽类(如，鸡、火鸡、鸭、鹅、陪伴鸟类如金丝雀、虎皮鹦鹉等)，海洋哺乳动物(如，海豚、鲸鱼)，爬行动物(蛇、青蛙、蜥蜴等)，以及鱼类。在一些实施方案中，受试者是人类。
[0423]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合mark3剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该mark3剪接变体的表达相关的癌症。
[0424]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0425]
(a)确定受试者中与mark3剪接变体特异性结合的t淋巴细胞水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该mark3剪接变体的表达相关的癌症；
[0426]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0427]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0428]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0429]
(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合mark3剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；以及
[0430]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0431]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合nbpf9剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该nbpf9剪接变体的表达相关的癌症。
[0432]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0433]
(a)确定受试者中特异性结合nbpf9剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该nbpf9剪接变体的表达相关的癌症；
[0434]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0435]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0436]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0437]
(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合nbpf9剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；和
[0438]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0439]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合pard3剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该pard3剪接变体的表达相关的癌症。
[0440]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0441]
(a)确定受试者中特异性结合pard3剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该pard3剪接变体的表达相关的癌症；
[0442]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0443]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0444]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0445]
(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合pard3剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；和
[0446]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0447]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合zc3hav1剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该zc3hav1剪接变体的表达相关的癌症。
[0448]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0449]
(a)确定受试者中特异性结合zc3hav1剪接变体的t淋巴细胞水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该zc3hav1剪接变体的表达相关的癌症；
[0450]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0451]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0452]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0453]
(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合zc3hav1剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；和
[0454]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0455]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合yaf2剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该yaf2剪接变体的表达相关的癌症。
[0456]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0457]
(a)确定受试者中特异性结合yaf2剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该yaf2剪接变体的表达相关的癌症；
[0458]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0459]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0460]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0461]
(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合yaf2剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；和
[0462]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0463]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合camkk1剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该camkk1剪接变体的表达相关的癌症。
[0464]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0465]
(a)确定受试者中特异性结合camkk1剪接变体的t淋巴细胞水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该camkk1剪接变体的表达相关的癌症；
[0466]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0467]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0468]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0469]
(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合camkk1剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；和
[0470]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0471]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合lrr1剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该lrr1剪接变体的表达相关的癌症。
[0472]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0473]
(a)确定受试者中特异性结合lrr1剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该lrr1剪接变体的表达相关的癌症；
[0474]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0475]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0476]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0477]
(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合lrr1剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；和
[0478]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0479]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合znf670剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该znf670剪接变体的表达相关的癌症。
[0480]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0481]
(a)确定受试者中特异性结合znf670剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该znf670剪接变体的表达相关的癌症；
[0482]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0483]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0484]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0485]
(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合znf670剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；和
[0486]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0487]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合grina剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该grina剪接变体的表达相关的癌症。
[0488]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：
[0489]
(a)确定受试者中特异性结合grina剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该grina剪接变体的表达相关的癌症；
[0490]
(b)分离和离体扩增t淋巴细胞群；
[0491]
(c)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0492]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：(a)从患有癌症的受试者中分离特异性结合grina剪接变体的t淋巴细胞群，并离体扩增t淋巴细胞群；和
[0493]
(b)向受试者施用扩增的t淋巴细胞群以治疗受试者中的癌症。
[0494]
本文公开了表征受试者中的癌症的方法，该方法包括确定受试者中特异性结合mzf1剪接变体的t淋巴细胞的水平，其中与参照相比增加的t淋巴细胞水平将癌症表征为与该mzf1剪接变体的表达相关的癌症。
[0495]
本文公开了治疗受试者中的癌症的方法，该方法包括：vα
、v
α-c
α-l-v
β
或v
α-l-v
β-c
β
类型的αβtcr多肽，其中v
α
和v
β
分别是tcrα和β可变区，c
α
和c
β
分别是tcrα和β恒定区，l是接头序列。为了用作将治疗剂递送至抗原呈递细胞的靶向剂，tcr可以是可溶形式(即，没有跨膜或细胞质结构域)。为了稳定性，可溶性αβ异二聚体tcr优选在各自恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，如，例如wo03/020763中所述。本发明的αβ异二聚体中存在的一个或两个恒定结构域可在c末端或c端被截短，例如截短多达15个、或多达10个或多达8个或更少的氨基酸。为了用于过继性疗法，可使αβ异二聚体tcr转染为例如具有细胞质和跨膜结构域的全长链。用于过继性疗法的tcr可包含对应于在各自α和β恒定结构域之间自然存在的二硫键，另外或备选地，可存在非天然二硫键。
[0509]
如对本领域技术人员显而易见的，可能将在其c-末端和/或n-末端提供的序列截短1、2、3、4、5个或更多个残基而基本上不影响tcr的结合特性。本发明涵盖所有这些微小变化的变体。
[0510]
本发明的α-β异二聚体tcr通常包含α链trac恒定结构域序列和β链trbc1或trbc2恒定结构域序列。α和β链恒定结构域序列可通过截短或取代来修饰以删除trac的外显子2的cys4与trbc1或trbc2的外显子2的cys2之间的天然二硫键。α和β链恒定结构域序列也可通过半胱氨酸残基取代trac的thr48和trbc1或trbc2的ser57来修饰，所述半胱氨酸在tcr的α和β恒定结构域之间形成二硫键。
[0511]
在一些实施方案中，提供了产生tcr的方法；该方法可包括：1)鉴定和分离来自患者或供体的t淋巴细胞，其特异性结合与hla分子结合的共有抗原或其片段；和/或2)进一步鉴定由这些t淋巴细胞表达的抗原结合分子的序列。
[0512]
在一些实施方案中，提供了产生tcr的方法；该方法可包括：1)从患者或匹配的健康供体中分离pbmc；2)分离抗原呈递细胞和t淋巴细胞；3)用根据本文定义的方法鉴定的共有抗原刺激t淋巴细胞；4)鉴定和分离特异性结合与hla分子结合的共有抗原或其片段的t淋巴细胞；5)进一步鉴定由这些t淋巴细胞表达的tcr序列。
[0513]
用于鉴定特异性结合本文鉴定的一种或多种共有抗原的tcr序列的方法可包括以下步骤中的一个或多个：
[0514]
a)分离抗原特异性t淋巴细胞；
[0515]
b)将抗原特异性t淋巴细胞分离成个体细胞；
[0516]
c)从抗原特异性t淋巴细胞制备核酸；和
[0517]
d)测序以获得抗原特异性的tcr序列。
[0518]
抗原特异性t淋巴细胞的分离可通过以下进行：1)使一种或多种标记的生物分子与一个或多个含有来自患有医学病况的相应患者或供体的外周血的样品接触，和2)从一个或多个样品中分离与标记的生物分子结合的t淋巴细胞。在一些实施方案中，标记的生物分子可以是hla多聚体并且结合将表明抗原特异性。在一些实施方案中，标记的生物分子可以是识别抗原时指示t淋巴细胞活化的抗体。例如，当ebv特异性t淋巴细胞遇到ebv感染的细胞时，其会被激活以诱导cd107的表面表达或分泌ifn-γ。在一些实施方案中，标记的生物分子可以是单个或多个hla多聚体和抗体的组合。在一些实施方案中，可能涉及扩增这些抗原特异性细胞以促进获得更多材料用于后续步骤。分离的抗原特异性t淋巴细胞可由表达多种tcr的多克隆t淋巴细胞群(每种t淋巴细胞表达不同版本的tra和trb)组成。
[0519]
可通过本领域技术人员所熟知的多种方法将抗原特异性t淋巴细胞分离成个体细
胞，从而可鉴定单个tcr的序列。这些方法包括，例如，使用fac分选器将抗原特异性t淋巴细胞群分选成个体细胞；使用微流体；使用微滴乳液；或分离可能包括添加条形码序列以促进鉴定个体t淋巴细胞克隆并随后合并抗原特异性t淋巴细胞。
[0520]
由抗原特异性t淋巴细胞制备核酸以分离tcr序列同样可通过本领域技术人员所熟知的许多方法来完成。rna或dna均可用作起始核酸材料。核酸通过pcr扩增以获得足够的材料用于分离tcr序列。tcr序列也可直接从来自抗原特异性t淋巴细胞的核酸扩增。tcr序列的扩增可包括产生抗原特异性t淋巴细胞的基因表达谱以允许tcr序列的优先化或排序。
[0521]
测序可通过许多测序方式进行，包括但不限于，例如sanger测序或下一代测序，以获得tcr序列。
[0522]
t细胞受体测序可在根据方法150的步骤156鉴定抗原特异性t淋巴细胞(图1(b))后进行。
[0523]
备选地，tcr序列可通过筛选在其表面上表达tcr的酵母或噬菌体文库来鉴定。这涉及鉴定哪个tcr序列能够结合与hla分子结合的共有抗原或其片段。
[0524]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合共有抗原或其片段，其中共有抗原或其片段与hla分子结合。
[0525]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合共有抗原的t细胞受体(tcr)，其中共有抗原与hla分子结合。共有抗原可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0526]
一旦获得了根据本文定义的方法鉴定的针对共有抗原的抗原特异性tcr，则根据本领域技术人员所熟知的方法将这些tcr工程化改造到免疫细胞中，用于治疗医学病况。
[0527]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合mark3剪接变体或其片段，其中该mark3剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0528]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合该mark3剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该mark3剪接变体与hla分子结合。该mark3剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0529]
在一个实施方案中，共有抗原包含与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0530]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0531]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合nbpf9剪接变体或其片段，其中该nbpf9剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0532]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合nbpf9剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该nbpf9剪接变体与hla分子结合。nbpf9剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0533]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:31具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:31具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0534]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合pard3剪接变体或其片段，其中该pard3剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0535]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提
供了特异性结合pard3剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该pard3剪接变体与hla分子结合。pard3剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0536]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:32具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:32具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0537]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合zc3hav1剪接变体或其片段，其中该zc3hav1剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0538]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合zc3hav1剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该zc3hav1剪接变体与hla分子结合。zc3hav1剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0539]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:33具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:33具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0540]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合yaf2剪接变体或其片段，其中该yaf2剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0541]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合yaf2剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该yaf2剪接变体与hla分子结合。yaf2剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0542]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:34具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:34具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0543]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合camkk1剪接变体或其片段，其中该camkk1剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0544]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合camkk1剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该camkk1剪接变体与hla分子结合。camkk1剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0545]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:35具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:35具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0546]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合lrr1剪接变体或其片段，其中该lrr1剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0547]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合lrr1剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该lrr1剪接变体与hla分子结合。lrr1剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0548]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:36或seq id no:51具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:36或seq id no:51具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0549]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合znf670剪接变体或其片段，其中该znf670剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0550]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合znf670剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该znf670剪接变体与hla分子结合。znf670剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0551]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:37具有至少80％序列同一性的肽，
或编码与seq id no:37具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0552]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合grina剪接变体或其片段，其中该grina剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0553]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合grina剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该grina剪接变体与hla分子结合。grina剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0554]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:38具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:38具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0555]
本文公开了编码t细胞受体的核酸，其中由该核酸编码的t细胞受体能够特异性结合mzf1剪接变体或其片段，其中该mzf1剪接变体或其片段与hla分子结合。
[0556]
本文还提供了由本文定义的核酸编码的分离的t细胞受体。在一些实施方案中，提供了特异性结合mzf1剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中该mzf1剪接变体与hla分子结合。mzf1剪接变体可在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0557]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:52具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:52具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0558]
在一些实施方案中，tcr包含tcrα链结构域，其包含trav6*01氨基酸序列、traj9*01氨基酸序列和/或与seq id no:20的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的cdr3。在一些实施方案中，tcr包含tcrβ链结构域，其包含trbv7-9*01氨基酸序列、trbj1-2*01氨基酸序列和/或与seq id no:28的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的cdr3。
[0559]
在一些实施方案中，tcr包含a)tcrα链结构域，其包含trav6*01氨基酸序列、traj9*01氨基酸序列和/或与seq id no:20的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的cdr3；和b)tcrβ链结构域，其包含trbv7-9*01氨基酸序列、trbj1-2*01氨基酸序列和/或与seq id no:28的氨基酸序列具有至少70％序列同一性的cdr3。
[0560]
在一些实施方案中，tcr包含a)tcrα链结构域，其包含与seq id no:15具有至少70％序列同一性的氨基酸序列、与seq id no:16具有至少70％序列同一性的氨基酸序列和与seq id no:20具有至少70％序列同一性的氨基酸序列；和b)tcr β链结构域，其包含与seq id no:23具有至少70％序列同一性的氨基酸序列、与seq id no:24具有至少70％序列同一性的氨基酸序列和与seq id no:28具有至少70％序列同一性的氨基酸序列。
[0561]
tcr可包含a)tcr α链结构域，其包含i)seq id no:17的cdr1序列，ii)seq id no:18的cdr2序列和/或iii)seq id no:20的cdr3。tcr可包含b)tcrβ链结构域，其包含i)seq id no:25的cdrl序列，ii)seq id no:26的cdr2序列和/或iii)seq id no:28的cdr3序列。
[0562]
在一些实施方案中，提供了tcr，其包含a)tcrα链可变结构域，其包含与seq id no:21具有至少70％(或80％、90％、95％或100％)序列同一性的序列，和b)tcrβ链可变结构域，其包含与seq id no:29具有至少70％(或80％、90％、95％或100％)序列同一性的序列。
[0563]
在一些实施方案中，提供了tcr，其包含a)tcrα链结构域，其包含与seq id no:22具有至少70％(或80％、90％、95％或100％)序列同一性的序列，和b)tcrβ链结构域，其包含与seq id no:30具有至少70％(或80％、90％、95％或100％)序列同一性的序列。
[0564]
本发明还提供了含有tcr表达载体的细胞。载体可包含本发明的核酸，其在单个开放阅读框或两个不同的开放阅读框中分别编码α链和β链。
[0565]
还提供了含有第一表达载体和第二表达载体的细胞，所述第一表达载体包含编码本文定义的tcr α链的核酸，并且第二表达载体包含编码本文定义的tcrβ链的核酸。
[0566]
用于免疫疗法的可溶性tcr
[0567]
鉴定的tcr序列可通过去除tcr链的跨膜区和细胞质尾部区来溶解。可溶性tcr的链间稳定性可通过修饰tcr链的序列来稳定；例如，tra和trb链中的残基可用半胱氨酸替换，这允许在两条链之间形成二硫键。这些可溶性tcr可进一步修饰以具有增强治疗功效的额外功能；例如，融合到抗cd3单链可变片段，这允许募集cd3 t细胞。这类方法是本领域技术人员所熟知的并且可见于例如walseng等人plos one 2015和damato等人cancers(basel)2019。
[0568]
备选地，鉴定的tcr序列可通过在宿主细胞(如，哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞)中表达编码tcr可变区的核苷酸序列而重组产生。在表达载体的帮助下，含有该核苷酸序列的核酸可转染并在适合产生可溶性tcr的宿主细胞中表达。
[0569]
本文提供了与本文定义的共有抗原特异性结合的溶解性tcr，其中共有抗原与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞表面上呈递。
[0570]
本文提供了特异性结合一种mark3剪接变体的溶解性tcr，其中mark3剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0571]
本文提供了特异性结合一种mark3剪接变体的溶解性tcr，其中mark3剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递，其中tcr包含a)tcrα链可变结构域，其包含与seq id no:21具有至少70％序列同一性的序列，和b)tcrβ链可变结构域，其包含与seq id no:29具有至少70％序列同一性的序列。
[0572]
在一个实施方案中，溶解性tcr包含a)tcrα链结构域，其包含i)seq id no:17的cdr1序列，ii)seq id no:18的cdr2序列和iii)seq id no:20的cdr3；和b)tcrβ链结构域，其包含i)seq id no:25的cdr1序列，ii)seq id no:26的cdr2序列和/或iii)seq id no:28的cdr3序列。
[0573]
本文提供了特异性结合一种nbpf9剪接变体的溶解性tcr，其中nbpf9剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0574]
本文提供了特异性结合一种pard3剪接变体的溶解性tcr，其中pard3剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0575]
本文提供了特异性结合一种zc3hav1剪接变体的溶解性tcr，其中zc3hav1剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0576]
本文提供了特异性结合一种yaf2剪接变体的溶解性tcr，其中yaf2剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0577]
本文提供了特异性结合一种camkk1剪接变体的溶解性tcr，其中camkk1剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0578]
本文提供了特异性结合一种lrr1剪接变体的溶解性tcr，其中lrr1剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0579]
本文提供了特异性结合一种znf670剪接变体的溶解性tcr，其中znf670剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0580]
本文提供了特异性结合一种grina剪接变体的溶解性tcr，其中grina剪接变体与
hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0581]
本文提供了特异性结合一种mzf1剪接变体的溶解性tcr，其中mzf1剪接变体与hla分子结合并且任选地在癌细胞表面上呈递。
[0582]
在一些实施方案中，提供了与抗体如单链可变片段融合的溶解性tcr。在一些实施方案中，单链可变片段是抗cd3单链可变片段。
[0583]
还可将本发明的溶解性tcr附接到可检测的标记物(如，荧光标记物、放射性标记物、酶、核酸探针)或治疗剂(如，免疫调节剂、放射性同位素、毒素、酶或细胞毒剂)。
[0584]
本文定义的溶解性tcr可以是糖基化的。糖基化的程度可例如通过使用特定的细胞系在体内控制，或通过化学修饰在体外控制。这种修饰是期望的，因为糖基化可改善药代动力学、降低免疫原性并更接近地模拟天然的人类蛋白质。
[0585]
工程化的免疫细胞
[0586]
本文提供了包含编码本文定义的t细胞受体的核酸或表达载体的工程化免疫细胞，其中工程化免疫细胞能够特异性结合共有抗原或其片段，其中共有抗原或其片段与hla分子结合并任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。工程化免疫细胞可以是t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞可以是t淋巴细胞的混合物。在另一个实施方案中，工程化细胞是与受治疗的患者相容的同种异体细胞。
[0587]
治疗
[0588]
本文公开了治疗医学病况的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达靶向根据本文定义的方法鉴定的共有抗原的t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞来治疗受试者中的医学病况，其中共有抗原与hla分子结合。还提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗医学病况。还提供了本文定义的溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗医学病况的药物中的用途。
[0589]
本文公开了治疗与mark3剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞来治疗受试者中的癌症。
[0590]
本文公开了治疗与mark3剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括施用特异性结合mark3剪接变体的溶解性tcr或表达特异性结合与hla分子结合的mark3剪接变体的t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞，其中溶解性tcr或tcr包含a)tcrα链可变结构域，其包含与seq id no:21具有至少70％序列同一性的序列，和b)tcrβ链可变结构域，其包含与seq id no:29具有至少70％序列同一性的序列。
[0591]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽，或编码与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0592]
本文公开了治疗与mark3剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括施用特异性结合mark3剪接变体的溶解性tcr或表达特异性结合与hla分子结合的mark3剪接变体的t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞，其中溶解性tcr或tcr包含a)tcr α链结构域，其包含与seq id no:22具有至少70％序列同一性的序列，和b)tcrβ链结构域，其包含与seq id no:30具有至少70％序列同一性的序列。
[0593]
本文提供了用于治疗与mark3剪接变体表达相关的癌症的工程化免疫细胞，其中向受试者施用表达本文定义的t细胞受体(tcr)的免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0594]
还提供了用于治疗与mark3剪接变体表达相关的癌症的工程化免疫细胞，其中免疫细胞表达特异性结合与hla分子结合的mark3剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中tcr包含a)tcrα链可变结构域，其包含与seq id no:21具有至少70％序列同一性的序列，和b)tcrβ链可变结构域，其包含与seq id no:29具有至少70％序列同一性的序列。
[0595]
本文提供了工程化免疫细胞在制备用于治疗与mark3剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途，其中向受试者施用表达本文定义的t细胞受体(tcr)的免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0596]
还提供了工程化免疫细胞在制备用于治疗医学病况的药物中的用途；其中免疫细胞表达特异性结合与hla分子结合的mark3剪接变体的t细胞受体(tcr)，其中tcr包含a)tcrα链可变结构域，其包含与seq id no:21具有至少70％序列同一性的序列，和b)tcrβ链可变结构域，其包含与seq id no:29具有至少70％序列同一性的序列。
[0597]
本文公开了治疗与nbpf9剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达本文定义的t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0598]
本文提供了本文定义的溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与nbpf9剪接变体表达相关的癌症。
[0599]
本文提供了本文定义的溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与nbpf9剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0600]
本文公开了治疗与pard3剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0601]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与pard3剪接变体表达相关的癌症。
[0602]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与pard3剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0603]
本文公开了治疗与zc3hav1剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0604]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与zc3hav1剪接变体表达相关的癌症。
[0605]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与zc3hav1剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0606]
本文公开了治疗与yaf2剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0607]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与yaf2剪接变体表达相关的癌症。
[0608]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与yaf2剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0609]
本文公开了治疗与camkk1剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0610]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与camkk1剪接变体表达相关的癌症。
[0611]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与camkk1剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0612]
本文公开了治疗与lrr1剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0613]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与lrr1剪接变体表达相关的癌症。
[0614]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与lrr1剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0615]
本文公开了治疗与znf670剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0616]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与znf670剪接变体表达相关的癌症。
[0617]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与znf670剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0618]
本文公开了治疗与grina剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0619]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与grina剪接变体表达相关的癌症。
[0620]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与grina剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0621]
本文公开了治疗与mzf1剪接变体表达相关的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的溶解性tcr或表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞以治疗受试者中的癌症。
[0622]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞用于治疗与mzf1剪接变体表达相关的癌症。
[0623]
本文提供了溶解性tcr或工程化免疫细胞在制备用于治疗与mzf1剪接变体表达相关的癌症的药物中的用途。
[0624]
药物组合物
[0625]
本文提供了药物组合物，其包含如本文定义的抗体、溶解性tcr、表达t细胞受体(tcr)的工程化免疫细胞(如，t细胞或nk细胞)或扩增的免疫细胞(如，t细胞或nk细胞)群。本文定义的抗体、溶解性tcr、工程化免疫细胞或扩增的免疫细胞群优选以与可接受的载体
或载体材料混合的剂量用于这样的药物组合物中，从而可治疗或至少减轻疾病。这样的组合物(除活性组分和载体外)可包括填充材料、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂和其他现有技术已知的材料。例如，药物组合物可以是可注射的组合物。
[0626]
术语“药学上可接受的”定义了不干扰活性组分生物活性的有效性的无毒材料。载体的选择取决于应用。
[0627]
药物组合物可包含增强活性组分活性或补充治疗的额外组分。这样的额外组分和/或因子可以是药物组合物的一部分，以实现协同作用或使不利或不希望的作用最小化。
[0628]
本发明活性组分的配制或制备和应用/用药的技术发表在“remington's pharmaceutical sciences",mack publishing co.,easton,pa,最新版。合适的应用是肠胃外应用，例如肌肉内、皮下、髓内注射以及鞘内、直接心室内、静脉内、结内、腹膜内或肿瘤内注射。静脉内注射是患者的优选治疗方法。
[0629]
在一些实施方案中，药物组合物是输注剂或注射剂。
[0630]
可注射的组合物是药学上可接受的流体组合物，其包含至少一种活性成分，例如表达tcr的扩增的免疫细胞群(如，对于待治疗的患者是自体的或同种异体的)。活性成分通常溶解或悬浮于生理上可接受的载体中，并且组合物还可额外包含少量的一种或多种无毒辅助物质，如乳化剂、防腐剂和ph缓冲剂等。可用于与本公开的融合蛋白一起使用的这类可注射的组合物是常规的；合适的配方是本领域普通技术人员所熟知的。
[0631]
通常，药物组合物包含至少一种药学上可接受的载体。
[0632]
用于免疫疗法的抗体
[0633]
本文提供了产生特异性结合共有抗原或其片段的抗体的方法。共有抗原或其片段可与hla分子结合并且可任选地呈递在抗原呈递细胞或癌细胞表面上。
[0634]“抗体”是指对靶抗原(共有抗原)具有结合亲和力的分子。应当理解，该术语延伸至免疫球蛋白、免疫球蛋白片段和显示抗原结合活性的非免疫球蛋白来源的蛋白质框架。可用于实施本发明的代表性抗原结合分子包括多克隆和单克隆抗体以及它们的片段(如，fab、fab'、f(ab')2、fv)、单链(scfv)和结构域抗体(包括，例如鲨鱼和骆驼抗体)，和包含抗体的融合蛋白，以及包含抗原结合/识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他修饰构型。抗体包括任何种类的抗体，例如igg、iga或igm(或其亚类)，并且抗体不需要是任何特定种类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类别。免疫球蛋白有五种主要类别：iga、igd、ige、igg和igm，其中一些可进一步分为亚类(亚型)，例如igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是所熟知的。抗原结合分子还包括二聚体抗体以及多价形式的抗体。在一些实施方案中，抗原结合分子是嵌合抗体，其中重链和/或轻链的一部分与源自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的其余部分与源自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这类抗体的片段，只要它们表现出期望的生物活性(参见，例如美国专利号4,816,567；和morrison等人,1984,proc.natl.acad.sci.usa 81:6851-6855)。还涵盖了人源化抗体，其通常通过将互补决定区(cdr)从非人类(如，啮齿动物，优选小鼠)免疫球蛋白的重链和轻链可变链转移至人可变结构域中来产生。然后人类抗体的典型残基被非人类对应物的框架区中的取代。使用源自人源化抗体的抗体组分避免了与非人类恒定区的免疫原性相关的潜在
问题。用于克隆非人类，特别是鼠类免疫球蛋白可变结构域的一般技术描述于，例如，orlandi等人(1989,proc.natl.acad.sci.usa 86:3833)。产生人源化单克隆抗体的技术描述于，例如jones等人(1986,nature 321:522),carter等人(1992,proc.natl.acad.sci.usa 89:4285),sandhu(1992,crit.rev.biotech.12:437),singer等人(1993,j.immun.150:2844),sudhir(编,antibody engineering protocols,humana press,inc.1995),kelley(“engineering therapeutic antibodies,”于protein engineering:principles and practice cleland等人(编),pages 399-434(john wiley&sons,inc.1996)，以及queen等人的美国专利号5,693,762(1997)。人源化抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区源自通过用感兴趣的抗原免疫猕猴而产生的抗体。还涵盖抗原结合分子是人源化抗体。
[0635]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用根据本文定义的方法鉴定的共有抗原或其片段免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合共有抗原或其片段的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。共有抗原或其片段可与hla分子结合和/或可呈递在抗原呈递细胞或癌细胞表面上。本文还公开了根据本文定义的方法获得的抗体。
[0636]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用mark3剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该mark3剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0637]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用nbpf9剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该nbpf9剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0638]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用pard3剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该pard3剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0639]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用zc3hav1剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该zc3hav1剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0640]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用yaf2剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该yaf2剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0641]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用camkk1剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该camkk1剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0642]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用lrr1剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该lrr1剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0643]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用znf670剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该znf670剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0644]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用grina剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该grina剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0645]
在一些实施方案中，提供了产生抗体的方法，该方法包括：1)用mzf1剪接变体肽免疫动物；2)从动物中鉴定和/或分离特异性结合该mzf1剪接变体的b细胞；以及3)产生由该b细胞表达的抗体。
[0646]
用于产生抗体的方法是本领域技术人员所熟知的。一种这样的方法包括筛选b细胞群以产生富含能够特异性结合共有抗原的b细胞的b细胞文库；扩增获自在b细胞文库的单个b细胞或多个b细胞中表达的mrna的cdna，以制备包含vh和v
l
结构域的免疫球蛋白文库；将免疫球蛋白文库克隆到表达载体中以形成能够表达vh和v
l
结构域的表达载体文库，由此vh和v
l
结构域天然配对；使用表达载体文库在表达系统中表达vh和v
l
结构域以形成抗体文库，其中抗体包含天然配对的vh和v
l
结构域；以及针对与hla结合肽结合筛选抗体文库。
[0647]
备选地，结合与hla分子结合的共有抗原或其片段的抗体序列可通过筛选在其表面上表达抗体的酵母或噬菌体文库来鉴定。这涉及鉴定由酵母或噬菌体的单个克隆表达的哪个抗体序列能够结合与hla分子结合的共有抗原或其片段。抗体序列的鉴定可通过将噬菌体文库与负载共有抗原的生物素化hla分子和由链霉亲和素包被的磁珠捕获的特定克隆一起温育来完成。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这也可能涉及抗体序列的诱变以获得具有更高特异性和/或亲和力的抗体，该抗体能够结合与hla分子结合的共有抗原或其片段。可将抗体序列的多轮诱变和/或鉴定用于选择具有最理想特性的抗体序列，该抗体序列可结合与hla分子结合的共有抗原或其片段。
[0648]
在一些实施方案中，提供了鉴定与共有抗原或其片段结合的抗体的方法，该方法包括：1)使共有抗原或其片段与抗体噬菌体展示或酵母展示文库接触；其中共有抗原或其片段与hla分子结合，2)选择与共有抗原或其片段结合的噬菌体分子或酵母细胞；以及3)获得在噬菌体分子或酵母细胞上呈递的抗体的dna序列。该方法可进一步包括通过本领域所熟知的亲和力成熟方法来提高抗体与共有抗原或其片段的结合亲和力。
[0649]
抗体可通过在宿主细胞(如，哺乳动物中国仓鼠卵巢细胞)中表达编码单克隆抗体可变区的核苷酸序列来重组产生。在表达载体的帮助下，可在适合生产的宿主细胞中转染并表达含有核苷酸序列的核酸。因此，基于抗体的治疗受试者中的医学病况的方法可包括使用多克隆或单克隆抗体。
[0650]
在一个示例中，为了表达抗体或其抗体片段，将通过标准分子生物学技术获得的编码部分或全长轻链和重链的dna插入表达载体中，使得基因与转录和翻译控制序列可操作地连接。在此背景中，术语“可操作地连接”旨在表示将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥其调控抗体基因转录和翻译的意图的功能。选择表达载体和表达控制序列以与使用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入分别的载体中，或更典型地，将两个基因都插入同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入表达载体中(如，连接抗体基因片段和载体上的互补限制性位点，如果没有限制性位点，则平端连接)。可将本文所述抗体的轻链和重链可变区通过以下用于产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入已编码所期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中，使得vh区段与载体内的ch区段可操作地连接，并且v
l
区段与载体内的c
l
区段可操作地连
接。另外地或备选地，重组表达载体可编码促进抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆到载体中，使得信号肽与抗体链基因的氨基末端符合读框地连接。信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0651]
可进一步修饰抗体以具有增强治疗功效的额外功能。例如，抗体与抗cd3单链可变片段融合，这允许cd3 t细胞的募集。
[0652]
在一些实施方案中，特异性结合hla结合肽或其片段的抗体可在免疫细胞中表达以治疗医学病况。该抗体经工程化改造以嵌入细胞膜中，并具有包含可激活免疫细胞的结构域的胞质尾部区。例如，胞质尾部区可由共刺激蛋白如cd28和4-1bb的细胞内信号传导结构域或cd3ζ结构域的信号传导结构域组成，如，例如描述于zhang等人sci rep 2014。在一些实施方案中，工程化免疫细胞可以是t细胞或nk细胞。在一些实施方案中，工程化免疫细胞可以是t淋巴细胞的混合物。在另一个实施方案中，工程化细胞可以是与受治疗的患者相容的同种异体细胞。
[0653]
本文公开了特异性结合根据本文定义的方法鉴定的共有抗原的抗体。
[0654]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽，或者是编码与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0655]
本文还公开了特异性结合本文公开的mark3剪接变体肽的抗体。
[0656]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:31具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:31具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0657]
本文还公开了特异性结合本文公开的nbpf9剪接变体肽的抗体。
[0658]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:32具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:32具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0659]
本文还公开了特异性结合本文公开的pard3剪接变体肽的抗体。
[0660]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:33具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:33具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0661]
本文还公开了特异性结合本文公开的zc3hav1剪接变体肽的抗体。
[0662]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:34具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:34具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0663]
本文还公开了特异性结合本文公开的yaf2剪接变体肽的抗体。
[0664]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:35具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:35具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0665]
本文还公开了特异性结合本文公开的camkk1剪接变体肽的抗体。
[0666]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:36或seq id no:51具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:36或seq id no:51具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0667]
本文还公开了特异性结合本文公开的lrr1剪接变体肽的抗体。
[0668]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:37具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:37具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0669]
本文还公开了特异性结合本文公开的znf670剪接变体肽的抗体。
[0670]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:38具有至少80％序列同一性的肽，
或是编码与seq id no:38具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0671]
本文还公开了特异性结合本文公开的grina剪接变体肽的抗体。
[0672]
在一个实施方案中，共有抗原是与seq id no:52具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:52具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0673]
本文还公开了特异性结合本文公开的mzf1剪接变体肽的抗体。
[0674]
本文公开了特异性结合根据本文定义的方法鉴定的共有抗原的抗体，其中所述共有抗原结合hla分子并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞的表面上呈递。
[0675]
本文还公开了与本文公开的mark3剪接变体肽特异性结合的抗体，其中mark3剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0676]
本文还公开了特异性结合本文公开的nbpf9剪接变体肽的抗体，其中nbpf9剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0677]
本文还公开了特异性结合本文公开的pard3剪接变体肽的抗体，其中pard3剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0678]
本文还公开了特异性结合本文公开的zc3hav1剪接变体肽的抗体，其中zc3hav1剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0679]
本文还公开了特异性结合本文公开的yaf2剪接变体肽的抗体，其中yaf2剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0680]
本文还公开了特异性结合本文公开的camkk1剪接变体肽的抗体，其中camkk1剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0681]
本文还公开了特异性结合本文公开的lrr1剪接变体肽的抗体，其中lrr1剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0682]
本文还公开了特异性结合本文公开的znf670剪接变体肽的抗体，其中znf670剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0683]
本文还公开了特异性结合本文公开的grina剪接变体肽的抗体，其中grina剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0684]
本文还公开了特异性结合本文公开的mzf1剪接变体肽的抗体，其中mzf1剪接变体肽与hla分子结合并且任选地在抗原呈递细胞或癌细胞表面上呈递。
[0685]
此外，本文公开了药物组合物，其包含本文定义的抗体和药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以是不会对生物体造成严重刺激并且不会消除所施用的药物组合物的生物活性和性质的载体或稀释剂。这些短语下包括佐剂。包含在药学上可接受的载体中的一种成分可以是，例如聚乙二醇(peg)，一种在有机和水性介质中具有广泛溶解性的生物相容性聚合物。
[0686]
本文还提供了治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括在一定条件下向受试者施用如本文定义的药物组合物持续足够时间以治疗受试者中的癌症。
[0687]
本文提供了如本文定义的药物组合物用于治疗受试者中的癌症。
[0688]
本文提供了如本文定义的药物组合物在制备用于治疗受试者中癌症的药物中的用途。
[0689]
免疫调节组合物
[0690]
本文公开了免疫调节组合物，其包含根据本文定义的方法鉴定的一种或多种共有
抗原和药学上可接受的载体。
[0691]
如本文所用，术语“免疫调节组合物”可指能够调节动物免疫系统的组合物。“免疫调节组合物”可具有通过本领域技术人员所熟悉的修饰蛋白质/核酸序列和/或缀合技术进一步增强的免疫刺激特性。免疫调节组合物可包含一种或多种共有抗原，其能够刺激t淋巴细胞的扩增和/或产生针对一种或多种共有抗原的抗体，其中共有抗原与hla分子结合。
[0692]
本文还公开了包含mark3剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0693]
在一个实施方案中，mark3剪接变体是与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:1具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0694]
本文还公开了包含nbpf9剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0695]
在一个实施方案中，nbpf9剪接变体是与seq id no:31具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:31具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0696]
本文还公开了包含pard3剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0697]
在一个实施方案中，pard3剪接变体是与seq id no:32具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:32具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0698]
本文还公开了包含zc3hav1剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0699]
在一个实施方案中，zc3hav1剪接变体是与seq id no:33具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:33具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0700]
本文还公开了包含yaf2剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0701]
在一个实施方案中，yaf2剪接变体是与seq id no:34具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:34具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0702]
本文还公开了包含camkk1剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0703]
在一个实施方案中，camkk1剪接变体是与seq id no:35具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:35具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0704]
本文还公开了包含lrr1剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0705]
在一个实施方案中，lrr1剪接变体是与seq id no:36或seq id no:51具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:36或seq id no:51具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0706]
本文还公开了包含znf670剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0707]
在一个实施方案中，znf670剪接变体是与seq id no:37具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:37具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0708]
本文还公开了包含grina剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0709]
在一个实施方案中，grina剪接变体是与seq id no:38具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:38具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0710]
本文还公开了包含mzf1剪接变体肽和药学上可接受的载体的免疫调节组合物。
[0711]
在一个实施方案中，mzf1剪接变体是与seq id no:52具有至少80％序列同一性的肽，或是编码与seq id no:52具有至少80％序列同一性的肽的核酸。
[0712]
本文公开了刺激受试者中的免疫应答的方法，该方法包括在一定条件下向受试者施用有效量的如本文定义的免疫调节组合物达足够的时间，以刺激受试者中的免疫应答。
[0713]
在一些实施方案中，本文定义的免疫调节组合物包含佐剂。佐剂是增加受试者对疫苗的免疫应答的物质。合适的佐剂包括但不限于氢氧化铝(明矾)、免疫刺激复合物(iscoms)、非离子嵌段聚合物或共聚物、细胞因子(如，il-1、il-2、il-7、ifn-α、ifn-β、ifn-γ等)、皂苷类、单磷酰脂a(mla)、胞壁酰二肽(mdp)等。其他合适的佐剂包括例如硫酸铝钾、分离自大肠杆菌的不耐热或耐热肠毒素、霍乱毒素或其b亚基、白喉毒素、破伤风毒素、百日咳毒素、弗氏不完全或完全佐剂等。基于毒素的佐剂，例如白喉毒素、破伤风毒素和百日咳毒素，可在使用前灭活，例如通过用甲醛处理。
[0714]
在一些实施方案中，免疫调节组合物可包含dna或rna疫苗。
[0715]
在一些实施方案中，本文定义的免疫调节组合物包含抗原呈递细胞和一种或多种共有抗原。例如，可分离来自患有医学病况的受试者的树突细胞，并且可在离体的树突细胞表面上呈递一种或多种共有抗原。然后这些负载有一种或多种共有抗原的树突细胞可对患有医学病况的受试者施用以诱导免疫反应。
[0716]
本文提供了如本文定义的免疫调节组合物用于刺激受试者中的免疫应答。
[0717]
本文提供了如本文定义的免疫调节组合物在制备用于刺激受试者中的免疫应答的药物中的用途。
[0718]
本文提供了治疗或预防受试者中的癌症的方法，该方法包括向受试者施用本文定义的免疫调节组合物以治疗或预防受试者中的癌症。
[0719]
本文提供了如本文定义的免疫调节组合物用于预防或治疗受试者中的癌症。
[0720]
本文提供了如本文定义的免疫调节组合物在制备用于预防或治疗受试者中的癌症的药物中的用途。
[0721]
如本文所用，“和/或”是指并涵盖一个或多个相关列出项目的任何和所有可能的组合，以及在解释为备选(或)时缺少组合。
[0722]
如在本技术中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“所述/该”包括复数引用，除非上下文另有明确规定。例如，术语“一种试剂”包括多种试剂，包括它们的混合物。
[0723]
在整个说明书和随后的陈述中，除非上下文另有要求，词语“包含”以及诸如“包括”和“含有”之类的变体将被理解为暗示纳入所述整数或步骤或整数组或步骤组但不排除任何其他整数或步骤或整数组或步骤组。
[0724]
本说明书中对任何在先出版物(或来源于其的信息)或任何已知事项的引用不是也不应被视为承认或认可或任何形式暗示该在先出版物(或来源于其的信息)或已知事项构成本说明书所涉及尝试领域的公知常识的一部分。
[0725]
本领域技术人员将理解，本文描述的本发明易于进行除具体描述的那些之外的变化和修改。应当理解，本发明包括落入精神和范围内的所有这些变化和修改。本发明还包括本说明书中分别或共同地提及或指示的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或更多个所述步骤或特征的任何和所有组合。
实施例
[0726]
实施例1
[0727]
胃癌中共有的选择性剪接变体的鉴定
[0728]
来自19名患者(发现队列)的胃腺癌肿瘤样品和临床信息获自新加坡卫生服务部
和国立大学医院系统(the singapore health services and the national university hospital system)组织存储库。匹配的正常样品取自邻近肿瘤的非恶性粘膜。使用miso对这19个gc患者样品进行深度rna测序(200m读段)和mrna剪接分析。进行miso分析以分析肿瘤和正常组织之间差异剪接事件的rna-seq数据。将选择标准(前0.5％的剪接事件、至少20％的剪接变化(δpsi)、贝叶斯因子》20和至少3名患者中发生)应用于数据，其产生361个肿瘤相关可变剪接事件的列表，这可以允许鉴定可能在gc患者亚群中共有的候选抗原区(图10)。胃癌中观测到的剪接变化的总结如图11(a)所示。
[0729]
通过比较各个参照和肿瘤样品的psi值并鉴定存在若干与参照样品显著不同的肿瘤样品的情况的剪接变体(图3中的异常值)来鉴定共有剪接变体。这提供了潜在的益处，即鉴定出人群中未观测到的剪接变体抗原，因此是真正的新抗原。在胃癌患者中共有的可变剪接变体的鉴定分析中，选择了19名患者中存在于至少3名患者中的剪接变体。对这些剪接变体进行选择的进一步的标准是，与参照样品相比，这些异常值样品的中位数显示psi值至少有20％的差异。
[0730]
实施例2
[0731]
胃癌中源自可变剪接的共有hla-a11结合肽的预测
[0732]
然后通过选择导致蛋白质序列差异(即，仅编码区)的剪接事件，将361个肿瘤相关的可变剪接事件列表减少为291个肿瘤相关多肽的列表。随后将这些291个蛋白质区域用于预测能结合hla-a11的8-11个氨基酸长的肽(总共39,876个肽)。hla-a11等位基因存在于大约40％的我们的gc患者队列中。将netmhcpan3用于预测hla结合肽，并且选出153个对hlaa11具有高亲和力的肽(排序《＝0.5％)。通过去除相似的肽，该列表进一步减少到77个肽(图10)。这77个肽对应于65个基因。
[0733]
实施例3
[0734]
胃癌中mark3剪接变体抗原的验证和共有mark3剪接变体特异性cd8 t细胞的鉴定
[0735]
为了确定gc患者是否具有靶向实施例2中鉴定的77个肽中的任何一个的cd8 t细胞，使用外周血的mhc四聚体染色对新的gc患者队列(验证队列)进行cytof筛选。cytof筛选如leong和newell(2015)所述进行。化学合成的肽由mimotopes提供，并在-20℃以干粉形式储存。通过紫外线介导的交换将这些肽加载到生物素化的hla-a11上。用三个重金属条形码标记的链霉亲和素与负载有肽的hla-a11结合，形成用于外周血染色的hla-四聚体(图7)。对源自7名胃癌患者的pbmc进行hla-a11四聚体染色(图12(a))，并结合针对epstein-bar病毒(ebv)病毒抗原的对照肽作为阳性对照(图13)。在这7个样品中，发现其中1名患者sc020对能够识别从发现队列的rna-seq数据集中鉴定的肽抗原的cd8 t细胞的表达呈阳性(图12a)。该抗原由实施例2中鉴定的mark3基因的可变剪接事件产生(图11(b))。cytof研究中使用的mark3剪接变体抗原的序列是rnmsfrik(seq id no:1)，并且ebv肽序列是sscsscplsk(seq id no:2)。分析cytof数据，这些mark3特异性cd8 t细胞连同其他免疫表型和/或谱系标志物(ccr7、cd45ra、cd8a、cd38、cd127、cd57、klrg1、tigit、cd39和pd-1)显示这些t细胞不是幼稚的，并且可能代表对肿瘤应答的细胞毒性cd8 t淋巴细胞(ctl)。患者sc020对与来自ebv的阳性对照肽反应的t细胞也呈阳性(图13)。通过使用荧光标记的mark3-a11-rnmsfrik肽四聚体的facs分析，进一步证实了在来自胃癌患者sc020的新鲜pbmc分离物中存在mark3剪接变体抗原(图12(b))。mark3特异性cd8 t细胞的频率显示
cytof和facs分析之间的高度一致性。
[0736]
实施例4
[0737]
gc患者中共有的mark3剪接变体抗原的计算机模拟鉴定
[0738]
分析对应于77个肽的肿瘤相关的可变剪接事件以确定在gc患者亚群中显示高频率可变剪接且共有的事件(图11(b)，其中最高频率为185次发生)。19名gc患者中3名至12名不等发生共有可变剪接事件。发现19名gc患者中有4名存在mark3剪接变体(图11(b)中的箭头)。在cytof筛选中获得的7个样品中有单个阳性命中(14％)对应于发现队列中观测到的mark3剪接变体的频率(4/19患者)，从而证实它是gc患者亚群共有的一种剪接变体抗原。在观测到mark3异常剪接的4名患者中，正常样品的psi值为0.05、0.05、0.04和0.06，而肿瘤样品的psi值为0.67、0.50、0.26和0.28(图14a)。psi中位数变化为-0.335；这表明肿瘤样品中33.5％的转录本含有外显子纳入(表1中的外显子24)，该外显子编码cytof筛选中鉴定的mark3肽的一部分。
[0739]
为了通过实验验证该mark3剪接同等型的存在，查询ensembl数据库以鉴定mark3的剪接变体(图14b)。这显示存在许多并入外显子24的mark3剪接同等型(图14(b)和图14(c))。在侧翼区域设计引物(mark3f:tcccatgaagccacaccattg(seq id no:3)和mark3r:agcgtagggatcgaggctttg(seq id no:4))以鉴定哪种mark3剪接同等型是表达的。
[0740]
使用rt-pcr确认gc细胞系中存在mark3剪接变体(图14(c))。pcr产物在tbe-page凝胶上按大小分离并可视化。16个gc细胞系中有6个(用星号标记的细胞系)主要表达携带先前在cytof筛选中鉴定的肽的mark3基因的剪接同等型，进一步证明它是gc患者亚群共有的标志性抗原。使用pcr产物强度的密度测定法进行gc细胞系中mark3同等型表达的定量，如图14(d)所示。表达增加水平的mark3同等型1和3的gc细胞系包括hfe145、snu1、ges1、hs738t、hs746t和hgc-27(这些细胞系中mark3同等型1和3分别占所有同等型的71.0％、68.7％、30.1％、96.1％、44.7％和49.1％)。大多数其他胃细胞系表达10％或更少的mark3同等型1和3。此外，非gc细胞系中mark3同等型1和3表达极少或未见表达。
[0741]
表1
[0742]
[0743][0744]
实施例5
[0745]
共有剪接变体抗原用于检测(诊断)目的
[0746]
可将共有剪接变体抗原(如，mark3)用于检测(诊断)目的。对于mark3的情况，从ffpe样品中提取rna，并使用基因特异性引物(mark3r，seq id no:4)将其转化为cdna。mark3剪接变体使用rt-pcr(mark3f(seq id no:3)和mark3r(seq id no:4))来检测。随后用dna凝胶电泳来鉴定存在哪些mark3同等型，而且定量这些样品中所有mark3同等型中mark3同等型1和3的百分比(图14(e))。样品包括gc肿瘤或来自肥胖患者(非癌性)的肥胖治疗的胃组织的ffpe样品。使用pcr产物强度的密度测定法进行mark3同等型的定量。肥胖治疗性胃ffpe样品含有低水平的这些同等型，低于5％，而20个gc ffpe样品中有7个含有超过10％的这些同等型(图14(e)中加下划线的样品)。
[0747]
使用上述方法可将其他共有剪接变体抗原(如，nbpf9、pard3、zc3hav1、yaf2、
camkk1、lrr1、znf670、grina或mzf1)类似地用于检测(诊断)目的。
[0748]
实施例6
[0749]
共有抗原定向的t细胞的扩增
[0750]
可离体扩增具有共有剪接变体抗原(如，mark3)的t细胞。对于mark3的情况，pbmc获自健康供体。将这些pbmc的等分试样用于分离单核细胞(人单核细胞分离试剂盒，stemcell technologies)，随后分化成树突细胞(immunocult树突细胞培养试剂盒，stemcell technologies)。这些单核细胞来源的树突细胞用丝裂霉素c(30μg/ml)处理以防止这些细胞的生长。随后这些树突细胞负载mark3肽并用作抗原呈递细胞。从pbmc的另一个等分试样中分离出cd8 t细胞(easysep人cd8 t细胞分离试剂盒，stemcell technologies)，并将这些细胞与抗原呈递细胞共培养以刺激mark3特异性t细胞的扩增。为了产生足够数目的mark3特异性t细胞进行功能表征或tcr鉴定，可将负载mark3肽的源自单核细胞的树突细胞或人工抗原呈递细胞用于进一步刺激mark3特异性t细胞的扩增。可将使用上述方法扩增的mark3特异性t细胞用于治疗患者。
[0751]
使用上述方法可将具有其他共有剪接变体抗原(如，nbpf9、pard3、zc3hav1、yaf2、camkk1、lrr1、znf670、grina或mzf1)的t细胞类似地分离和扩增。
[0752]
实施例7
[0753]
在gc中应答共有mark3剪接变体抗原的cd8 t淋巴细胞的功能意义
[0754]
mark3抗原和cd8 t淋巴细胞的表征首先通过确定mark3特异性ctl是否可在健康供体pbmc中扩增来进行(如实施例6所示)。图15(a)显示来自健康供体的用或未用mark3肽刺激的pbmc中ifn-γ的elispot测定结果。ctl仅在识别其同类抗原时才分泌ifn-γ。从该图中，仅在用mark3肽刺激pbmc时才观测到分泌ifn-γ的ctl。这表明mark3剪接变体抗原具有抗原性并且可刺激mark3特异性ctl的扩增。
[0755]
为了表明肿瘤细胞表达mark3抗原并且mark3特异性ctl可靶向这些肿瘤细胞，将mark3特异性ctl用于测试它们杀伤表达mark3剪接变体抗原(49.1％的mark3同等型包含同等型1和3，图14(d))的gc细胞系(hgc-27，实施例14中所鉴定)的能力。原始hgc-27细胞系(riken细胞库：rcb0500)不表达hla-a11，但使用慢病毒转导产生表达hla-a11的稳定hcg-27细胞系。只有携带hla-a11等位基因和mark3-sv mrna转录本两者的肿瘤细胞被mark3-svp刺激的ctl杀伤。相反地，表达mark3-sv mrna转录本但不表达hla-a11 mhc等位基因的肿瘤细胞未被mark3-svp刺激的ctl杀伤(图15(b))。
[0756]
实施例8
[0757]
mark3共有抗原定向的t细胞的分离
[0758]
为了分离mark3特异性t细胞，与负载mark3肽的树突细胞共培养的cd8 t细胞(如实施例6所示)首先用mark3五聚体-pe(定制五聚体，proimmune)染色，然后用抗-cd3-fitc和抗-cd8a-apc.bd染色。图16显示使用facsaria iii分离mark3特异性cd8 t细胞的细胞分选程序的门控策略。将单细胞分选到含有1.5μl裂解缓冲液(5单位rnase抑制剂、0.2％tritonx-100、0.5mm dntp混合物、0.1μm trac引物：gaccagcttgacatcacag(seq id no:9)、以及0.1μm trbc引物:ctcaggcagtatctggagtcattg(seq id no:10))的pcr板中。随后使用来自单细胞分选的mark3特异性t细胞的裂解物在2.5μl反应(superscript iii逆转录酶，thermo fisher scientific)中通过逆转录来制备cdna。
[0759]
实施例9
[0760]
mark3特异性tcr(tra和trb链)的扩增和测序
[0761]
tra和trb链序列通过嵌套pcr(pcr1和pcr2)获得。用于两轮pcr的trav和trbv引物描述于wang等(2012)sci.transl med(表s1，用于pcr1的外部引物和用于pcr2的内部引物)。用于两种pcr的trac和trbc引物是：
[0762]
trac pcr1:tgctgttgttgaaggcgtttg(seq id no:11)；
[0763]
trac pcr2:tgttgctcttgaagtccatag(seq id no:12)；
[0764]
trbc pcr1:cccactgtgcacctccttc(seq id no:13)；和
[0765]
trbc pcr2:ttctgatggctcaaacacag(seq id no:14)。
[0766]
第一种pcr通过使用从单细胞分选的mark3特异性t细胞制备的cdna并结合trav和trbv外部引物(各0.1μm)、trac pcr1(0.4μm)和trbc pcr1(0.4μm)来完成。然后在两个单独的pcr反应中将pcr1用作第二种pcr的模板以生成tra和trb pcr产物。将trav内部引物(各0.1μm)和trac pcr2(0.4μm)用于获得tra序列，而trbv内部引物(各0.1μm)和trbc pcr2(0.4μm)用于获得trb序列。
[0767]
通过凝胶电泳分析第二种pcr后的tra和trb的pcr产物，以鉴定成功扩增tra和trb的克隆(图17)。然后这些tra和trbpcr产物分别使用trac pcr2和trbc pcr2引物通过sanger测序(bigdye terminator v3.1，thermo fisher scientific)进行测序。
[0768]
使用imgt数据库分析tra和trb序列以鉴定v、j和cdr3区域。根据该分析，在一个克隆中鉴定出由trav6*03、traj9*01和包含氨基酸“capytggfktif”(seq id no:20)的cdr3组成的tra序列、和由trbv7-9*01、trbj1-2*01和包含氨基酸“casssprvgygytf”(seq id no:28)的cdr3组成的trb序列(见下文)。
[0769]
mark3 tra链
[0770]
trav6*01aa序列：
[0771]
mesflggvllilwlqvdwvksqkieqnsealniqegktatltcnytnyspaylqwyrqdpgrgpvflllirenekekrkerlkvtfdttlkqslfhitasqpadsatyl(seq id no:15)
[0772]
traj9*01aa序列:
[0773]
gagtrlfvkan(seq id no:16)
[0774]
cdr1 aa序列:
[0775]
nyspay(seq id no:17)
[0776]
cdr2 aa序列
[0777]
ireneke(seq id no:18)
[0778]
cdr3核苷酸序列:
[0779]
tgtgctccgtatactggaggcttcaaaactatcttt(seq id no:19)
[0780]
cdr3 aa序列:
[0781]
capytggfktif(seq id no:20)
[0782]
mark3 tra可变区aa序列
[0783]
mesflggvllilwlqvdwvksqkieqnsealniqegktatltcnytnyspaylqwyrqdpgrgpvflllirenekekrkerlkvtfdttlkqslfhitasqpadsatylcapytggfktifgagtrlfvkan(seq id no:21)
[0784]
mark3 tra aa序列
[0785]
mesflggvllilwlqvdwvksqkieqnsealniqegktatltcnytnyspaylqwyrqdpgrgpvflllirenekekrkerlkvtfdttlkqslfhitasqpadsatylcapytggfktifgagtrlfvkaniqnpdpavyqlrdskssdksvclftdfdsqtnvsqskdsdvyitdktvldmrsmdfksnsavawsnksdfacanafnnsiipedtffpspesscdvklveksfetdtnlnfqnlsvigfrilllkvagfnllmtlrlwss(seq id no:22)
[0786]
mark3 trb链
[0787]
trbv7-9*01 aa序列:
[0788]
mgtsllcwmalcllgadhadtgvsqnprhkitkrgqnvtfrcdpisehnrlywyrqtlgqgpefltyfqneaqleksrllsdrfsaerpkgsfstleiqrteqgdsamyl(seq id no:23)
[0789]
traj1-2*01 aa序列:
[0790]
gsgtrltvv(seq id no:24)
[0791]
cdr1 aa序列
[0792]
sehnr(seq id no:25)
[0793]
cdr2 aa序列
[0794]
fqnea(seq id no:26)
[0795]
cdr3核苷酸序列:
[0796]
tgtgccagcagctccccccgggttggctatggctacaccttc(seq id no:27)
[0797]
cdr3 aa序列:
[0798]
casssprvgygytf(seq id no:28)
[0799]
mark3 trb可变区aa序列
[0800]
mgtsllcwmalcllgadhadtgvsqnprhkitkrgqnvtfrcdpisehnrlywyrqtlgqgpefltyfqneaqleksrllsdrfsaerpkgsfstleiqrteqgdsamylcasssprvgygytfgsgtrltvv(seq id no:29)
[0801]
mark3 trb aa序列
[0802]
mgtsllcwmalcllgadhadtgvsqnprhkitkrgqnvtfrcdpisehnrlywyrqtlgqgpefltyfqneaqleksrllsdrfsaerpkgsfstleiqrteqgdsamylcasssprvgygytfgsgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgradcgftsvsyqqgvlsatilyeillgkatlyavlvsalvlmamvkrkdsrg(seq id no:30)
[0803]
实施例10
[0804]
检测mark3剪接变体特异性t淋巴细胞用于治疗群体中表达mark3剪接变体的癌症患者
[0805]
将负载mark3肽的hla-a11四聚体用于确定gc患者是否具有mark3特异性t淋巴细胞。图12(a)中的柱状图显示，7名gc患者中的1名(患者sc020)具有识别mark3 sva的t淋巴细胞。可将患者sc020中的这些mark3特异性t淋巴细胞进一步扩增用于治疗携带特征性mark3 sva的胃癌。存在于其他mark3剪接变体表达阳性患者中的mark3特异性t淋巴细胞的扩增可如实施例6所述进行。
[0806]
实施例11
[0807]
hnsc中mark3剪接事件的鉴定
no:37)和sirqafirk(seq id no:38)。可在2名患者中检测到这些sva的2种，即nbpf9和znf670，进一步表明这些sva在患者之间是共有的且具有免疫原性。导致这些sva的剪接事件的发生、δpsi和类型如图20(a)所示。在两个不同的crc患者队列(发现队列和验证队列)中都检测到这些sva的全部4种。
[0820]
异常剪接的外显子或内含子和肿瘤相关同等型的坐标如图20(b)所示。对于导致nbpf9 sva的剪接事件，它是产生内含子(chr1:144826287:144826932: )保留的内含子保留事件。这产生包含内含子的转录本(chr1:144826235:144827105: )。对于导致pard3 sva的剪接事件，它是5'剪接位点的可变使用，产生包含外显子的转录本(chr10:34625127:34625171:-和chr10:34626206:34626354:-)。对于导致zc3hav1 sva的剪接事件，它也是5'剪接位点的可变使用，产生包含外显子的转录本(chr7:138763298:138763399:-和chr7:138763850:138764989:-)。对于导致yaf2 sva的剪接事件，它是3'剪接位点的可变使用，产生包含外显子的转录本(chr12:42604350:42604421:-和chr12:42631401:42631526:-)。对于导致camkk1 sva的剪接事件，它是产生外显子(chr17:3784921-3784942:-(seq id no:39))跳跃的外显子跳跃/纳入事件。这产生包含外显子的转录本(chr17:3785822-3785858:-和chr17:3783640-3783728:-)。对于导致lrr1 sva的剪接事件，它是产生外显子(chr14:50074118-50074839: (seq id no:42))跳跃的外显子跳跃/纳入事件。这产生包含外显子的转录本(chr14:50069088-50069186: 和chr14:50080974-50081389: )。对于导致znf670 sva的剪接事件，它是产生外显子(chr1:247130997-247131094:-(seq id no:45))跳跃的外显子跳跃/纳入事件。这导致包含外显子的转录本(chr1:247151423-247151557:-和chr1:247108849-247109129:-)。对于导致grina sva的剪接事件，它是产生除去内含子(chr8:145065973:145066412: )的内含子保留事件。这产生不包含内含子的转录本(chr8:145065860-145065972: 和chr8:145066413-145066541: )。上述所有坐标均基于grch37/hg19基因组组装。
[0821]
实施例14
[0822]
结直肠癌中共有候选抗原及其同类t细胞的鉴定和验证
[0823]
图19a显示在结直肠癌中鉴定和验证共有候选抗原及其同类抗原特异性t细胞的工作流程。如实施例12所述鉴定来自产生hla-a11结合肽的异常剪接的共有候选抗原。将使用这些hla-a11结合肽的免疫筛选用于确定crc患者是否对这些候选抗原具有任何免疫应答(如实施例13所示)。从该免疫筛选中，发现crc患者具有针对27个剪接变体肽的抗原特异性t细胞。通过在结直肠癌细胞系中进行rt-pcr，对于这些靶标中的9个，证实了剪接变体的表达产生剪接变体肽。还发现对于这9个靶标，与正常组织相比，一些癌细胞系具有增加的肿瘤相关剪接变体的表达。此外，与来自crc患者的邻近正常组织样品相比，这些靶标中有4个在肿瘤组织样品中显示增加的肿瘤相关剪接变体的表达。将使用来自健康供体的cd8 t细胞的体外实验用于进一步测试这些靶标的免疫原性，发现可针对这些靶标中的3个生成抗原特异性t细胞。因此，这种方法允许快速同时鉴定共有候选抗原及其同类t细胞，从而允许快速开发t细胞治疗方案。
[0824]
实施例15
[0825]
已鉴定的肿瘤相关剪接变体存在于crc患者的多种分子亚型中
[0826]
如实施例12所述鉴定的肿瘤相关剪接变体存在于多名患者中，如图21(a)所示。这
些肿瘤相关剪接变体通过简单地添加或省略氨基酸或者通过改变蛋白质阅读框产生新的蛋白质序列来引起蛋白质序列的变化(图5)。源自体细胞点突变的新抗原主要见于微卫星不稳定(msi)的crc患者(主要是共识分子亚型(cms)1)。相反地，对于本发明的肿瘤相关剪接变体(除了存在于多名crc患者中以外)，个体患者具有相似数目的肿瘤相关剪接变体存在，无论它们的微卫星或cms状态如何(图21(b))。
[0827]
实施例16
[0828]
crc中camkk1剪接变体抗原的验证
[0829]
如实施例12和13所述鉴定结合hla-a11的camkk1剪接变体肽(seq id no:35)。在发现队列中，37名crc患者中有9名观测到camkk1的异常剪接，并且肿瘤和正常样品之间的psi中位数变化为0.473(图20(a))。
[0830]
来自crc患者的个体正常(norm)和肿瘤(tum)样品的psi值示于图22(a)中。该图中仅显示具有足够接合点计数的样品。图22(b)显示正常和肿瘤异常值样品的sashimi图(同样如实施例1所述)；每个sashimi图都显示这些样品的平均读段密度。肿瘤样品的sashimi图显示增加的外显子跳跃。已鉴定的camkk1的肿瘤相关剪接事件由外显子(chr17:3784921-3784942:-,seq id no:39)的跳跃组成。
[0831]
为了通过实验验证crc中camkk1剪接同等型的存在，对细胞系和来自3名crc患者的组织样品(匹配的肿瘤和邻近正常样品)进行rt-pcr(图22(c))。在侧翼区设计引物(camkk1f:gaagctggaccacgtgaatgtg(seq id no:40)和camkk1r:agtactcgaggcccaggatgac(seq id no:41))以鉴定表达了哪种camkk1剪接同等型。这些引物结合已鉴定的可变剪接外显子侧翼的序列。基于grch37/hg19基因组组装，还有另一个外显子也是可变剪接的。除了这里确定的这两个剪接同等型外，还可从这两个可变剪接的外显子的差异剪接中产生另外两个剪接同等型(图22(c))。肿瘤相关剪接变体的pcr产物大小为277bp和163bp。
[0832]
证实与正常结肠组织相比，163bp camkk1肿瘤相关剪接变体在许多crc细胞系(hct15、hct116和sw480)中表达更高(图22(d))。使用分离自3名不同crc患者的匹配的邻近正常和肿瘤组织的rna，制备cdna并用于rt-pcr以检测camkk1剪接同等型。这些crc患者中的2名显示增加的camkk1肿瘤相关剪接同等型的表达(图22(d))。如实施例5所述，可将该rt-pcr用于检测或诊断目的。
[0833]
已鉴定的camkk1肿瘤相关剪接变体涉及具有22个核苷酸的外显子(seq id no:39)的跳跃。该外显子的可变剪接基于当前的基因注释(gencode版本34或refseq)之前未观测到，并且其代表了新的剪接同等型。如图22(c)所示，该外显子的跳跃导致下游外显子的阅读框变化，从而导致形成图20(a)中鉴定的hla-a11结合肽。
[0834]
实施例17
[0835]
crc中lrr1剪接变体抗原的验证
[0836]
如实施例12和13所述鉴定了结合hla-a11的lrr1剪接变体肽(seq id no:36)。在发现队列中，37名crc患者中有6名观测到lrr1的异常剪接，并且肿瘤和正常样品之间的psi中位数变化为0.249(图20(a))。
[0837]
来自crc患者的个体正常和肿瘤样品的psi值示于图23(a)中。该图中仅显示具有足够接合点计数的样品。图23(b)显示正常和肿瘤异常值样品的sashimi图(如实施例1所述)，每个sashimi图显示这些样品的平均读段密度。肿瘤样品的sashimi图显示增加的外显
子跳跃。已鉴定的lrr1的肿瘤相关剪接事件由外显子(chr14:50074118-50074839: ，seq id no:42)的跳跃组成。
[0838]
为了通过实验验证crc中lrr1剪接同等型的存在，对细胞系和来自3名crc患者的组织样品(匹配的肿瘤和邻近正常样品)进行rt-pcr(图23(c))。在侧翼区域设计引物(lrr1f:tgagggggaaagccactgttc(seq id no:43)和lrr1r:ttcagacagaatcttccacaaacac(seq id no:44))以鉴定表达哪种lrr1剪接同等型。这些引物结合已鉴定的lrr1可变剪接外显子侧翼的序列，并且肿瘤相关剪接变体为148bp。
[0839]
证实与正常结肠组织相比，存在的lrr1肿瘤相关剪接变体在许多crc细胞系(colo-205、dld-1、hct15、hct116、ht29、rko和sw480)中表达更高(图23(c))。使用分离自3名不同crc患者的匹配的邻近正常和肿瘤组织的rna，制备cdna并用于rt-pcr以检测lrr1剪接同等型。这些crc患者中的2名显示增加的lrr1肿瘤相关剪接同等型表达(图23(c))。同样，如实施例5所述，可将该rt-pcr用于检测或诊断目的。
[0840]
实施例18
[0841]
crc中znf670剪接变体抗原的验证
[0842]
如实施例12和13所述鉴定了结合hla-a11(seq id no:37)的znf670剪接变体肽。在发现队列中，37名crc患者中有8名观测到znf670的异常剪接，并且肿瘤和正常样品之间的psi中位数变化为0.362(图20(a))。
[0843]
来自crc患者的个体正常和肿瘤样品的psi值示于图24(a)中。该图中仅显示具有足够接合点计数的样品。图24(b)显示正常和肿瘤异常值样品的sashimi图(同样如实施例1所述)，每个sashimi图显示这些样品的平均读段密度。肿瘤样品的sashimi图显示增加的外显子跳跃。已鉴定的znf670肿瘤相关剪接事件由外显子(chr1：247130997-247131094：-，seq id no:45)的跳跃组成。
[0844]
为了通过实验验证crc中znf670剪接同等型的存在，对细胞系和来自3名crc患者的组织样品(匹配的肿瘤和邻近正常样品)进行rt-pcr(图24(c))。在侧翼区域设计引物(znf670f:ttcattccaaaaagtgatgctgag(seq id no:46)和znf670r:caacatggaagaacaatcttcctttc(seq id no:47))以鉴定表达了哪种znf670剪接同等型。这些引物结合已鉴定的znf670可变剪接外显子侧翼的序列，并且肿瘤相关剪接变体为283bp。
[0845]
证实与正常结肠组织相比，存在的znf670肿瘤相关剪接变体在许多crc细胞系(dld-1、hct15和hct116)中表达更高(图24(c))。使用分离自3名不同crc患者的匹配的邻近正常和肿瘤组织的rna，制备cdna并用于rt-pcr以检测znf670剪接同等型。这些crc患者中的2名显示增加的znf670肿瘤相关剪接同等型表达(图24(c))。如实施例5所述，可将该rt-pcr用于检测或诊断目的。
[0846]
已鉴定的znf670肿瘤相关剪接变体涉及具有98个核苷酸的外显子(seq id no:45)的跳跃。该外显子的可变剪接基于当前的基因注释(gencode版本34或refseq)之前未观测到，并且其代表了新的剪接同等型(图24(d))。如图24(d)所示，该外显子的跳跃导致下游外显子的阅读框变化，从而导致形成图20(a)中鉴定的hla-a11结合肽。
[0847]
实施例19
[0848]
crc中grina剪接变体抗原的验证
[0849]
如实施例12和13所述鉴定了结合hla-a11的grina剪接变体肽(seq id no:38)。在
发现队列中，37名crc患者中有10名观测到grina的异常剪接，并且在肿瘤和正常样品之间的psi中位数变化为0.248(图20(a))。
[0850]
来自crc患者的个体正常和肿瘤样品的psi值示于图25(a)中。该图中仅显示具有足够接合点计数的样品。图25(b)显示正常和肿瘤异常值样品的sashimi图(如实施例1所述)；每个sashimi图都显示这些样品的平均读段密度。肿瘤样品的sashimi图显示增加的一个内含子的切除。已鉴定的grina肿瘤相关剪接事件由内含子(chr8：145,065,973-145,066,412: ，seq id no:48)的切除组成。
[0851]
为了通过实验验证crc中grina剪接同等型的存在，对细胞系和来自3名crc患者的组织样品(匹配的肿瘤和邻近正常样品)进行rt-pcr(图25(c))。在侧翼区域设计引物(grinaf:ggtcccccatcctactatgacaac(seq id no:49)和grinar:gaatggcgaagatgaagagcac(seq id no:50))以鉴定表达了哪种grina剪接同等型。这些引物与已鉴定的grina异常剪接事件侧翼的序列结合，并且肿瘤相关剪接变体为286bp。
[0852]
证实与正常结肠组织相比，存在的grina肿瘤相关剪接变体在一种crc细胞系(hct116)中表达(图25(c))。使用分离自3名不同crc患者的匹配的邻近正常和肿瘤组织的rna，制备cdna并用于rt-pcr以检测grina剪接同等型。这些crc患者中的2名显示增加的grina肿瘤相关剪接同等型表达(图25(c))。同样，如实施例5所述，可将该rt-pcr用于检测或诊断目的。
[0853]
实施例20
[0854]
鉴定的crc hla-a11 svp的免疫原性
[0855]
lrr1、grina和znf670的抗原特异性t细胞最初在svp/hla-a11四聚体cytof筛选中鉴定(如实施例13所述)。通过测试抗原特异性t细胞是否可在hla-a11阳性的健康供体的pbmc中扩增，进一步评估这些靶标的免疫原性。pbmc获自健康供体，并将等分试样用于分离随后分化为树突状细胞的单核细胞(cd14阳性选择试剂盒，stemcell technologies)。简而言之，单核细胞向树突状细胞的分化通过用il4(10ng/ml)和gm-csf(800iu/ml)培养分离的cd14细胞3天，并用il4(10ng/ml)、gm-csf(800iu/ml)、lps(10ng/ml)、ifn-γ(100iu/ml)和lrr1、grina和znf670 hla-a11 svp(2.5μm)过夜使树突状细胞成熟来进行。然后使用easysep cd8t细胞分离试剂盒(stemcell technologies)将这些单核细胞衍生的树突细胞与分离自同一供体的pbmc的另一等分试样的cd8 t细胞一起培养。共培养10天后，抗原特异性t细胞的扩增通过用已负载lrr1、grina和znf67 0hla-a11 svp的四聚体(用pe和apc标记)染色来检测。图26显示对于lrr1、grina和znf670的抗原特异性t细胞的facs分析结果；预期这些抗原特异性t细胞对pe和apc呈双阳性。在来自健康供体的未刺激pbmc的cd8 t细胞中未观测到这些svp的抗原特异性t细胞，而当它们与单核细胞来源的已负载svp的树突状细胞共培养时可观测到svp特异性t细胞。总之，对于lrr1、grina和znf670的抗原特异性cd8 t细胞能够在健康供体中产生，表明这些svp具有免疫原性。
[0856]
实施例21
[0857]
结直肠癌患者中来自共有可变剪接变体的hla-a24结合肽的预测和剪接变体特异性cd8 t细胞的鉴定
[0858]
如实施例12所述，鉴定了源自能够结合hla-a24的共有可变剪接变体的肽。根据该分析，鉴定了75个能够结合hla-a24的svp。这些svp源自患者亚组中共有的55个剪接事件。
[0859]
为了确定crc患者是否具有靶向结合hla-a24的75个svp中的任何一个的cd8 t细胞，使用pbmc的mhc四聚体染色对10名hla-a24阳性crc患者的新队列(验证队列)进行cytof筛选(执行此筛选的过程类似于实施例13所述的过程)。总体而言，由该筛选鉴定出靶向8个剪接变体肽的抗原特异性cd8 t细胞。图27(a)显示这些sva靶标中的2个的肽序列、抗原特异性cd8 t细胞的频率、psi中位数变化、发生率和外显子坐标的总结。
[0860]
这些sva源自具有以下肽序列的lrr1和mzf1的异常剪接：syhsipslprf(seq id no:51)和kwppatetl(seq id no:52)。在两个不同的crc患者队列(发现队列和验证队列)中都检测到这两个sva。
[0861]
异常剪接的外显子或内含子和肿瘤相关同等型的坐标如图27(b)所示。对于导致lrr1 sva的剪接事件，它是产生外显子(chr14:50074118-50074839: (seq id no:42))跳跃的外显子跳跃/纳入事件。
[0862]
这产生跳跃该外显子的转录本(chr14:50069088-50069186: @chr14:50080974-50081389: )。对于导致mzf1 sva的剪接事件，它是产生内含子(chr19:59,081,895-59,082,360:-(seq id no:53))保留的内含子保留事件。这产生包含内含子保留事件的转录本(chr19:59081711-59082796:-)。上述所有坐标均基于grch37/hg19基因组组装。
[0863]
实施例22
[0864]
候选抗原区可产生结合不同hla等位基因的肽
[0865]
lrr1候选抗原区由于剪接改变引起的框改变而相对较大(如实施例1所述和图5所示)。lrr1候选抗原区产生结合hla-a11和hla-a24的两个肽(seq id no:36和seq id no:51)(图23(d))。在不同crc患者中检测到来自同一剪接事件的这2个svp的抗原特异性t细胞(图20和图27)。这进一步表明这个sva在患者以及不同hla类型之间是共有的且具有免疫原性。
[0866]
实施例23
[0867]
crc中mzf1剪接变体抗原的验证
[0868]
如实施例12和13所述鉴定了结合hla-a24的mzf1剪接变体肽(seq id no:52)。在发现队列中，37名crc患者中有6名观测到mzf1的异常剪接，并且肿瘤和正常样品之间的psi中位数变化为-0.228(图27(a))。
[0869]
来自crc患者的个体正常和肿瘤样品的psi值示于图28(a)中。该图中仅显示具有足够接合点计数的样品。图28(b)显示正常和肿瘤异常值样品的sashimi图(如实施例1所述)；每个sashimi图都显示这些样品的平均读段密度。肿瘤样品的sashimi图显示增加的外显子跳跃。已鉴定的mzf1的肿瘤相关剪接事件显示内含子(chr19:59081895-59082360:-，seq id no:53)的保留。
[0870]
为了通过实验验证crc中mzf1剪接同等型的存在，对细胞系和来自3名crc患者的组织样品(匹配的肿瘤和邻近正常样品)进行rt-pcr(图28(c))。在侧翼区设计引物(mzf1f:gcactgccccctgagatccag(seq id no:54)和mzf1r:ctttcacctgcaggcccagtg(seq id no:55))以鉴定表达哪种mzf1剪接同等型。这些引物结合mzf1可变剪接事件侧翼的序列，并且肿瘤相关剪接变体为737bp。
[0871]
证实与正常结肠组织相比，存在的mzf1肿瘤相关剪接变体在许多crc细胞系(hct15、hct116、ht29和sw480)中表达更高(图28(c))。使用分离自3名不同crc患者的匹配
的邻近正常和肿瘤组织的rna，制备cdna并用于rt-pcr以检测mzf1剪接同等型。这些crc患者的1名显示增加的mzf1肿瘤相关剪接同等型表达(图28(c))。如实施例5所述，可将该rt-pcr用于检测或诊断目的。
[0872]
实施例24
[0873]
头和颈鳞状细胞癌中共有候选抗原及其同类t细胞的鉴定
[0874]
头和颈鳞状细胞癌(hnsc)原发性肿瘤样品(31)，和匹配的正常样品(16)取自邻近肿瘤的非恶性组织，这些样品构成了发现队列。对这些样品进行深度rna测序(1亿个双端读段)和使用rmat的mrna剪接分析(仅使用映射到剪接点的测序读段进行分析)，以鉴定肿瘤相关可变剪接事件。应用了选择标准(至少20％的剪接变化(δpsi)、至少5名患者中发生以及纳入/跳跃的接合点计数必须》5)，这产生了导致蛋白质编码变化的1418个剪接事件的列表。
[0875]
将在hnsc患者亚群或亚组中共有的这些肿瘤相关剪接变体用于鉴定候选抗原区(图29(a)和图29(b))。然后将来自这些肿瘤相关剪接变体的候选抗原区用于鉴定可结合常见hla等位基因(hla-a02；hla-a11；和hla-a24)的8-11个氨基酸长的肽(图29(c))。将netmhcpan 3和4用于鉴定这些8-11个氨基酸长的肽(如实施例12所述)。其中一些肿瘤相关剪接事件包含一个或多个结合不同hla等位基因的肽。这在crc svp/四聚体cytof筛选中鉴定的lrr1 sva中也类似地观测到(如实施例22所述)，从而突出了鉴定候选抗原区的效用。
[0876]
实施例25
[0877]
结直肠癌中鉴定的共有抗原还存在于头和颈鳞状细胞癌中
[0878]
交叉引用hnsc中存在的肿瘤相关剪接变体表明，最初在crc svp/四聚体cytof筛选中鉴定的camkk1、lrr1和grina svp(seq id no:35,seq id no:36,seq id no:51和seq id no:38)(如实施例13和实施例21所述)也存在于hnsc中。hnsc患者中这些sva的发生率和psi变化示于图30中。
[0879]
来自hnsc患者的个体正常和肿瘤样品的psi值以及hnsc患者中camkk1的sashimi图示于图22(f)和图22(g)中。camkk1的肿瘤相关剪接变体也能够在源自hnsc患者的细胞系中检测到(图22(h))。来自hnsc患者的个体正常和肿瘤样品的psi值以及hnsc患者中lrr1的sashimi图示于图23(e)和图23(f)中。lrr1的肿瘤相关剪接变体也能够在源自hnsc患者的细胞系中检测到(图23(g))。来自hnsc患者的个体正常和肿瘤样品的psi值和hnsc患者中grina的sashimi图示于图25(d)和图25(e)中。grina的肿瘤相关剪接变体也能够在源自hnsc患者的细胞系中检测到(图25(f))。在两种不同的癌症类型中都检测到这些sva的全部3个。
[0880]
实施例26
[0881]
表征和/或治疗患者中的剪接变体抗原(sva)阳性癌症
[0882]
患有复发性/难治性或转移性癌症的患者可能表达剪接变体抗原，如mark3。例如，可测试癌组织样品的mark3表达。这可通过如实施例5中所述的rt-pcr来完成。也可测试患者的hla(如，hla-a11)的表达。
[0883]
患者的治疗可通过如实施例6所述地扩增来自患者的剪接变体抗原特异性t淋巴细胞(如，mark3特异性t淋巴细胞)，并将这些扩增的t淋巴细胞施用回患者来进行。
[0884]
在施用这些t淋巴细胞之前，患者可用环磷酰胺(cyclophosphosamide)和氟达拉
滨(fludarabine)治疗。
[0885]
患有表达其他剪接变体抗原(如，nbpf9、pard3、zc3hav1、yaf2、camkk1、lrr1、znf670、grina或mzf1)的复发性/难治性或转移性癌症的患者可进行类似的表征和/或治疗。
[0886]
参考文献
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