一种己酮糖激酶抑制剂及其制备方法与流程

1.本公开属于医药领域，具体涉及一种己酮糖激酶抑制剂及其制备方法。


背景技术：

2.代谢综合症通常被定义为反映营养和久坐生活方式的一系列疾病，其表现包括t2dm，非酒精性脂肪肝疾病(nafld)，肥胖，血脂异常，心力衰竭和肾脏疾病。nafld代表了一系列肝脏疾病，可导致进行性nash，纤维化，最终导致肝细胞癌和肝功能衰竭。据估计，在接下来的20年中，nafld将成为肝脏相关发病率和死亡率的主要原因，也是肝移植的主要指征。
3.由于饮料和加工食品中糖添加(通常是蔗糖和高果糖玉米糖浆)不断增加，导致现代人饮食中果糖的含量增加。高果糖摄入已被证明会引起许多不良代谢作用，它在肥胖和代谢综合征的发展中具有一定的作用，如体重增加，高脂血症，高血压和胰岛素抵抗。
4.己酮糖激酶(又称果糖激酶，khk)为果糖代谢的基本酶。肝脏中khk酶在atp(三磷酸腺苷)的协助下磷酸化果糖c1位，产生果糖-1-磷酸(f1p)，进入正常代谢路径；同时atp下游产生尿酸。两个替代性mrna剪切体表达的人源性己酮糖激酶(hkhk)编码两个不同区域异构体酶khk-a和khk-c。khk-c具有更低的km值，更高的kcat，高于405倍的催化效率，说明khk-c对果糖磷酸化的亲和力和能力明显比khk-a高。虽然khk-a表达广泛，khk-c分布于肝脏、肾脏、肠，但是khk-c是体内果糖的主要代谢位点。
5.在人体内，葡萄糖通过多元醇通路经过中间体山梨糖醇转化为果糖，产生内源性果糖，并且此通路的活性随高血糖症增加。研究表明敲除khk小鼠被保护免受葡萄糖诱导的体重增加、胰岛素抗性及脂肪变性，表明在高血糖病况下，内源性产生的果糖可促成胰岛素抗性及脂肪变性(lanaspa,m.a等，nature comm.4,2434,2013)。果糖是唯一在其代谢过程中产生尿酸的常见碳水化合物，同时果糖还会刺激氨基酸前体合成尿酸。因此，推测抑制khk对其中涉及内源性或摄入果糖中的任一或两者的改变的许多疾病有益处。
6.已经公开了若干khk抑制剂，例如kentaro futatsugi等公开了一种新颖的khk抑制剂pf-06835919(j.med.chem.2020,63,22,13546
–
13560)，以及wo2020051058、wo2020156445、wo2020257171公开了一系列khk抑制剂。
7.

技术实现要素：

8.本公开的目的在于提供一种作为khk抑制剂及其医药用途。
9.本公开一方面提供了式(i)所示化合物或其可药用盐，
[0010][0011]
其中，
[0012]
x、y各自独立地选自cr1’
和n，且x、y中至少一个为n；
[0013]
r1’
各自独立地选自氢、氘、卤素、羟基、巯基、硝基、氰基或任选被一个或多个取代基q1所取代的下述基团：烷基、-nr
irj
、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、烷氧基、烷硫醚基、烯基、炔基；
[0014]
r1各自独立地选自烷基、卤素、氘、羟基、巯基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、硝基、氰基、烷氧基、烷硫醚基、卤代烷基、卤代烷氧基、烯基、炔基；
[0015]
环b为碳环或杂环；
[0016]
r2各自独立地选自卤素、羟基、巯基、氘、氧代、硫代、硝基、氰基或任选被一个或多个取代基q1所取代的下述基团：烷基、-nr
irj
、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、烷氧基、烷硫醚基、烯基和炔基；
[0017]
环a选自芳基、杂芳基、稠环芳基或稠杂芳基；
[0018]
r3各自独立地选自卤素、羟基、巯基、氘、氧代、硫代、硝基、氰基、-(l)
m-c(o)ra、-(l)
m-c(o)ora、-(l)
m-conrarb、-(l)
m-conhso2ra、-(l)
m-so2ra、-(l)
m-so2nhcora、-(l)
m-ora、-(l)
m-sra、-(l)
m-nrarb、-(l)
m-nrac(o)rb、-(l)
m-nrac(o)orb、-(l)
m-s(o)nrarb、-(l)
m-nras(o)rb、-(l)
m-s(o)2nrarb、-(l)
m-nras(o)2、-(l)
m-po3ra或任选被一个或多个取代基q2所取代的下述基团：烷基、烷氧基、烷硫醚基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、稠环芳基和稠杂芳基；
[0019]
ra、rb各自独立地选自氢、氘、羟基或任选被一个或多个取代基q1所取代的下述基团：烷基、烷氧基、环烷基、杂环基、芳基和杂芳基；
[0020]
l选自其中r4、r5各自独立地选自氢、氘、卤素、烷基、羟基，或者r4、r5与相邻的碳原子共同形成任选被一个或多个取代基q1所取代的3至12元环烷基或3至12元杂环基，t选自nh、o、s或不存在，x各自独立地选自0-6的整数；
[0021]
取代基团q1、q2各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、巯基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、3至10元环烷基、3至10元杂环基、6至10元芳基、5至10元杂芳基、8至12元稠环芳基和5至12元稠杂芳基；
[0022]ri
、rj各自独立地选自氢原子、羟基、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基；rk独立地选自氢原子、c1～c6烷基、c1～c6卤代烷基、c1～c6烷氧基、羟基、-nr
irj
，其中所述的烷基、烷氧基、卤代烷基任选被选自c1～c6烷基、卤素、羟基、巯基、-nr
irj
、氧代、硫代、羧基、硝基、氰基、c1～c6烷氧基、c1～c6烷硫醚基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、3至10元环烷基、3至10元杂环基、6至10元芳基和5至10元杂芳基中的一个或多个取代基所取代；
[0023]
z1为0-6的整数，z2、z3分别独立地为0-8的整数。
[0024]
在某些实施方式中，r1各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、卤代c
1-c6烷基、卤代c
1-c6烷氧基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基。
[0025]
在某些实施方式中，r1各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、氰基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、卤代c
1-c6烷基和卤代c
1-c6烷氧基。
[0026]
在某些实施方式中，r1各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘或羟基。
[0027]
在某些实施方式中，r1’
各自独立地选自氢、c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、巯基、-nr
irj
、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基。
[0028]
在某些实施方式中，r1’
各自独立地选自氢、c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、-nr
irj
、氰基和c
1-c6烷氧基。
[0029]
在某些实施方式中，x为n、c-h或c-cn。
[0030]
在某些实施方式中，y为n。
[0031]
在某些实施方式中，环b为3至14元碳环或3至14元杂环。
[0032]
在某些实施方式中，环b为3至10元单环烷基环、6至14元螺环烷基环、6至14元桥环烷基环、6至14元稠环烷基环、3至10元单环杂环基环，6至14元螺杂环基环、6至14元桥杂环基环或6至14元稠杂环基环，更优选为3至8元单环烷基环、6至10元螺环烷基环、6至10元桥环烷基环、6至10元稠环烷基环、3至8元单环杂环基环，6至10元螺杂环基环、6至10元桥杂环基环或6至10元稠杂环基环；最优选3至8元单环烷基环或3至8元单环杂环基环。
[0033]
在某些实施方式中，环选自
[0034][0035]
在某些实施方式中，r2各自独立地选自卤素、羟基、巯基、氘、氧代、硫代、硝基、氰基或任选被一个或多个取代基q1所取代的下述基团：c1～c6烷基、-nr
irj
、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、c1～c6烷氧基、c1～c6烷硫醚基、c2～c6烯基和c2～c6炔基。
[0036]
在某些实施方式中，r2各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘或羟基。
[0037]
在某些实施方式中，r2为氟。
[0038]
在某些实施方式中，环a选自6至10元芳基、5至10元杂芳基、8至12元稠环芳基或5至12元稠杂芳基。
[0039]
在某些实施方式中，环a选自6至10元芳基或5至10元杂芳基。
[0040]
在某些实施方式中，环a选自
[0041][0042]
在某些实施方式中，r3各自独立地选自卤素、羟基、巯基、氘、氧代、硫代、硝基、氰基、-(l)
m-c(o)ra、-(l)
m-c(o)ora、-(l)
m-conrarb、-(l)
m-ora、-(l)
m-sra、-(l)
m-nrarb、-(l)
m-nrac(o)rb、-(l)
m-nrac(o)orb或任选被一个或多个取代基q2所取代的下述基团：c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、3至10元单环烷基、6至14元螺环烷基、6至14元桥环烷基、6至14元稠环烷基、3至10元单环杂环基，6至14元螺杂环基、6至14元桥杂环基或6至14元稠杂环基、6至14元芳基、5至12元杂芳基、8至14元稠环芳基和5至14元稠杂芳基。
[0043]
在某些实施方式中，r3各自独立地选自卤素、羟基、巯基、氘、氧代、硫代、硝基、氰基、-(l)
m-c(o)ra、-(l)
m-c(o)ora、-(l)
m-conrarb、-(l)
m-ora、-(l)
m-nrarb或任选被一个或多个取代基q2所取代的下述基团：c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、3至8元单环烷基、6至10元螺环烷基、6至10元桥环烷基、6至10元稠环烷基、3至8元单环杂环基，6至10元螺杂环基、6至10元桥杂环基和6至10元稠杂环基。
[0044]
在某些实施方式中，r3各自独立地选自卤素、羟基、氘、氧代、氰基、-(l)
m-c(o)ra、-(l)
m-c(o)ora、-(l)
m-conrarb、-(l)
m-ora、-(l)
m-nrarb或任选被一个或多个取代基q2所取代的下述基团：c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、3至8元单环烷基、6至10元螺环烷基、6至10元桥环烷基、6至10元稠环烷基、3至8元单环杂环基，6至10元螺杂环基、6至10元桥杂环基和6至10元稠杂环基。
[0045]
在某些实施方式中，ra、rb各自独立地选自氢、氘、羟基或任选被一个或多个取代基q1所取代的下述基团：c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、3至8元单环烷基、3至8元单环杂环基、6至10元芳基和5至10元杂芳基。
[0046]
在某些实施方式中，l选自其中r4、r5各自独立地选自氢、氘、卤素、c
1-c6烷基、羟基，t选自nh、o、s或不存在，x各自独立地选自0-6的整数。
[0047]
在某些实施方式中，r3各自独立地选自卤素、羟基、氘、氧代、氰基、c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、
[0048][0049]
、卤代c
1-c6烷基、卤代c
1-c6烷氧基。
[0050]
在某些实施方式中，取代基团q1各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、巯基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、c
2-c6烯基或c
2-c6炔基，优选c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、-nr
irj
、氧代、-c(o)rk、-c(o)ork、氰基、c
1-c6烷氧基、c
2-c6烯基或c
2-c6炔基。
[0051]
在某些实施方式中，取代基团q2各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、巯基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、3至10元环烷基、3至10元杂环基、6至10元芳基和5至10元杂芳基，优选c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、-nr
irj
、氧代、-c(o)rk、-c(o)ork、氰基、c
1-c6烷氧基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、3至8元单环烷基或3至8元单环杂环基。
[0052]
在某些实施方式中，ri、rj各自独立地选自氢原子、羟基、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基；rk独立地选自氢原子、c1～c6烷基、c1～c6卤代烷基、c1～c6烷氧基、羟基、-nr
irj
。
[0053]
在某些实施方式中，x、y各自独立地选自cr1’
和n，且x、y中至少一个为n；
[0054]
r1’
各自独立地选自氢、c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、巯基、-nr
irj
、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基；
[0055]
r1各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、卤代c
1-c6烷基、卤代c
1-c6烷氧基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基；
[0056]
环b为3至10元碳环或3至10元杂环，优选3至8元单环烷基环或3至8元单环杂环基环；更优选5至8元单环烷基环或5至8元单环杂环基环；
[0057]
r2各自独立地选自卤素、羟基、巯基、氘、氧代、硫代、硝基、氰基或任选被一个或多个取代基q1所取代的下述基团：c1～c6烷基、-nr
irj
、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、c1～c6烷氧基、c1～c6烷硫醚基、c2～c6烯基和c2～c6炔基；
[0058]
环a选自6至10元芳基或5至10元杂芳基；
[0059]
r3各自独立地选自卤素、羟基、巯基、氘、氧代、硫代、硝基、氰基、-(l)
m-c(o)ra、-(l)
m-c(o)ora、-(l)
m-conrarb、-(l)
m-ora、-(l)
m-nrarb或任选被一个或多个取代基q2所取代的下述基团：c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、3至10元环烷基和3至10元杂环基；其中ra、rb各自独立地选自氢、氘、羟基或任选被一个或多个取代基q1所取代的下述基团：c
1-c6烷基、c
1-c6烷氧基、3至10元环烷基、3至10元杂环基、6至10元芳基和5至10元杂芳基；
[0060]
l选自其中r4、r5各自独立地选自氢、氘、卤素、c
1-c6烷基、羟基，t选自nh、o、s或不存在，x各自独立地选自0-6的整数；
[0061]
取代基团q1各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、巯基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、-c(s)rk、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
1-c6烷硫醚基、c
2-c6烯基或c
2-c6炔基；
[0062]
取代基团q2各自独立地选自c
1-c6烷基、卤素、氘、羟基、巯基、-nr
irj
、氧代、硫代、-c(o)rk、-c(o)ork、-s(o)rk、-s(o)ork、-s(o)(o)rk、-s(o)(o)ork、硝基、氰基、c
1-c6烷氧基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、3至10元环烷基、3至10元杂环基、6至10元芳基和5至10元杂芳基；
[0063]ri
、rj各自独立地选自氢原子、羟基、c1～c6烷基、c1～c6烷氧基；rk独立地选自氢原子、c1～c6烷基、c1～c6卤代烷基、c1～c6烷氧基、羟基、-nr
irj
；
[0064]
z1为0-6的整数，z2、z3分别独立地为0-8的整数。
[0065]
本公开所述的通式环系的具体举例中，未画出的取代基仍然有效。例如，环选自时，环b仍然可以被z2个r2所取代。
[0066]
在某些实施方式中，所述化合物选自
[0067]
[0068]
[0069]
[0070][0071]
或其可药用盐。
[0072]
本公开所述的“烷基”优选c
1-c6烷基。
[0073]
本公开所述的“烯基”优选c
2-c6烯基。
[0074]
本公开所述的“炔基”优选c
2-c6炔基。
[0075]
本公开所述的“亚烷基”优选c
1-c6亚烷基。
[0076]
本公开所述的“亚链烯基”优选c
2-c6亚链烯基。
[0077]
本公开所述的“亚链炔基”优选c
2-c6亚链炔基。
[0078]
本公开所述的“烷氧基”优选c
1-c6烷氧基。
[0079]
本公开所述的“烷硫醚基”优选c
1-c6烷硫醚基。
[0080]
本公开所述的“环烷基”优选3至12元，更优选3至10元环烷基。
[0081]
本公开所述的“螺环烷基”优选为6至14元，更优选为7至10元螺环烷基。
[0082]
本公开所述的“桥环烷基”优选为6至14元，更优选为7至10元桥环烷基。
[0083]
本公开所述的“稠环烷基”优选为6至14元，更优选为7至10元稠环烷基。
[0084]
本公开所述的“杂环基”优选3至12元，更优选3至10元杂环基。
[0085]
本公开所述的“螺杂环基”优选6至14元，更优选为7至10元螺杂环基。
[0086]
本公开所述的“桥杂环基”优选6至14元，更优选为7至10元桥杂环基。
[0087]
本公开所述的“稠杂环基”优选6至14元，更优选为7至10元稠杂环基。
[0088]
本公开所述的“芳基”优选为6至14元，更优选为6至10元芳基。
[0089]
本公开所述的“稠环芳基”优选8至14元，更优选为8至12元稠环芳基。
[0090]
本公开所述的“杂芳基”优选为5至12元，更优选为5至10元杂芳基。
[0091]
本公开所述的“稠杂芳基”优选为5至14元，更优选为5至12元稠杂芳基。
[0092]
本公开还提供了一种药物组合物，包括至少一种前述化合物或其可药用的盐，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0093]
在某些实施方式中，所述的药物组合物的单位剂量为0.001mg-1000mg。
[0094]
在某些实施方式中，基于组合物的总重量，所述的药物组合物含有0.01％-99.99％的前述化合物。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有0.1％-99.9％的前述化合物。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有0.5％-99.5％的前述化合物。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有1％-99％的前述化合物。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有2％-98％的前述化合物。
[0095]
在某些实施方式中，基于组合物的总重量，所述的药物组合物含有0.01％-99.99％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有0.1％-99.9％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有0.5％-99.5％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有1％-99％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在某些实施方式中，所述的药物组合物含有2％-98％的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
[0096]
本公开还提供了本公开所述的化合物其药学上可接受的盐或药物组合物在制备用于治疗和/或预防khk介导的疾病及相关疾病的药物中的用途。所述疾病选自1型糖尿病、2型糖尿病、特发性1型糖尿病、成人晚发自身免疫性糖尿病(lada)、早发性2型糖尿病(eod)、青年发作非典型糖尿病(yoad)、青年的成年型糖尿病(mody)、营养不良相关性糖尿病、妊娠糖尿病、高血糖症、胰岛素抗性、肝胰岛素抗性、葡萄糖耐量减低、糖尿病神经病变、糖尿病肾病、肾病、急性肾病、肾小管功能障碍、近端小管的促炎性改变、糖尿病性视网膜病变、脂肪细胞功能障碍、内脏脂肪沉积、肥胖、饮食障碍、过量的糖渴求、血脂异常、高脂血症、高甘油三酯血症、总胆固醇增加、高ldl胆固醇、低hdl胆固醇、高胰岛素血症、非酒精性脂肪肝病(包括诸如脂肪变性、nash、纤维化、肝硬化及肝细胞癌的相关疾病)、脂肪变性、非酒精性脂肪肝炎、纤维化、肝硬化、肝细胞癌、遗传性果糖不耐受症、冠状动脉疾病、周边血管疾病、高血压、内皮细胞功能障碍、血管顺应性受损、充血性心力衰竭、心肌梗死、脑卒中、出血性脑卒中、缺血性脑卒中、肺动脉高压、血管成形术后再狭窄、间歇性跛行、膳食后脂血症、代谢性酸中毒、酮中毒、关节炎、骨质疏松症、左心室肥大、周边动脉疾病、黄斑变性、白内障、肾小球硬化、慢性肾衰竭、代谢综合征、x综合征、经前综合征、心绞痛、血栓形成、动脉粥样硬化、短暂性脑缺血发作、血管再狭窄、葡萄糖代谢受损、空腹血糖受损病况、高尿酸血症、痛风、勃起功能障碍、皮肤及结缔组织病症、足溃疡、溃疡性结肠炎、超载脂蛋白b脂蛋白血症、阿尔茨海默病、精神分裂症、认知功能减弱、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩病及肠易激综合征。
[0097]
本公开进一步提供了一种治疗khk介导的疾病的方法，所述哺乳动物可为人，或可为非人哺乳动物，用于治疗目的，包括给哺乳动物施用本公开所述的化合物或其可药用盐，或药物组合物。
[0098]
本公开进一步提供了一种试剂盒，其包含本公开所述的化合物或其可药用盐，或药物组合物。
[0099]
术语解释：
[0100]
除非有相反陈述，在说明书和权利要求书中使用的术语具有下述含义。
[0101]
术语“烷基”指饱和脂肪族烃基团，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子的烷基。非限制性实例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙
基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各种支链异构体等。更优选的是含有1至6个碳原子的烷基，非限制性实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代，所述取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
[0102]
术语“亚烷基”指饱和的直链或支链脂肪族烃基，其具有2个从母体烷的相同碳原子或两个不同的碳原子上除去两个氢原子所衍生的残基，其为包含1至20个碳原子的直链或支链基团，优选含有1至12个碳原子，更优选含有1至6个碳原子的亚烷基。亚烷基的非限制性实例包括但不限于亚甲基(-ch
2-)、1,1-亚乙基(-ch(ch3)-)、1,2-亚乙基(-ch2ch2)-、1,1-亚丙基(-ch(ch2ch3)-)、1,2-亚丙基(-ch2ch(ch3)-)、1,3-亚丙基(-ch2ch2ch
2-)、1,4-亚丁基(-ch2ch2ch2ch
2-)等。亚烷基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基可以在任何可使用的连接点上被取代。
[0103]
术语“亚链烯基”指包含具有2至8个碳原子，优选地具有2至6个碳原子，更优选地具有2至4个碳原子并在任何位置具有至少一个双键的线性链烯基，包括例如亚乙烯基、亚烯丙基(allylene)、亚丙烯基、亚丁烯基、亚异戊二烯基(prenylene)、亚丁二烯基(butadienylene)、亚戊烯基、亚戊二烯基、亚己烯基、亚己二烯基等。
[0104]
术语“亚链炔基”包括具有2至8个碳原子，优选地具有2至6个碳原子，更优选地具有2至4个碳原子且在任何位置具有至少一个叁键的线性亚链炔基，包括例如亚乙炔基、亚丙炔基、亚丁炔基、亚戊炔基、亚己炔基等。
[0105]
术语“环烷基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，环烷基环包含3至20个碳原子，优选包含3至12个碳原子，更优选包含3至6个碳原子。单环环烷基的非限制性实例包括环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环庚三烯基、环辛基等；多环环烷基包括螺环、稠环和桥环的环烷基。“碳环”指的是环烷基中的环系。
[0106]
术语“螺环烷基”指5至20元的单环之间共用一个碳原子(称螺原子)的多环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺环烷基分为单螺环烷基、双螺环烷
基或多螺环烷基，优选为单螺环烷基和双螺环烷基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺环烷基。“螺碳环”指的是螺环烷基中的环系。螺环烷基的非限制性实例包括：
[0107][0108]
术语“稠环烷基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对碳原子的全碳多环基团，其中一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠环烷基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环烷基。“稠碳环”指的是稠环烷基中的环系。稠环烷基的非限制性实例包括：
[0109][0110]
术语“桥环烷基”指5至20元，任意两个环共用两个不直接连接的碳原子的全碳多环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥环烷基，优选为双环、三环或四环，更有选为双环或三环。桥环烷基的非限制性实例包括：
[0111][0112]
所述环烷基环可以稠合于芳基、杂芳基或杂环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为环烷基，非限制性实例包括茚满基、四氢萘基、苯并环庚烷基等。环烷基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
[0113]
术语“杂环基”指饱和或部分不饱和单环或多环环状烃取代基，其包含3至20个环原子，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，但不包括-o-o-、-o-s-或-s-s-的环部分，其余环原子为碳。优选包含3至12个环原子，其中1～4个是杂原子；更优选包含3至6个环原子。单环杂环基的非限制性实例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、二氢咪唑基、二氢呋喃基、二氢吡唑基、二氢吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、硫代吗啉基、高哌嗪基等，优选哌啶基、吡咯烷基。多环杂环基包括螺环、稠环和桥环的杂环基。“杂环”指的是杂环基中的环系。
[0114]
术语“螺杂环基”指5至20元的单环之间共用一个原子(称螺原子)的多环杂环基
团，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据环与环之间共用螺原子的数目将螺杂环基分为单螺杂环基、双螺杂环基或多螺杂环基，优选为单螺杂环基和双螺杂环基。更优选为4元/4元、4元/5元、4元/6元、5元/5元或5元/6元单螺杂环基。“螺杂环”指的是螺杂环基中的环系。螺杂环基的非限制性实例包括：
[0115][0116]
术语“稠杂环基”指5至20元，系统中的每个环与体系中的其他环共享毗邻的一对原子的多环杂环基团，一个或多个环可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环稠杂环基，优选为双环或三环，更优选为5元/5元或5元/6元双环稠杂环基。“稠杂环”指的是稠杂环基中的环系。稠杂环基的非限制性实例包括：
[0117][0118]
术语“桥杂环基”指5至14元，任意两个环共用两个不直接连接的原子的多环杂环基团，其可以含有一个或多个双键，但没有一个环具有完全共轭的π电子系统，其中一个或多个环原子为选自氮、氧或s(o)m(其中m是整数0至2)的杂原子，其余环原子为碳。优选为6至14元，更优选为7至10元。根据组成环的数目可以分为双环、三环、四环或多环桥杂环基，优选为双环、三环或四环，更有选为双环或三环。桥杂环基的非限制性实例包括：
[0119][0120]
所述杂环基环可以稠合于芳基、杂芳基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂环基，其非限制性实例包括：
[0121]
等。
[0122]
杂环基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、氧代基、羧基或羧酸酯基。
[0123]
术语“芳基”指具有共轭的π电子体系的6至14元全碳单环或稠合多环(也就是共享毗邻碳原子对的环)基团，优选为6至10元，例如苯基和萘基。所述芳基环可以稠合于杂芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为芳基环。“芳环”指的是芳基中的环系。芳基非限制性实例包括：
[0124][0125]
芳基可以是取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基，优选苯基。
[0126]
术语“稠环芳基”可以是含有8-14个环原子由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子连接起来形成的不饱和的具有芳香性的稠环结构，环原子优选8-12个。例如包括全部不饱和稠环芳基，例如萘、菲等，还包括部分饱和稠环芳基，例如苯并3-8元饱和单环环烷基、苯并3-8元部分饱和单环环烷基。“稠芳环”指的是稠环芳基中的环系。稠环芳基具体实例如2,3-二氢-1h-茚基、ih-茚基、1,2,3,4-四氢萘基、1,4-二氢萘基等。
[0127]
术语“杂芳基”指包含1至4个杂原子、5至14个环原子的杂芳族体系，其中杂原子选自氧、硫和氮。杂芳基优选为5至12元，例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、四唑基、吡啶基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等，优选为咪唑基、吡唑基、嘧啶基或噻唑基；更优选为吡唑基或噻唑基。所述杂芳基环可以稠合于芳基、杂环基或环烷基环上，其中与母体结构连接在一起的环为杂芳基环。“杂芳环”指的是杂芳基中的环系。杂芳基非限制性实例包括：
[0128][0129]
杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0130]
术语“稠杂芳基”可以是含有5-14个环原子(其中至少含有一个杂原子)由两个或两个以上环状结构彼此共用两个相邻的原子连接起来形成的不饱和的具有芳香性的稠环结构，同时包括碳原子、氮原子和硫原子可以被氧代，优选"5-12元稠杂芳基"、"7-12元稠杂芳基"、"9-12元稠杂芳基"等，例如苯并呋喃基、苯并异呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、喹啉基、2-喹啉酮、4-喹啉酮、1-异喹啉酮、异喹啉基、吖啶基、菲啶基、苯并哒嗪基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、酚嗪基、喋啶基、嘌呤基、萘啶基、吩嗪、吩噻嗪等。“稠杂芳环”指的是稠杂芳基中的环系。
[0131]
稠杂芳基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0132]
术语“烷氧基”指-o-(烷基)和-o-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷氧基的非限制性实例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基。烷氧基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基、羧基或羧酸酯基。
[0133]
术语“烷硫基”指-s-(烷基)和-s-(非取代的环烷基)，其中烷基的定义如上所述。烷硫基的非限制性实例包括：甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、环丙硫基、环丁硫基、环戊硫基、环己硫基。烷硫基可以是任选取代的或非取代的，当被取代时，取代基优选为一个或多个以下基团，其独立地选自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基氨基、卤素、巯基、羟基、硝基、氰基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、环烷氧基、杂环烷氧基、环烷硫基、杂环烷硫基中的一个或多个取代基所取代。
[0134]
术语“羟烷基”指被羟基取代的烷基，其中烷基如上所定义。
[0135]
术语“卤代烷基”指被卤素取代的烷基，其中烷基如上所定义。
[0136]
术语“氘代烷基”指被氘原子取代的烷基，其中烷基如上所定义。
[0137]
术语“羟基”指-oh基团。
[0138]
术语“氧代”指＝o基团。例如，碳原子与氧原子通过双键连接，其中形成酮或醛基。
[0139]
术语“硫代”指＝s基团。例如，碳原子与硫原子通过双键连接，形成硫代羰基-c(s)-。
[0140]
术语“卤素”指氟、氯、溴或碘。
[0141]
术语“氨基”指-nh2。
[0142]
术语“氰基”指-cn。
[0143]
术语“硝基”指-no2。
[0144]
术语“羧基”指-c(o)oh。
[0145]
术语“醛基”指-cho。
[0146]
术语“羧酸酯基”指-c(o)o(烷基)或-c(o)o(环烷基)，其中烷基、环烷基如上所定义。
[0147]
术语“酰卤”指含有-c(o)-卤素的基团的化合物。
[0148]
术语“磺酰基”指-s(o)(o)-。
[0149]
术语“亚磺酰基”指-s(o)-。
[0150]
化学基团的“电子等排体”为表现出相同或相似性质的其它化学基团。例如，四唑是羧酸的电子等排体，因为其模拟羧酸的性质，即使这两者具有非常不同的分子式。四唑是羧酸的许多可能的电子等排替换物中的其中一种。其他可预期的羧酸电子等排体包括-so3h、-so2hnr、-po2(r)2、-po3(r)2、-conhnhso2r、-cohnso2r和-conrcn，其中r选自如本文所定义的氢、烷基、烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基和杂环基。此外，羧酸电子等排体可包含5元至7元碳环或杂环，所述杂环包含在任何化学稳定氧化态情况下的ch2、o、s或n的任何组合，其中所述环结构的任何一种原子在一个或多个位置处被任选取代。可以预期的是，还应预期，当将化学取代基添加至羧基电子等排体时，化合物保留羧基电子等排体的性质。预期的是，当羧基电子等排体被选自如以上所定义的r的一个或多个部分任选取代时，则选择取代度(substitution)和取代位置，以使其不会消除化合物的羧酸电子等排性质。类似地，还应预期，如果一个或多个r取代基会破坏化合物的羧酸电子等排性质，则此类取代基在碳环或杂环羧酸电子等排体上的位置不是位于使化合物的羧酸电子等排性质保持完整或为完整的一个或多个原子处的取代。
[0151]“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选被烷基取代的杂环基团”意味着烷基可以但不必须存在，该说明包括杂环基团被烷基取代的情形和杂环基团不被烷基取代的情形。
[0152]“取代的”指基团中的一个或多个氢原子，优选为最多5个，更优选为1～3个氢原子彼此独立地被相应数目的取代基取代。不言而喻，取代基仅处在它们的可能的化学位置，本领域技术人员能够在不付出过多努力的情况下确定(通过实验或理论)可能或不可能的取代。例如，具有游离氢的氨基或羟基与具有不饱和(如烯属)键的碳原子结合时可能是不稳定的。
[0153]
本公开所述化合物的化学结构中，键并未指定构型，即键可以为或或者同时包含和两种构型。本公开所述化合物的化学结构中，键并未指定构型，即可以为z构型或e构型，或者同时包含两种构型。
[0154]
虽然为简便起见将全部上述结构式画成某些异构体形式，但是本公开可以包括所有的异构体，如互变异构体、旋转异构体、几何异构体、非对映异构体、外消旋体和对映异构
体。
[0155]
互变异构体是有机化合物的结构异构体，通过被称为互变异构化的化学反应容易相互转化。这种反应常导致氢原子或质子的形式迁移，伴随着单键和邻近的双键的转换。一些常见的互变异构对为：酮-烯醇、内酰胺-内酰亚胺。内酰胺-内酰亚胺平衡实例是在如下所示的a和b之间。
[0156][0157]
本公开中的所有化合物可以被画成a型或b型。所有的互变异构形式在本公开的范围内。化合物的命名不排除任何互变异构体。
[0158]
本公开所述化合物或其可药用盐、或其异构体的任何同位素标记的衍生物都被本公开所覆盖。能够被同位素标记的原子包括但不限于氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯、碘等。它们可分别被同位素同位素2h(d)、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
15
n、
18
f、
31
p、
32
p、
35
s、
36
cl和
125
i等代替。除另有说明，当一个位置被特别地指定为氘(d)时，该位置应理解为具有大于氘的天然丰度(其为0.015％)至少3000倍的丰度的氘(即，至少45％的氘掺入)。
具体实施方式
[0159]
以下结合实施例进一步描述本公开所述的化合物、可药用盐的制备，但这些实施例并非限制本公开中的范围。
[0160]
本公开中实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
[0161]
nmr位移(δ)以10-6
(ppm)的单位给出。nmr的测定是用bruker avance-400核磁仪，测定溶剂为氘代二甲基亚砜(dmso-d6)，氘代氯仿(cdcl3)，氘代甲醇(cd3od)，内标为四甲基硅烷(tms)。
[0162]
ms的测定用shimadzu 2010mass spectrometer或agilent 6110a msd质谱仪。
[0163]
hplc的测定使用shimadzu lc-20a systems、shimadzu lc-2010ht series或安捷伦agilent 1200lc高压液相色谱仪(ultimate xb-c18 3.0*150mm色谱柱或xtimate c182.1*30mm色谱柱)。
[0164]
手性hplc分析测定使用chiralpak ic-3 100
×
4.6mm i.d.,3um、chiralpak ad-3150
×
4.6mm i.d.,3um、chiralpak ad-3 50
×
4.6mm i.d.,3um、chiralpak as-3 150
×
4.6mm i.d.,3um、chiralpak as-3 100
×
4.6mm i.d.,3μm、chiralcel od-3 150
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4.6mm i.d.,3um、chiralcelod-3 100
×
4.6mm i.d.,3μm、chiralcel oj-h 150
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4.6mm i.d.,5um、chiralcel oj-3 150
×
4.6mm i.d.,3um色谱柱；薄层层析硅胶板使用烟台黄海hsgf254或青岛gf254硅胶板，薄层色谱法(tlc)使用的硅胶板采用的规格是0.15mm～0.2mm，薄层层析分离纯化产品采用的规格是0.4mm～0.5mm。
[0165]
柱层析一般使用烟台黄海硅胶100～200目、200～300目或300～400目硅胶为载体。
[0166]
手性制备柱使用daicel chiralpak ic(250mm*30mm,10um)或phenomenex-amylose-1(250mm*30mm,5um)。
[0167]
combiflash快速制备仪使用combiflash rf150(teledyne isco)。
[0168]
激酶平均抑制率及ic
50
值的测定用novostar酶标仪(德国bmg公司)。
[0169]
本公开的已知的起始原料可以采用或按照本领域已知的方法来合成，或可购买自abcr gmbh&co.kg，acros organics，aldrich chemical company，韶远化学科技(accela chembio inc)、达瑞化学品等公司。
[0170]
实施例中无特殊说明，反应能够均在氩气氛或氮气氛下进行。
[0171]
氩气氛或氮气氛是指反应瓶连接一个约1l容积的氩气或氮气气球。
[0172]
氢气氛是指反应瓶连接一个约1l容积的氢气气球。
[0173]
加压氢化反应使用parr 3916ekx型氢化仪和清蓝ql-500型氢气发生器或hc2-ss型氢化仪。
[0174]
氢化反应通常抽真空，充入氢气，反复操作3次。
[0175]
微波反应使用cem discover-s 908860型微波反应器。
[0176]
实施例中无特殊说明，溶液是指水溶液。
[0177]
实施例中无特殊说明，反应的温度为室温，为20℃～30℃。
[0178]
实施例中的反应进程的监测采用薄层色谱法(tlc)，反应所使用的展开剂，纯化化合物采用的柱层析的洗脱剂的体系和薄层色谱法的展开剂体系包括：a：二氯甲烷/甲醇体系，b：正己烷/乙酸乙酯体系，c：石油醚/乙酸乙酯体系，d：石油醚/乙酸乙酯/甲醇，溶剂的体积比根据化合物的极性不同而进行调节，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等碱性或酸性试剂进行调节。
[0179]
下述实验中所用缩写代表的含义如下:
[0180]
tfa:三氟乙酸；ch3cn:乙腈；nmp:n-甲基吡咯烷酮；dcm:二氯甲烷；m-cpba:间氯过氧苯甲酸；dipea:n,n-二异丙基乙胺；meoh：甲醇；ppts:对甲苯磺酸吡啶盐；dmp：戴斯-马丁试剂；pd(pph3)2cl2:三苯基膦二氯化靶；pd(pph3)4：四三苯基膦钯；pd(dppf)cl2:1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯。
[0181]
实施例1
[0182]
7,7-二氟-2-((s)-2-甲基氮杂环丁烷-1-基)-4-(1-((s)-吡咯烷-3-基)-1h-吡唑-4-基)-6,7-二氢-5h-环戊烷[d]嘧啶(化合物1)
[0183][0184]
第一步：化合物1c的制备
[0185]
在ar气保护下，将化合物1a(60mg,0.25mmol，制备方法参考wo 2020/156445 a1)溶于二氧六环(10％水，4ml)中，加入化合物1b(110mg,0.31mmol)、碳酸钠(54mg,0.51mmol)，pd(pph3)2cl2(15mg，0.02mmol)。升温至80℃，搅拌至tlc反应完全。加入饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)，dcm(30ml
×
3)萃取后，合并有机相，并用饱和食盐水(30ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液真空减压浓缩得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物1c(80mg，收率72％)。
[0186]
ms(esi)m/z＝438.2[m h]

[0187]
第二步：化合物1d的制备
[0188]
在室温下，将化合物1c(58mg,0.13mmol)溶于dcm(4ml)中，将m-cpba(48mg,0.28mmol)缓慢加到反应体系中，搅拌至tlc反应完全。向反应液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液(5ml)，用dcm(10ml
×
3)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(20ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液真空减压浓缩得到粗品1d(60mg)。
[0189]
ms(esi)m/z＝470.2[m h]

[0190]
第三步：化合物1g的制备
[0191]
将化合物1d(60mg,0.13mmol)，dipea(53mg,0.41mmol)和化合物1f(46mg,0.15mmol)溶于nmp(2ml)中，微波加热到160℃，搅拌至tlc反应完全。向反应液中加入乙酸乙酯(20ml)，分离出的有机相用饱和食盐水(20ml)洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，真空减压浓缩得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化
得到化合物1g(40mg，收率67％)。
[0192]
ms(esi)m/z＝461.2[m h]

[0193]
第四步：化合物1的制备
[0194]
将化合物1g(30mg,0.065mmol)溶于dcm(2ml)中，缓慢加入tfa(1ml)，在室温下搅拌至tlc反应完全。反应液减压浓缩得到粗品,粗品通过制备级hplc分离纯化得到化合物1(10mg，收率43％)。
[0195]
ms(esi)m/z＝361.2[m h]

[0196]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(s,1h),8.01(s,1h),4.89(s,1h),4.58(dt,j＝8.0,6.1hz,1h),4.20-4.14(m,1h),4.11
–
4.04(m,1h),3.40
–
3.20(m,3h),3.05
–
3.00(m,3h),2.69
–
2.56(m,2h),2.52
–
2.33(m,2h),2.28
–
2.21(m,1h),2.07
–
1.99(m,1h),1.59(d,j＝6.2hz,3h).
[0197]
实施例2
[0198]
(s)-7,7-二氟-2-(2-甲基氮杂环丁烷-1-基)-4-(1-(哌啶-4-基)-1h-吡唑-4-基)-6,7-二氢-5h-环戊[d]嘧啶(化合物2)
[0199][0200]
第一步：化合物2b的制备
[0201]
在ar气保护下，将化合物1a(50mg,0.21mmol)溶于二氧六环(10％水，4ml)中，加入化合物2a(112mg,0.30mmol)、碳酸钠(45mg,0.42mmol)，pd(pph3)2cl2(15mg，0.02mmol)。升温至80℃，搅拌至tlc反应完全。加入饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)，dcm(30ml
×
3)萃取后，合并有机相，并用饱和食盐水(30ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物2b(60mg，收率63％)。
[0202]
ms(esi)m/z＝452.2[m h]

[0203]
第二步：化合物2c的制备
[0204]
在室温下，将化合物2b(60mg,0.13mmol)溶于dcm(4ml)中，将m-cpba(48mg,0.28mmol)缓慢加到反应体系中，搅拌至反应结束。向反应液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液(5ml)，用dcm(10ml
×
3)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(20ml)洗一次。有机相用无水硫
酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品2c(64mg)。
[0205]
ms(esi)m/z＝484.2[m h]

[0206]
第三步：化合物2d的制备
[0207]
将化合物2c(64mg,0.13mmol)，dipea(53mg,0.41mmol)和化合物1f(46mg,0.15mmol)溶于nmp(2ml)中，微波加热到160℃，搅拌至反应结束。向反应液中加入乙酸乙酯(20ml)，分离出的有机相用饱和食盐水(20ml)洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物2d(35mg，收率58.6％)。
[0208]
ms(esi)m/z＝475.3[m h]

[0209]
第四步：化合物2的制备
[0210]
将化合物2d(28mg,0.059mmol)溶于dcm(2ml)中，缓慢加入tfa(1ml)，在室温下搅拌至反应结束。反应液在真空中浓缩得到粗品,粗品通过制备级hplc分离纯化得到化合物2(8mg，收率36％)。
[0211]
ms(esi)m/z＝375.3[m h]

[0212]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.05
–
8.00(m,2h)，5.20-5.05(m,1h)，4.61
–
4.41(m,2h),4.15
–
4.00(m,2h),3.57
–
3.54(m,2h),3.10
–
2.95(m,4h),2.65
–
2.53(m,2h),2.48
–
2.35(m,4h),2.05
–
1.91(m,1h),1.63
–
1.46(m,3h).
[0213]
实施例3
[0214]
(s)-4-(1-(氮杂环丁烷-3-基)-1h-吡唑-4-基)-7,7-二氟-2-(2-甲基氮杂环丁烷-1-基)-6,7-二氢-5h-环戊烷[d]嘧啶(化合物3)
[0215]
(s)-7,7-二氟-2-(2-甲基氮杂环丁烷-1-基)-4-(1-(1-甲基氮杂环丁烷-3-基)-1h-吡唑-4-基)-6,7-二氢-5h-环戊烷[d]嘧啶(化合物4)
[0216][0217]
第一步：化合物3b的合成
[0218]
在ar气保护下，将化合物1a(40mg,0.17mmol)溶于二氧六环(10％水，2ml)中，加入化合物3a(88mg,0.25mmol)、碳酸钠(45mg,0.42mmol)，pd(pph3)2cl2(12mg，0.01mmol)。升温至80℃，搅拌至tlc监测反应完全。加入饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)，dcm(30ml
×
3)萃取后，合并有机相，并用饱和食盐水(30ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空
中浓缩得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物3b(58mg，收率80％)。
[0219]
ms(esi)m/z＝424.4[m h]

[0220]
第二步：化合物3c的合成
[0221]
在室温下，将化合物3b(58mg,0.13mmol)溶于dcm(4ml)中，将m-cpba(49mg,0.28mmol)缓慢加到反应体系中，搅拌至tlc反应完全。向反应液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液(5ml)，用dcm(10ml
×
3)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(20ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品3c(50mg)。
[0222]
lcms:ms(esi)m/z＝456.4[m h]

[0223]
第三步：化合物3d的合成
[0224]
将化合物3c(50mg,0.11mmol)，dipea(53mg,0.41mmol)和化合物1f(46mg,0.15mmol)溶于nmp(2ml)中，微波加热到160℃，搅拌至tlc检测反应完全。向反应液中加入乙酸乙酯(15ml)，分离出的有机相用饱和食盐水(20ml)洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物3d(30mg，收率61％)。
[0225]
ms(esi)m/z＝447.4[m h]

[0226]
第四步：化合物3的合成
[0227]
将化合物3d(30mg,0.067mmol)溶于dcm(2ml)中，缓慢加入tfa(0.5ml)，在室温下搅拌至tlc检测反应完全。反应液在真空中浓缩得到粗品,粗品通过制备级hplc分离纯化得到化合物3(10mg，收率43％)。
[0228]
ms(esi)m/z＝347.3[m h]

[0229]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.08(s,1h),8.01(s,1h),4.55(q,j＝6.9hz,1h),4.38
–
4.24(m,2h),4.15(q,j＝8.8,6.4hz,1h),4.11
–
3.90(m,3h),3.00
–
2.97(m,2h),2.62
–
2.53(m,2h),2.51
–
2.35(m,1h),2.03-1.95(m,2h),1.56
–
1.54(m,3h).
[0230]
第五步：化合物4的合成
[0231]
将化合物3(40mg,0.115mmol)溶于meoh(2ml)中，缓慢加入乙酸(0.1ml)到反应体系中，再加入甲醛水溶液(1ml)，在室温下反应0.5小时，加入stab(60mg,0.28mmol)，室温反应至tlc监测反应完全。将反应液浓缩后通过制备级hplc进行纯化得到化合物4(15mg，收率36％)。
[0232]
lcms:ms(esi)m/z＝361.2[m h]

[0233]1h nmr(400mhz,cdcl3)
[0234]
δ8.13(s,1h),8.08(s,1h),4.99(p,j＝6.8hz,1h),4.62
–
4.54(m,1h),4.20
–
4.15(m,1h),4.11
–
4.05(m,1h),3.88
–
3.85(m,2h),3.61
–
3.57(m,2h),3.06
–
3.01(m,2h),2.68
–
2.57(m,2h),2.52-2.49(m,4h),2.07-1.99(m,1h),1.60(d,j＝6.2hz,3h).
[0235]
实施例4
[0236]
(s)-2-(4-(7,7-二氟-2-(2-甲基氮杂环丁烷-1-基)-6,7-二氟-5h-环戊烷[d]嘧啶-4-基)-1h-吡唑-1-基)乙醇(化合物5)
[0237][0238]
第一步：化合物5b的制备
[0239]
在ar气保护下，将化合物1a(60mg,0.25mmol)溶于二氧六环(10％水，2ml)中，加入化合物5a(120mg,0.50mmol)、碳酸钠(54mg,0.51mmol)，pd(pph3)2cl2(15mg，0.02mmol)。升温至80℃，搅拌至tlc监测反应完全。加入饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)，dcm(30ml
×
3)萃取后，合并有机相，并用饱和食盐水(30ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物5b(45mg，收率56％)。
[0240]
ms(esi)m/z＝313.3[m h]

[0241]
第二步：化合物5c的制备
[0242]
在室温下，将化合物5b(45mg,0.14mmol)溶于dcm(4ml)中，将m-cpba(49mg,0.28mmol)缓慢加到反应体系中，搅拌至tlc反应完全。向反应液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液(5ml)，用dcm(10ml
×
3)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(20ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品5c(45mg)。
[0243]
ms(esi)m/z＝345.3[m h]

[0244]
第三步：化合物5的制备
[0245]
将化合物5c(45mg,0.13mmol)，dipea(53mg,0.41mmol)和化合物1f(46mg,0.15mmol)溶于nmp(2ml)中，微波加热到160℃，搅拌至tlc检测反应完全。向反应液中加入乙酸乙酯(15ml)，分离出的有机相用饱和食盐水(20ml)洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到粗品。粗品通过制备级hplc分离纯化得到化合物5(15mg，收率34％)ms(esi)m/z＝336.3[m h]

[0246]1h nmr(400mhz,cdcl3)δ8.14
–
8.01(m,2h),5.34
–
5.28(m,1h),4.56
–
4.37(m,3h),4.24
–
4.20(m,1h),4.15
–
4.10(m,1h)，4.07
–
4.00(m,1h),3.01
–
2.94(m,2h),2.60
–
2.39(m,3h),2.03
–
1.97(m,1h),1.56
–
1.54(m,3h).
[0247]
实施例5
[0248]
(s)-7,7-二氟-2-(2-甲基氮杂环丁烷-1-基)-4-(1h-吡唑-4-基)-6,7-二氢-5h-环戊烷[d]嘧啶(化合物6)
[0249][0250]
第一步：化合物6b的制备
[0251]
在ar气保护下，将化合物1a(100mg,0.42mmol)溶于二氧六环(10％水，2ml)中，加入化合物6a(90.2mg,0.47mmol)、碳酸钠(112mg,1.06mmol)，pd(pph3)4(24.4mg，0.02mmol)。升温至80℃，搅拌至tlc监测反应完全。加入饱和碳酸氢钠水溶液(30ml)，dcm(30ml
×
3)萃取后，合并有机相，并用饱和食盐水(40ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物6b(110mg，收率60.8％)。
[0252]
ms(esi):m/z＝268.9[m h]

[0253]
第二步：化合物6c的制备
[0254]
在室温下，将化合物6b(100.0mg,0.37mmol)溶于dcm(5ml)中，将m-cpba(189.2mg,0.93mmol)缓慢加到反应体系中，搅拌至tlc反应完全。向反应液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液(8ml)，用dcm(10ml
×
3)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(20ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品6c。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-50％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物6c(110mg，收率60.8％)。
[0255]
ms(esi)m/z＝300.9[m h]

[0256]
第三步：化合物6的制备
[0257]
将化合物6c(85mg,0.28mmol)，dipea(53mg,0.41mmol)和化合物1f(189.0mg,0.62mmol)溶于nmp(3ml)中，微波加热到160℃，搅拌至tlc检测反应完全。向反应液中加入乙酸乙酯(40ml)，分离出的有机相用饱和食盐水(40ml)洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到粗品。粗品通过制备级hplc分离纯化得到化合物6(30.2mg，收率36.6％)
[0258]
ms(esi):m/z＝291.9[m h]

[0259]1h nmr:(400mhz,dmso-d6)
[0260]
δ13.41(s,1h),8.35(s,1h),8.09(s,1h),4.50-4.39(m,1h),4.04-3.88(m,2h),3.03
–
3.01(m,2h),2.68-2.56(m,2h),2.45-2.36(m,1h),2.02-1.91(m,1h),1.50(d,j＝6.1hz,3h)
[0261]
实施例6
[0262]
(s)-7,7-二氟-4-(1-甲基-1h-吡唑-4-基)-2-(2-甲基氮杂环丁烷-1-基)-6,7-二氢-5h-环戊烷[d]嘧啶(化合物7)
[0263][0264]
第一步：化合物7b的合成
[0265]
在ar气保护下，将化合物1a(100mg,0.42mmol)溶于二氧六环(10％水，2ml)中，加入化合物7a(96.7mg,0.47mmol)、碳酸钠(112mg,1.06mmol)，pd(pph3)4(24.4mg，0.02mmol)。升温至80℃，搅拌至tlc监测反应完全。加入水溶液(30ml)，dcm(30ml
×
3)萃取后，合并有机相，并用饱和食盐水(40ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物7b(120mg，收率62.9％)。
[0266]
ms(esi):m/z＝282.9[m h]

[0267]
第二步：化合物7c的合成
[0268]
在室温下，将化合物7b(100.0mg,0.35mmol)溶于dcm(5ml)中，将间氯过氧苯甲酸(179.8mg,0.89mmol)缓慢加到反应体系中，搅拌至tlc反应完全。向反应液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液(8ml)，用dcm(10ml
×
3)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(20ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品7c。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-50％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物7c(120mg，收率82.3％)。ms(esi):m/z＝314.9[m h]

[0269]
第三步：化合物7的合成
[0270]
将化合物7c(120mg,0.38mmol)，dipea(246.7mg,1.91mmol)和化合物1f(254.8mg,0.84mmol)溶于nmp(3ml)中，微波加热到160℃，搅拌至tlc检测反应完全。向反应液中加入乙酸乙酯(40ml)，分离出的有机相用饱和食盐水(40ml)洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到粗品。粗品通过制备级hplc分离纯化得到化合物7(60.2mg，收率51.6％)
[0271]
ms(esi):m/z＝306.0[m h]

[0272]1h nmr:(400mhz,dmso-d6)
[0273]
δ8.36(s,1h),8.01(s,1h),4.50-4.39(m,1h),4.04-3.88(m,5h),3.03
–
2.99(m,2h),2.67-2.57(m,2h),2.44-2.37(m,1h),2.01-1.92(m,1h),1.50(d,j＝6.1hz,3h)
[0274]
实施例7
[0275]
(s)-7,7-二氟-4-(1h-咪唑-4-基)2-(2-甲基氮杂环丁烷-1-基)-6,7-二氢-5h-环戊烷[d]嘧啶
[0276]
(化合物8)
[0277][0278]
第一步：化合物8b的制备
[0279]
在ar气保护下，将化合物1a(200mg,0.85mmol)溶于ch3cn/h2o(5:1,7.2ml)中，加入化合物8a(258.6mg,0.93mmol)、碳酸钠(223.9mg,2.11mmol)，pd(dppf)cl2(62.7mg，0.09mmol)。升温至80℃，搅拌至tlc监测反应完全。反应液真空减压浓缩得到粗品。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-80％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物8b(110mg，收率36.9％)。
[0280]
ms(esi):m/z＝353.1[m h]

[0281]
第二步：化合物8c的制备
[0282]
在室温下，将化合物8b(190.0mg,0.54mmol)溶于dcm(5ml)中，将m-cpba(273.6mg,1.35mmol)缓慢加到反应体系中，搅拌至tlc反应完全。向反应液中加入饱和硫代硫酸钠水溶液(12ml)，用dcm(10ml
×
3)萃取，合并有机相，并用饱和食盐水(20ml)洗一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液真空减压浓缩得到粗品8c。该粗品通过快速柱层析(淋洗剂：0-50％乙酸乙酯的石油醚)进行纯化得到化合物8c(190mg，收率91.7％)。
[0283]
第三步：化合物8d的制备
[0284]
将化合物8c(180mg,0.47mmol)，dipea(302.6mg,2.34mmol)和化合物1f(312.6mg,1.03mmol)溶于nmp(3ml)中，微波加热到160℃，搅拌至tlc检测反应完全。向反应液中加入乙酸乙酯(100ml)，分离出的有机相用饱和食盐水(40ml)洗一次，有机相用无水硫酸钠干燥，减压蒸干得到粗品8d(120.0mg)
[0285]
第四步：化合物8的制备
[0286]
将化合物8d(120.0mg,0.32)溶于meoh(3ml)中，加入ppts(120.5mg,0.48mmol)。反应加热至70℃，搅拌至tlc检测反应完全。向反应液中加入水(20ml)稀释，用etoac(20ml
×
3)萃取，合并有机相并依次用水(20ml),饱和食盐水(10ml)洗涤一次。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，滤液在真空中浓缩得到粗品,粗品通过制备级的hplc分离纯化得到化合物8(23.92mg,收率25.7％)。
[0287]
ms(esi):m/z＝291.9[m h]

[0288]
1h nmr:tjn200861-392-p1a(400mhz,dmso-d6)
[0289]
δ12.61(s,1h),7.88(s,1h),7.85(s,1h),4.47-4.42(m,1h),3.99-3.91(m,2h),3.22
–
3.21(m,2h),2.57-2.52(m,2h),2.43-2.42(m,1h),1.99-1.96(m,1h),1.50(d,j＝6.1hz,3h)
[0290]
生物学评价
[0291]
以下结合测试例进一步描述解释本公开中，但这些实施例并非意味着限制本公开中的范围。
[0292]
实验例1本发明实施例提供的化合物的体外khk激酶抑制活性实验
[0293]
1.实验目的
[0294]
测试化合物/化合物组合对人khk-c和khk-a的抑制活性。
[0295]
2.实验材料
[0296]
1)实验试剂
[0297]
试剂供应商cat no.hepesgibco15630-080氯化钠溶液sigmas5150-1l氯化镁溶液sigmam1028-100ml氯化钙溶液阿拉丁c128340tween-20sigmap1379-100mldmsosigmad4540-1latppromegav9102(试剂盒内提供)d-(-)-果糖sigmaf0127adp-glo
tm
kinase assays kitpromegav9102
[0298]
2)实验仪器和耗材
[0299]
实验仪器和耗材供应商/型号optiplate-384,white platepe(perkinelmer)15ml centrifuge tubebiofilecholabcyte-echo 655dragonflysptlabtech-dragonfly discovery 3headenvisionperkinelmer-envision 2105
[0300]
3)pf-06835919(合成参考wo2017115205)，配制成dmso溶液。
[0301]
4)人khk-c和khk-a
[0302]
5)lilly-example 13(合成参考wo2020257171)
[0303]
6)xuan zhu-实施例1(合成参考wo 2020156445)
[0304]
3.实验步骤
[0305]
1)使用echo将化合物打入384-测试板，每孔50nl，终浓度最高10um，3倍稀释，10个浓度点，两次重复。化合物pf06835919(终浓度10um)为阳性对照，dmso为阴性对照。反应体系dmso终浓度为0.5％。
[0306]
2)使用dragonfly discovery加入khk-c或者khk-a蛋白溶液，每孔6ul，蛋白终浓度为30nm。离心机1000rpm迅速离心1min。
[0307]
3)使用dragonfly discovery加入反应底物混合溶液(atp和果糖)，每孔4ul，atp终浓度为150um，果糖终浓度为20mm。离心机1000rpm迅速离心1min。测试板封膜后，23℃恒温培养箱孵育60min。
[0308]
4)使用dragonfly discovery加入adp-glo试剂，每孔10ul。离心机1000rpm迅速离心1min。测试板封膜后，23℃恒温培养箱孵育40min。
[0309]
5)使用dragonfly discovery加入kinase detection试剂，每孔20ul。离心机1000rpm迅速离心1min。测试板封膜后，23℃恒温培养箱孵育60min。
[0310]
6)envision(perkin elmer)读板，分析数据。
[0311]
表1本发明实施例化合物对人khk-c和khk-a抑制活性
[0312][0313]
实验例2本发明实施例提供的化合物的体外hepg2细胞抑制活性实验
[0314]
1.实验材料
[0315]
1)实验试剂
[0316][0317]
2)实验仪器
[0318]
仪器型号供应商echoecho655labcytemultidrop combimultidropthermo scientific二氧化碳培养箱steri-cycle i160thermo scientific细胞计数仪vi-cell xrbeckman coulter离心机st40rthermo scientific高速离心机5910reppendorf封膜机agilent platelocagilent technologies酶标板振荡器4625-1cecnthermo scientific
[0319]
2.实验步骤
[0320]
细胞种板
[0321]
细胞生长培养基：10％fbs,dmem,100u/ml pen/strep,即dmem(500ml) 10％fbs 1％ps
[0322]
1)在超净工作台中，用移液管吸取培养瓶内的生长培养基，并舍弃。加入10ml的dpbs洗去瓶内残留的培养基，舍弃dpbs后，加入3ml，0.05％的胰酶，并将培养瓶转移到37℃培养箱中孵育2min，在消化好的培养瓶中加入10ml的生长培养基，并混合均匀。
[0323]
2将混合均匀的细胞液转移至离心管中，进行1000r/min，5min的离心。
[0324]
3)舍弃离心后的培养基，在离心管中加入适量培养基，用移液器将细胞和培养基吹吸均匀，并吸取1ml细胞悬液，至计数杯中，在细胞计数仪上计数。
[0325]
4)根据计数结果，使用细胞生长培养基，配制200000cell/ml的细胞悬液。用combi将细胞悬液均匀地分配到96孔细胞板中，每孔含50000个hepg2细胞，250ul。
[0326]
5)将细胞板在超净工作台中静置10min后，进行1000r/min，1min的离心。把离心后的细胞板放置到37℃培养箱中过夜孵育24h。
[0327]
化合物处理
[0328]
实验培养基：opti-mem
tm
i(1
×
)reduced serum medium 0.1％casein solution 30mm d-果糖-13
c6
[0329]
1)将过夜培养的细胞板，转移至超净工作台中，使用排枪将细胞板中的生长培养基吸出，在无菌吸水纸上倒扣细胞板30s。
[0330]
2)使用combi在细胞板中加入30ul配制好的实验培养基，1000r/min，离心1min。
[0331]
3)使用echo将化合物稀释到细胞板中的相应位置。每孔1ul，终浓度最高10um，3倍稀释，10个浓度点，二次重复。化合物pf06835919(终浓度10um)为阳性对照，dmso为阴性对照。反应体系dmso终浓度为1％。对完成化合物稀释的细胞板进行1000r/min，
[0332]
1min的离心。
[0333]
4)使用combi，向细胞板中每孔加入70ul的实验培养基，1000r/min，离心1min。转移细胞板至37℃培养箱中孵育3h。
[0334]
5)从培养箱取出孵育好的细胞板，使用排枪吸出细胞板中的实验培养基，在无菌吸水纸上倒扣细胞板30s。
[0335]
6)使用combi，向细胞板中每孔加入200ul的终止液。将细胞板在封板机上，贴上热封膜，在酶标板振荡器上，以3档的振速，振荡5min。震荡后的细胞板进行4℃，4000r/min，
[0336]
10min的离心。
[0337]
7)使用排枪从96孔细胞板中吸出120ul离心后的上清液，转移到96孔v型板中的对应位置。将96孔v型板封膜后，放置到干冰盒中，送样，进行lc-ms的检测。
[0338]
表2本发明实施例化合物对hepg2细胞的抑制活性
[0339]