人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法

1.本发明属于细胞技术领域，具体涉及一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法。


背景技术：

2.jei-002是培养散发性前庭神经鞘膜瘤(sporadic vestibular schwannoma,svs)患者肿瘤细胞而建立的稳定人源细胞系。
3.前庭神经鞘膜瘤是起源于前庭神经鞘膜细胞的良性肿瘤，其生长于桥小脑角区域，瘤体逐渐增大会压迫周围颅神经和脑组织，从而产生听力下降、耳鸣、眩晕、面瘫等相应临床症状，甚至威胁患者生命。其病因分为两种，散发性前庭神经鞘膜瘤和神经纤维瘤病2型(neurofibromatosis type2,nf2)，后者为家族遗传性罕见病。根据国外大规模病例的长期临床随访观察，不同听神经瘤的临床生物学行为之间呈现较大的差异性，大约半数肿瘤能持续生长，另有半数肿瘤生长出现静止甚至缩小。前庭神经鞘膜瘤临床生物学行为的差异性，可决定对其采用不同的治疗方案。目前，在对前庭神经鞘膜瘤的机制探索中仍然存在很多未知。
4.在此机制探索的过程中举步维艰，很大一部分原因是因为没有相应的细胞系。细胞系(cell line)指原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。细胞系为在探索机制的体外实验阶段中提供了操作更方便、生长速度更快、性质更较稳定的实验对象；同时也为动物肿瘤等体内实验提供了良好的实验基础。而现有与听神经瘤相关的细胞系只有两类，一是实验动物来源的听神经瘤细胞，如rt4-d6p2t，为大鼠来源的神经雪旺细胞；二是hei193，为人神经鞘膜瘤细胞，是1999年gene hung团队取自nf2病患者培养的细胞系。故jei-002是一株人源的取自于散发性前庭神经鞘膜瘤患者的细胞系。为今后的前庭神经鞘膜瘤的机制研究提供了物质基础和研究平台。
5.缺点：不同个体的同一种肿瘤存在差异性，即jei-002只能代表此患者前庭神经鞘膜瘤其自身的特点，系所有细胞系所共同的特点。


技术实现要素：

6.针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法。
7.培养人源神经鞘膜瘤永生化细胞系jei-002主要原理：
8.通过体外培养散发性前庭神经鞘膜瘤细胞获得神经鞘膜瘤原代细胞，并利用慢病毒转染技术过表达细胞内的sv40基因，使其获得永生化的特性，即克服了良性肿瘤增殖能力有限的特性，为体内体外实验提供细胞载体基础。
9.为达到上述目的，本发明的解决方案是：
10.第一方面，本发明提供了一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系，该细胞系为jei-002，其源于临床患者前庭神经鞘膜瘤组织，帮助提供前庭神经鞘膜瘤体外研究基础。
11.第二方面，本发明提供了一种上述的人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系的构建方法，其包括如下步骤：
12.(1)分离培养前庭神经鞘膜瘤细胞；
13.(2)进行免疫荧光鉴定；
14.(3)利用慢病毒转染技术过表达细胞内的sv40基因；
15.(4)利用嘌呤霉素筛选转染的细胞；
16.(5)将筛选后的细胞进行扩增，并对jei-002进行细胞鉴定。
17.优选地，步骤(2)中，免疫荧光鉴定的过程包括细胞爬片、固定、破膜封闭、孵育和包埋。
18.优选地，步骤(3)中，转染技术过程中，载体的目的序列如seq id no.1所示。
19.优选地，步骤(4)中，嘌呤霉素筛选转染的细胞时，嘌呤霉素的浓度为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、6μg/ml和7μg/ml。
20.优选地，步骤(5)中，细胞鉴定的过程中，对jei-002使用免疫细胞化学的方法，染色细胞特异标记蛋白，进行鉴定。
21.由于采用上述方案，本发明的有益效果是：
22.jei-002是一株人源的取自于散发性前庭神经瘤患者的细胞系，提供了不同前庭神经鞘膜瘤细胞，为今后的前庭神经鞘膜瘤的机制研究提供了多样的物质基础和研究平台。
附图说明
23.图1为本发明的实施例1中细胞培养图。
24.图2为本发明的实施例2中鉴定结果图。
25.图3为本发明的实施例3中载体图谱。
26.图4为本发明的实施例3中细胞转染图。
27.图5为本发明的实施例5中永生化的细胞图。
28.图6为本发明的实施例6中sanger测序图。
具体实施方式
29.本发明提供了一种人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系及其构建方法。
30.培养人源前庭神经鞘膜瘤永生化细胞系jei-002主要步骤
31.实施例1：
32.一、人源前庭神经鞘膜瘤细胞的分离培养
33.1、实验试剂：
34.(1)完全培养基：dmem高糖 1
×
n2添加剂 insulin 5μg/ml 10％fbs 1
×
青霉素/链霉素溶液(p/s)；
35.(2)基础培养基：dmem高糖；
36.(3)缓冲液：无菌不含ca
2
和mg
2
的1
×
pbs 1
×
p/s，ph＝7.4；
37.(4)消化液：0.125％胰蛋白酶 0.1％ⅱ型胶原酶；
38.(5)包被液：无菌层粘连蛋白(laminin)10μg/ml 1
×
pbs溶解；
39.(6)75％医用酒精；
40.(7)胎牛血清(fbs)。
41.2、分离培养
42.(1)将手术中取出的前庭神经鞘膜瘤组织置于无菌pbs缓冲液中低温运输；
43.(2)在超净工作台内取出组织，用75％酒精浸泡2min左右，置于含有p/s的pbs中；
44.(3)将组织块剪成边长约为0.1cm的正方形，反复清洗后弃上清，置于含有完全培养基的培养皿中，37℃孵育30-60min；
45.(4)用镊子夹入培养瓶中，倒置于5％co2培养箱中孵育2h；
46.(5)分别加入2ml肿瘤细胞完全培养基，浸润组织块，但不能使组织块漂浮，置于5％co2细胞培养箱中；
47.(6)每隔3天换液，待组织块周围生长的细胞融合成片，即可去除组织块，用胰蛋白酶消化细胞，重新铺瓶。细胞培养图片如图1所示，表明细胞形态特征。
48.实施例2：
49.二、免疫荧光鉴定
50.(1)细胞爬片
51.取3片玻璃片于24孔板中，每孔加入1ml培养基，加入0.02百万个/孔的细胞，置培养箱2h或过夜。
52.(2)固定
53.细胞爬片后，吸出培养基，用pbs洗1遍，加入4％pfa于4℃固定30min。用pbs洗3
×
5min/次。也可最后一次不吸出pbs，放4℃过夜。
54.(3)破膜封闭
55.玻璃片封闭液配置：0.5％trition x-100与pbs 1:1混合，再加10％胎牛血清。
56.将玻片除去水分，置于培养皿支撑物上，取50μl破膜封闭液滴于防水膜上，将玻片上有细胞的一面盖上2h。
57.(4)一抗孵育
58.一抗配制：s100抗体与pbs 1:100(200)稀释
59.破膜封闭后，取50μl一抗于防水膜上(湿盒中)，将玻片(有细胞的一面)盖上置于4℃(最多可放置一周)。
60.(5)二抗孵育
61.室温避光孵育二抗(二抗:pbs＝1:500)2h后，pbs洗3
×
5min/次，染dapi(dapi:pbs＝1:1000)5min，pbs洗3
×
5min/次。
62.(6)包埋
63.玻片上各滴1滴fluoromount-g，将有细胞的一面盖上。
64.鉴定细胞为p1代细胞
65.(7)鉴定结果如图2所示，鉴定分离的细胞具有神经鞘膜瘤特征。
66.实施例3：
67.三、转染
68.(1)sv40过表达慢病毒基本信息
69.sv40过表达慢病毒
70.1)、载体原件信息：ef1α-sv40-ires-puromycin；
71.2)、载体携带荧光标记：无；
72.3)、载体抗性基因标记：嘌呤霉素(puromycin)；
73.4)、载体图谱如图3所示，明确永生化病毒特征；
74.5)、载体目的序列信息如下：
75.下划线区域为目的序列区
76.gtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgaggatctatttccggtgaattcatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgcctgggggaatattcctctgatgagaaaggcatatttaaaaaaatgcaaggagtttcatcctgataaaggaggagatgaagaaaaaatgaagaaaatgaatactctgtacaagaaaatggaagatggagtaaaatatgctcatcaacctgactttggaggcttctgggatgcaactgagattccaacctatggaactgatgaatgggagcagtggtggaatgcctttaatgaggaaaacctgttttgctcagaagaaatgccatctagtgatgatgaggctactgctgactctcaacattctactcctccaaaaaagaagagaaaggtagaagaccccaaggactttccttcagaattgctaagttttttgagtcatgctgtgtttagtaatagaactcttgcttgctttgctatttacaccacaaaggaaaaagctgcactgctatacaagaaaattatggaaaaatattctgtaacctttataagtaggcataacagttataatcataacatactgttttttcttactccacacaggcatagagtgtctgctattaataactatgctcaaaaattgtgtacctttagctttttaatttgtaaaggggttaataaggaatatttgatgtatagtgccttgactagagatccattttctgttattgaggaaagtttgccaggtgggttaaaggagcatgattttaatccagaagaagcagaggaaactaaacaagtgtcctggaagcttgtaacagagtatgcaatggaaacaaaatgtgatgatgtgttgttattgcttgggatgtacttggaatttcagtacagttttgaaatgtgtttaaaatgtattaaaaaagaacagcccagccactataagtaccatgaaaagcattatgcaaatgctgctatatttgctgacagcaaaaaccaaaaaaccatatgccaacaggctgttgatactgttttagctaaaaagcgggttgatagcctacaattaactagagaacaaatgttaacaaacagatttaatgatcttttggataggatggatataatgtttggttctacaggctctgctgacatagaagaatggatggctggagttgcttggctacactgtttgttgcccaaaatggattcagtggtgtatgactttttaaaatgcatggtgtacaacattcctaaaaaaagatactggctgtttaaaggaccaattgatagtggtaaaactacattagcagctgctttgcttgaattatgtggggggaaagctttaaatgttaatttgcccttggacaggctgaactttgagctaggagtagctattgaccagtttttagtagtttttgaggatgtaaagggcactggaggggagtccagagatttgccttcaggtcagggaattaataacctggacaatttaagggattatttggatggcagtgttaaggtaaacttagaaaagaaacacctaaataaaagaactcaaatatttccccctggaatagtcaccatgaatgagtacagtgtgcctaaaacactgcaggccagatttgtaaaacaaatagattttaggcccaaagattatttaaagcattgcctggaacgcagtgagtttttgttagaaaagagaataattcaaagtggcattgctttgcttcttatgttaatttggtacagacctgtggctgagtttgctcaaagtattcagagcagaattgtggagtggaaagagagattggacaaagagtttagtttgtcagtgtatcaaaaaatgaagtttaatgtggctatgggaattggagttttagattggctaagaaacagtgatgatgatgatgaagacagccaggaaaatgctgataaaaatgaagatggtggggagaagaacatggaagactcagggcatgaaacaggcattgattcacagtcccaaggctcatttcaggcccctcagtcctcacagtctgttcatgatcataatcagccataccacatttgtagaggttttacttgctttaaaaaacctcccacacctccccctgaacctgaaacagagcaaaagctcatttctgaagaggacttgtaatctagacacagtgcagcactctcaacgttcaaggacactacgcgtctggaacaatcaacc。
77.(2)转染
78.1)、将细胞接种6孔板，每孔细胞数约为1
×
105个；
79.2)、第二天，待细胞贴壁后，换液；
80.3)、加入1ml完全培养基，再加20μl的sv40过表达慢病毒；
81.4)、混匀后继续培养；
82.5)、12h后观察细胞状态，并更换为新鲜培养基；
83.6)、当细胞长满板底后，传代至t25培养瓶中。
84.细胞转染图片如图4所示，特异性筛选前的永生化细胞。
85.实施例4：
86.四、筛选
87.(1)杀灭曲线的确定
88.1)、将未转染的细胞按每孔0.05百万个铺入24孔板，孵育过夜；
89.2)、第二天，除去24孔板中旧的培养基；
90.3)、将含不同浓度嘌呤霉素(1μg/ml，2μg/ml，3μg/ml，4μg/ml，5μg/ml，6μg/ml，7μg/ml)的新鲜培养基加入已铺有细胞的24孔板；
91.4)、每2天更换新鲜的筛选培养基；
92.5)、每天观察细胞的存活比例；
93.6)、最小的嘌呤霉素使用浓度就是从嘌呤霉素筛选开始1-4d内杀死所有细胞的最低筛选浓度。
94.结果：嘌呤霉素的使用浓度为2μg/ml，作用时间为2d。
95.(2)嘌呤霉素筛选转染细胞
96.1)、第一天，将转染的细胞按每孔0.05百万个铺入24孔板，孵育过夜；
97.2)、第二天，除去24孔板中旧的培养基；
98.3)、加入含嘌呤霉素(2μg/ml)的筛选培养基，孵育；
99.4)、每2天更换新鲜的筛选培养基；
100.5)、每天观察细胞的存活比例；
101.6)、在同一时间点(2d)存活的细胞，即为转染成功的细胞；
102.7)、对筛选后的细胞进行扩增。
103.实施例5：
104.五、细胞扩增
105.将筛选后的细胞进行扩增，筛选后的细胞为p1代，扩增至少到12代。
106.永生化的细胞图片如图5所示。
107.实施例6：
108.六、细胞鉴定
109.str鉴定：
110.将组织和建立的细胞系分别经过str检测，并且采用dsmz tools进行细胞系比对(其中包含来自于atcc、dsmz、jcrb和riken数据库的2455个细胞系str数据)，经鉴定：该株细胞dna分型在细胞系检索中没有找到匹配的细胞系。
111.sanger测序：
112.如图6所示，在组织样本和jei-002细胞系中均测出：关于细胞中nf2的突变特征，其nf2基因2号外显子存在杂合突变c.240g》a。
113.免疫细胞化学鉴定：
114.为了确定永生化后的细胞株是来源于神经鞘膜瘤原代细胞，利用其雪旺细胞特性，通过对jei-002使用免疫细胞化学的方法，染色细胞特异标记蛋白，达到鉴定的目的：其中s100作为( )。符合人源神经鞘膜瘤神经瘤细胞的蛋白表现特点。
115.上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
116.117.