长效肾上腺髓质素衍生物

长效肾上腺髓质素衍生物
1.本技术是申请日为2016年09月16日，申请号为201680053494.7，发明名称为“长效肾上腺髓质素衍生物”的申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种长效肾上腺髓质素衍生物。


背景技术：

3.肾上腺髓质素(adrenomedullin，下文中也记载为“am”)是在1993年从嗜铬细胞瘤组织分离和鉴定的生物活性肽(非专利文献1)。发现之初，已证实am能够发挥很强的扩张血管的降压作用。例如，专利文献1记载了具有降血压作用的包含人am氨基酸序列的肽。
4.通过随后的研究表明，am能够发挥心血管保护作用、抗炎症作用、血管生成作用及促进组织修复作用等多种药理作用。此外，为了将am的药理作用应用在疾病治疗中，对于各种疾病患者进行了am的给药研究。其中，am作为炎症性肠病、肺动脉高压症、周围血管疾病或急性心肌梗塞的治疗药的有用性受到期待。
5.例如，专利文献2记载了一种含有以下物质作为有效成分的非细菌性的炎症性肠病的预防或治疗剂：具有抑制非细菌性炎症的活性的肾上腺髓质素或其衍生物，或者是具有抑制非细菌性炎症的活性的它们的盐。
6.专利文献3记载了一种预防或治疗方法，其是对需要预防或治疗的难以使用类固醇制剂、免疫抑制剂或生物制剂或使用效果不明显的炎症性肠病的患者进行所述炎症性肠病的预防或治疗的方法，所述方法包括对所述患者给予有效量的肾上腺髓质素、具有抑制炎症活性的其修饰物或者具有抑制炎症活性的所述肾上腺髓质素或所述修饰物的盐。
7.另外，从对am的构效关系研究，进展到确定了有助于am生物活性的必需序列(非专利文献2～9)。
8.已知通常肽由于在体内(例如血液中)的代谢反应而导致体内的半衰期较短。因此，当把肽用作药物的有效成分时，通过将其他基团与该肽连接而成的肽衍生物的形式，有时能够延长体内的半衰期，改善药物动力学。
9.例如，专利文献4记载了一种在生物学上具有活性的垂体中间叶激素(intermedin)肽或肾上腺髓质素肽，其特征在于，具有超过1.5小时的血清半衰期。该文献记载了通过酰胺键连接烷基和肽部分。
10.专利文献5记载了一种通过am的tyr1的酚羟基与聚乙二醇(以下也记作“peg”)基连接而成的am衍生物。
11.专利文献6记载了一种使peg-醛与肽的游离氨基反应，肽的游离氨基与peg基连接而成的肽衍生物的制造方法。该文献记载了am作为所述肽。
12.非专利文献10记载了一种通过酰胺键连接am n末端的α氨基与peg基而成的am衍生物。该文献记载了连接peg基而成的am衍生物的血液中的半衰期得到延长。
13.现有技术文献
adrenomedullin.european journal of pharmacology，2015年，第764卷，140-148页


技术实现要素：

33.发明所要解决的问题
34.如上所述，为了从提高体内持续性的观点出发来改善am的药物动力学，已知有将am与peg基这样的其他基团连接而成的am衍生物。但是，已知的am衍生物存在有改进的余地。例如，当连接如am这种较小的肽和peg基这种较大的基团时，取决于peg基的分子量并作为结果得到的am衍生物的各种性质可能会变化很大。此外，如专利文献4、5和非专利文献10所述，当肽部分与其他基团通过如酰胺键或酯键这样的能因生物反应而断裂的化学键连接时，给药后在较短时间内该化学键可能断裂。此外，当如专利文献5所述的am衍生物那样，am的氨基酸残基的侧链与其他基团连接时，am部分的构象会发生变化，与识别am的am受体的亲和性可能会下降。这种情况下，作为结果得到的am衍生物，其作为am的药理作用可能会降低。
35.除了心血管保护作用、抗炎症作用、血管生成作用和促进组织修复作用等药理作用外，am还具有很强的扩张血管作用。因此，当向对象给药am或am衍生物时，由于很强的扩张血管作用，可能引起如血压下降过度这样的不良副作用。尤其是在希望表现出除了扩张血管作用之外的药理作用而使用am或am衍生物的情况下，这种副作用的产生会成为问题。
36.因此，本发明的目的在于提供一种能够维持肾上腺髓质素的药理作用并实质性抑制不良副作用的长时间持续作用的新型肾上腺髓质素衍生物。
37.解决问题的技术方案
38.本发明人研究了各种用于解决上述问题的技术方案。本发明人发现通过亚甲基或尿烷基连接肾上腺髓质素的n末端的α氨基和具有特定分子量的peg基，由此可以保持与肾上腺髓质素同等程度的生物活性，与肾上腺髓质素相比可以延长血液中的半衰期。此外，还发现具有上述特征的新型肾上腺髓质素衍生物能够实质性抑制如血压下降过度这样的不良副作用。本发明人基于上述见解完成了本发明。
39.即，本发明的要旨如下。
40.(1)一种由式(i)表示的化合物或其盐，或者它们的水合物：
41.a-ch
2-b
ꢀꢀꢀ
(i)，
42.式(i)中，a为含有1个以上聚乙二醇基的修饰基团，b为由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分，
43.其中，肽部分b通过其n末端α氨基的氮原子与亚甲基的碳原子共价结合来与剩余部分连接。
44.(2)根据上述实施方式(1)所述的化合物，其中，a为由下述式(ii)表示的修饰基团：
45.[化1]
[0046][0047]
式(ii)中，a为1以上的整数，m为1以上的整数，
[0048]
l1为m 1价的直链状或支链状的连接基团，当l1为多个时，这些多个l1可以彼此相同或不同，
[0049]
l2和l2’
彼此独立地为化学键或二价连接基团，当l2’
为多个时，这些多个l2’
可以彼此相同或不同；
[0050]
m1为由式(iii)表示的聚乙二醇基，当m1为多个时，这些多个m1可以彼此相同或不同：
[0051]
#-(ch2ch2o)
n-**
ꢀꢀꢀ
(iii)，
[0052]
式(iii)中，n为1以上的整数，**为与l1的结合位置，#为与o或l2’
的结合位置，
[0053]
m2为化学键或由式(iii)表示的聚乙二醇基，当m2为多个时，这些多个m2可以彼此相同或不同；
[0054]
r1为氢、取代或非取代的c1～c
20
烷基、取代或非取代的c2～c
20
烯基、取代或非取代的c2～c
20
炔基、取代或非取代的c3～c
20
环烷基、取代或非取代的c4～c
20
环烯基、取代或非取代的c4～c
20
环炔基、取代或非取代的3～6元杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
烷基、取代或非取代的c4～c
20
芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳烷基、取代或非取代的5～15元杂芳基、取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
烷基或者取代或非取代的酰基；
[0055]
*为与剩余部分的结合位置。
[0056]
(3)根据上述实施方式(1)或(2)所述的化合物，其中，
[0057]
a为由下述式(v)、(vi)、(vii)或(viii)表示的修饰基团：
[0058]
[化2]
[0059][0060]
式(v)、(vi)、(vii)或(viii)中，a为1以上的整数；
[0061]
m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
彼此独立地为化学键或由式(iii)表示的聚乙二醇基，当m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
为多个时，这些多个m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
可以彼此相同或不同，且m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
中的至少一个为由式(iii)表示的聚乙二醇基：
[0062]
#-(ch2ch2o)
n-**
ꢀꢀꢀ
(iii)，
[0063]
式(iii)中，n为1以上的整数，**为与r3、r3’
或ch的结合位置，#为与o的结合位置；
[0064]
r1、r1’
、r
1”和r1”’
彼此独立地为氢、取代或非取代的c1～c
20
烷基、取代或非取代的c2～c
20
烯基、取代或非取代的c2～c
20
炔基、取代或非取代的c3～c
20
环烷基、取代或非取代的c4～c
20
环烯基、取代或非取代的c4～c
20
环炔基、取代或非取代的3～6元杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
烷基、取代或非取代的c4～c
20
芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳烷基、取代或非取代的5～15元杂芳基、取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
烷基或者取代或非取代的酰基；
[0065]
r2为化学键、取代或非取代的c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c2～c
20
亚烯基、取代或非取代的c2～c
20
亚炔基、取代或非取代的c3～c
20
亚环烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚环烯基、取代或非取代的c4～c
20
亚环炔基、取代或非取代的3～6元亚杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基亚烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳基亚烷基、取代或非取代的5～15元亚杂芳基或者取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
亚烷基(所述基团也可以包含1个以上的杂原子、酰
胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-))、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)；
[0066]
r3、r3’
和r
3”彼此独立地为化学键、取代或非取代的c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c2～c
20
亚烯基、取代或非取代的c2～c
20
亚炔基、取代或非取代的c3～c
20
亚环烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚环烯基、取代或非取代的c4～c
20
亚环炔基、取代或非取代的3～6元亚杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基亚烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳基亚烷基、取代或非取代的5～15元亚杂芳基或者取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
亚烷基(所述基团也可以包含1个以上的杂原子、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-))、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)，当r3、r3’
和r
3”为多个时，这些多个r3、r3’
和r
3”可以彼此相同或不同；
[0067]
*为与剩余部分的结合位置。
[0068]
(4)根据上述实施方式(1)～(3)中任一项所述的化合物，其中，式(iii)表示的聚乙二醇基合计具有1～100kda范围的重均分子量。
[0069]
(5)根据上述实施方式(1)～(4)中任一项所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0070]
(i)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽；
[0071]
(ii)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0072]
(iii)在(ii)的肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0073]
(iv)在(i)～(iii)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0074]
(v)在(i)～(iv)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0075]
(vi)在(i)～(iv)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0076]
(6)根据上述实施方式(5)所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0077]
(i)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽；
[0078]
(ii)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0079]
(v)在(i)或(ii)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0080]
(vi)在(i)或(ii)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0081]
(7)根据上述实施方式(5)所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0082]
(iv’)在(i)～(iii)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0083]
(v)在(iv’)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0084]
(vi)在(iv’)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0085]
(8)根据上述实施方式(1)～(5)中任一项所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0086]
(a)由seq id no:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0087]
(b)由seq id no:3的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:3的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0088]
(c)由seq id no:5的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:5的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0089]
(d)由seq id no:7的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:7的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0090]
(e)由seq id no:9的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:9的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0091]
(f)由seq id no:11的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:11的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0092]
(g)在(a)～(f)任一个肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0093]
(h)在(a)～(g)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0094]
(i)在(a)～(h)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0095]
(j)在(a)～(h)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0096]
(9)根据上述实施方式(8)所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0097]
(a)由seq id no:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0098]
(b)由seq id no:3的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:3的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0099]
(c)由seq id no:5的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:5的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0100]
(d)由seq id no:7的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:7的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0101]
(e)由seq id no:9的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:9的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0102]
(f)由seq id no:11的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:11的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0103]
(i)在(a)～(f)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0104]
(j)在(a)～(f)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0105]
(10)根据上述实施方式(8)所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0106]
(h’)在(a)～(d)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；或者，在(e)或(f)的肽中从n末端侧起缺失第1～13位、第1～8位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0107]
(i)在(h’)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0108]
(j)在(h’)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0109]
(11)根据上述实施方式(1)～(10)中任一项所述的化合物或其盐，或者它们的水合物的制造方法，所述方法包括：
[0110]
连接步骤，使由肾上腺髓质素或其修饰物衍生的肽部分b的前体与由式(i-1)表示的含有1个以上聚乙二醇基的修饰基团a的前体醛在还原剂存在下反应，得到由式(i)表示的化合物，
[0111]
a-cho
ꢀꢀꢀ
(i-1)。
[0112]
(12)一种由式(x)表示的化合物或其盐，或者它们的水合物：
[0113]a’‑
co-b
ꢀꢀꢀ
(x)，
[0114]
式(x)中，a’为含有1个以上聚乙二醇基的修饰基团，b为由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分，
[0115]
其中，肽部分b通过其n末端的α氨基的氮原子与羰基的碳原子共价结合来与剩余部分连接；
[0116]
a’为由下述式(xi)、(xi’)或(xii)表示的修饰基团：
[0117]r1-o-m
1-*
ꢀꢀꢀ
(xi)
[0118]
[化3]
[0119][0120]
式(xi)、(xi’)或(xii)中，a为1以上的整数，m1为由式(iii)表示的聚乙二醇基：
[0121]
#-(ch2ch2o)
n-**
ꢀꢀꢀ
(iii)，
[0122]
式(iii)中，n为1以上的整数，**为与*的结合位置，#为与o的结合位置；
[0123]
m3、m3’
和m
3”彼此独立地为化学键或由式(iii)表示的聚乙二醇基，当m3、m3’
和m
3”为多个时，这些多个m3、m3’
和m
3”可以彼此相同或不同，且m3、m3’
和m
3”中的至少一个为由式(iii)表示的聚乙二醇基，：
[0124]
#-(ch2ch2o)
n-**
ꢀꢀꢀ
(iii)，
[0125]
式(iii)中，n为1以上的整数，**为与r3、r3’
或ch的结合位置，#为与o的结合位置；
[0126]
r1和r1’
彼此独立地为氢、取代或非取代的c1～c
20
烷基、取代或非取代的c2～c
20
烯基、取代或非取代的c2～c
20
炔基、取代或非取代的c3～c
20
环烷基、取代或非取代的c4～c
20
环烯基、取代或非取代的c4～c
20
环炔基、取代或非取代的3～6元杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
烷基、取代或非取代的c4～c
20
芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳烷基、取代或非取代的5～15元杂芳基或者取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
烷基或者取代或非取代的酰基；
[0127]
r2为化学键、取代或非取代的c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c2～c
20
亚烯基、取代
或非取代的c2～c
20
亚炔基、取代或非取代的c3～c
20
亚环烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚环烯基、取代或非取代的c4～c
20
亚环炔基、取代或非取代的3～6元亚杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基亚烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳基亚烷基、取代或非取代的5～15元亚杂芳基或者取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
亚烷基(所述基团也可以包含1个以上的杂原子、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-))、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)；
[0128]
r3、r3’
和r
3”彼此独立地为化学键、取代或非取代的c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c2～c
20
亚烯基、取代或非取代的c2～c
20
亚炔基、取代或非取代的c3～c
20
亚环烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚环烯基、取代或非取代的c4～c
20
亚环炔基、取代或非取代的3～6元亚杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基亚烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳基亚烷基、取代或非取代的5～15元亚杂芳基或者取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
亚烷基(所述基团也可以包含1个以上的杂原子、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-))、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)，当r3、r3’
和r
3”为多个时，这些多个r3、r3’
和r
3”可以彼此相同或不同；
[0129]
*为与剩余部分的结合位置。
[0130]
(13)一种药物，其含有上述实施方式(1)～(10)和(12)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物作为有效成分。
[0131]
(14)根据上述实施方式(13)所述的药物，其用于预防或治疗循环系统疾病(循環器疾患)、炎症性疾病或周围血管疾病。
[0132]
(15)一种循环系统疾病、炎症性疾病或周围血管疾病的预防或治疗剂，其含有上述实施方式(1)～(10)和(12)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物作为有效成分。
[0133]
(16)一种药物组合物，其含有上述实施方式(1)～(10)和(12)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物、1种以上的药学上可接受的载体。
[0134]
(17)根据上述实施方式(16)所述的药物组合物，其用于预防或治疗循环系统疾病、炎症性疾病或周围血管疾病。
[0135]
(18)一种预防或治疗状况、疾病和/或紊乱的方法，其包括：对需要预防或治疗所述状况、疾病和/或紊乱的对象，给予有效量的上述实施方式(1)～(10)和(12)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物。
[0136]
(19)根据上述实施方式(18)所述的方法，其中，所述状况、疾病和/或紊乱为循环系统疾病、炎症性疾病或周围血管疾病。
[0137]
(20)根据上述实施方式(1)～(10)和(12)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物，其用于预防或治疗状况、疾病和/或紊乱。
[0138]
(21)根据上述实施方式(20)所述的化合物，其中，所述状况、疾病和/或紊乱为循环系统疾病、炎症性疾病或周围血管疾病。
[0139]
(22)根据上述实施方式(1)～(10)和(12)中任一项所述的化合物或其药学上可接
受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物的用途，其用于制造预防或治疗状况、疾病和/或紊乱的药物。
[0140]
(23)根据上述实施方式(22)所述的用途，其中，所述状况、疾病和/或紊乱为循环系统疾病、炎症性疾病或周围血管疾病。
[0141]
发明效果
[0142]
根据本发明，可以提供一种能够维持肾上腺髓质素的药理作用并实质性抑制不良副作用的长时间持续作用的新型肾上腺髓质素衍生物。
[0143]
本说明书包括作为本技术的优先权基础的日本国专利申请第2015-184685号说明书和/或附图所记载的内容。
附图说明
[0144]
图1是表示断裂肽的反相hplc(rp-hplc)色谱的图。a：来自h.am(1-52)肽的断裂肽的rp-hplc色谱图；b：来自化合物(2)的断裂肽的rp-hplc色谱图。
[0145]
图2是表示通过使用了浓度梯度为10％～20％的聚丙烯酰胺凝胶的sds-page对化合物(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)和(12)分离的结果图。图中，泳道0表示分子量标准物质，泳道1表示化合物(3)，泳道2表示化合物(4)，泳道3表示化合物(5)，泳道4表示化合物(6)，泳道5表示化合物(7)，泳道6表示化合物(8)，泳道7表示化合物(9)，泳道8表示化合物(10)，泳道9表示化合物(11)，泳道10表示化合物(12)。
[0146]
图3是表示通过使用了浓度梯度为10％～20％的聚丙烯酰胺凝胶的sds-page对化合物(1)、(2)、(13)、(14)、(15)、(16)和(17)分离的结果图。图中，泳道0表示分子量标准物质，泳道1表示化合物(1)，泳道2表示化合物(2)，泳道3表示化合物(13)，泳道4表示化合物(14)，泳道5表示化合物(15)，泳道6表示化合物(16)，泳道7表示化合物(17)。
[0147]
图4是表示通过使用了浓度梯度为10％～20％的聚丙烯酰胺凝胶的sds-page对化合物(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)、(34)、(35)、(36)和(37)分离的结果图。图中，泳道0表示分子量标准物质，泳道1表示化合物(25)，泳道2表示化合物(26)，泳道3表示化合物(27)，泳道4表示化合物(28)，泳道5表示化合物(29)，泳道6表示化合物(30)，泳道7表示化合物(31)，泳道8表示化合物(32)，泳道9表示化合物(33)，泳道10表示化合物(34)，泳道11表示化合物(35)，泳道12表示化合物(36)，泳道13表示化合物(37)。
[0148]
图5是表示通过使用了浓度梯度为10％～20％的聚丙烯酰胺凝胶的sds-page对化合物(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)和(24)分离的结果图。图中，泳道0和泳道1表示分子量标准物质，泳道2表示化合物(18)，泳道3表示化合物(19)，泳道4表示化合物(20)，泳道5表示化合物(21)，泳道6表示化合物(22)，泳道7表示化合物(23)，泳道8表示化合物(24)。
[0149]
图6是表示化合物(2)、化合物(4)、化合物(8)或h.am(1-52)给药开始时起的经过时间与平均血压之间的关系图。a：化合物(2)、化合物(4)和h.am(1-52)的结果；b：化合物(8)和h.am(1-52)的结果。
[0150]
图7是表示化合物(8)给药开始时起的经过时间与血浆中am浓度之间的关系图。
[0151]
图8是表示化合物(6)或h.am(1-52)给药开始时起的经过时间与血浆中am浓度之间的关系图。
[0152]
图9是表示化合物(8)或生理盐水给药前2天和给药后9天的自发性高血压大鼠的
血压值图。
[0153]
图10是表示化合物(37)或生理盐水给药后4天和给药后9天的相对于给药前一天的平均收缩压的血压变化值图。
[0154]
图11是表示化合物(8)给药组和对照组中从制备葡聚糖硫酸钠(dss)诱导结肠炎模型时起的经过时间与评分合计值之间的关系图。
[0155]
图12是表示化合物(8)给药组和对照组中从制备2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)诱导结肠炎模型时起的经过时间与体重之间的关系图。a：皮下给予化合物(8)或生理盐水开始禁食的日期；b：给予tnbs的日期。
[0156]
图13是表示化合物(8)给药组和对照组中的结肠重量图。
[0157]
图14是表示化合物(8)给药组和对照组中的结肠肠道长度图。
[0158]
图15是表示化合物(8)给药组和对照组中的右心室重量与左心室重量之比的图。
[0159]
图16是表示化合物(8)给药组和对照组中从制备创伤模型时起的经过时间与创伤面积之间的关系图。
[0160]
图17是表示化合物(8)给药组和对照组中从制备血管闭塞模型时起的经过时间与隐匿平台试验中逃避潜伏期之间的关系图。
[0161]
图18是表示在对于血管闭塞模型大鼠的化合物(8)给药组和对照组中的探索试验中停留率的图。
[0162]
图19是表示化合物(8)给药组和对照组中从给药时起的经过时间与佐剂给药后出现的足趾容积之间的关系图。
[0163]
图20是表示化合物(8)给药组和对照组中从给药时起的经过时间与佐剂给药后出现的肿胀率之间的关系图。
[0164]
图21是表示化合物(8)给药组和对照组中从给药时起的经过时间与佐剂给药后出现的炎症评分之间的关系图。
具体实施方式
[0165]
《1.肾上腺髓质素衍生物》
[0166]
本发明的一个实施方式涉及由式(i)表示的化合物或其盐，或者它们的水合物：
[0167]
a-ch
2-b
ꢀꢀꢀ
(i)。
[0168]
在本说明书中，有时将式(i)表示的化合物记作“肾上腺髓质素衍生物”。
[0169]
本发明中肾上腺髓质素(am)不仅是由人嗜铬细胞瘤组织分离和鉴定的人来源的肽(seq id no:1，非专利文献1)，也可以是例如猪(seq id no:3)、犬(seq id no:5)、牛(seq id no:7)、大鼠(seq id no:9)或小鼠(seq id no:11)等其他非人哺乳动物(例如温血动物)来源的肽(直系同源物)。在体内，这些肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键且c末端被酰胺化。本说明书中，有时将具有二硫键和c末端酰胺基的上述肽记载为“天然肾上腺髓质素”或仅记载为“肾上腺髓质素”。本发明均可适用于上述的任一个肽。
[0170]
本说明书中，“c末端的酰胺化”是指在体内，肽的翻译后修饰的一个方式，具体而言是指肽的c末端氨基酸残基的主链羧基向酰胺基形式转化的反应。此外，本说明书中，“半胱氨酸残基的二硫键的形成”或“半胱氨酸残基的二硫键化”是指在体内，肽的翻译后修饰的一个形式，具体而言是指肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键(-s-s-)的
反应。许多在体内产生的生物活性肽，开始被生物合成为分子量较大的前体蛋白，其在细胞内转运的过程中，经历c末端酰胺化和/或半胱氨酸残基的二硫键化这样的翻译后修饰反应，成为成熟的生物活性肽。c末端的酰胺化通常是通过c末端酰胺化酶对前体蛋白发生作用而进行。对于具有c末端酰胺基的生物活性肽，在其前体蛋白中gly残基连接在酰胺化的c末端羧基，该gly残基通过c末端酰胺化酶转化为c末端酰胺基。此外，前体蛋白的c末端侧前肽中，存在有例如lys-arg或arg-arg等碱性氨基酸残基组合的重复序列(水野，生物化学第61卷，第12号，1435～1461页(1989))。半胱氨酸残基的二硫键化可在氧化的条件下进行。在体内，半胱氨酸残基的二硫键化通常是通过蛋白二硫键异构酶对前体蛋白发生作用而进行。
[0171]
作为众所周知的生物活性物质的肾上腺髓质素是肽。因此，含有肾上腺髓质素作为有效成分的药物在给药对象(例如人类患者)的体内可有效起作用的时间有可能为非常短的时间。因此，通过将肾上腺髓质素与聚乙二醇(peg)等其他基团连接而成的肾上腺髓质素衍生物的形式，进行了延长在体内的半衰期并改善药物动力学的尝试(专利文献4～6和非专利文献10)。但是，当连接肾上腺髓质素这种较小的肽和peg基这种较大的基团时，取决于peg基的分子量并作为结果得到的肾上腺髓质素衍生物的各种性质可能会变化很大。此外，当肾上腺髓质素与其他基团通过如酰胺键或酯键这样的能因生物反应而断裂的化学键连接时，给药后在较短时间内该化学键可能断裂。而且，当肾上腺髓质素的氨基酸残基的侧链与其他基团连接时，肾上腺髓质素部分的构象会发生变化，与识别肾上腺髓质素的肾上腺髓质素受体的亲和性可能会下降。这种情况下，作为结果得到的肾上腺髓质素衍生物，其作为肾上腺髓质素的药理作用可能会降低。
[0172]
肾上腺髓质素具有很强的扩张血管作用。因此，当将有效治疗量的肾上腺髓质素或其衍生物进行单次给药时，由于很强的扩张血管作用，有可能引起不良的副作用(例如，血压过度降低、伴随反射性的交感神经活性增高的心动过速和/或肾素活性增高等)。尤其是在希望出除了扩张血管作用之外的药理作用而使用肾上腺髓质素或其衍生物的情况下，这种副作用的产生会成为问题。为了避免产生上述问题，含有肾上腺髓质素或其衍生物作为有效成分的药物需要通过持续静脉输注向给药对象进行给药。这种给药方法有可能向给药对象强加负担。
[0173]
本发明人发现，通过亚甲基或尿烷基连接肾上腺髓质素的n末端的α氨基和具有特定分子量的peg基，由此可以保持肾上腺髓质素的生物活性，与肾上腺髓质素相比可以延长血液中的半衰期。此外，还发现具有上述特征的新型肾上腺髓质素衍生物能够实质性抑制血压下降过度这样的不良副作用。因此，通过将本发明由式(i)表示的化合物可应用于由肾上腺髓质素来预防或治疗的状况、疾病和/或紊乱，能够实质性抑制不良的副作用，并持续地预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。
[0174]
式(i)中，b需为由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分。本发明中，“由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分”是指具有从肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物中去掉1个氢原子(通常为氨基的1个氢原子，典型为n末端α氨基的1个氢原子)所得结构的一价自由基。本发明中，“肾上腺髓质素的修饰物”是指上述的天然肾上腺髓质素经化学修饰而得的肽。此外，本发明中，“肾上腺髓质素活性”是指肾上腺髓质素所具有的生物活性。作为肾上腺髓质素活性可列举如
下。
[0175]
(1)心血管系统：扩张血管作用、降血压作用、抑制血压升高作用、增加心输出量与改善心功能不全作用、改善肺动脉高压症作用、血管生成作用、淋巴管生成作用、改善血管内皮功能作用、抗动脉硬化作用、心肌保护作用(例如，缺血再灌注损伤或炎症时的心肌保护作用)、抑制心肌梗塞后重塑的作用、抑制心脏肥大的作用和抑制血管紧张素转换酶的作用。
[0176]
(2)肾脏与水电解质系统：利尿作用、利尿钠作用、抑制抗利尿激素的作用、降低醛固酮作用、肾脏保护作用(例如，高血压或缺血再灌注损伤时的肾脏保护作用)、抑制饮用水行为的作用和抑制食盐要求的作用。
[0177]
(3)脑与神经系统：神经保护与抑制脑损伤的作用、抗炎症作用、抑制凋亡的作用(例如，缺血再灌注损伤或炎症时抑制凋亡的作用)、维持自动调节能的作用、抑制氧化应激的作用、改善痴呆症作用和抑制交感神经作用。
[0178]
(4)泌尿生殖系统：改善勃起的作用、改善血流的作用和促进着床的作用。
[0179]
(5)消化系统：抗溃疡作用、组织修复作用、粘膜生成作用、改善血流的作用、抗炎症作用和改善肝功能的作用。
[0180]
(6)骨科：刺激成骨细胞的作用和改善关节炎的作用。
[0181]
(7)内分泌代谢系统：脂肪细胞分化作用、控制脂肪分解的作用、改善胰岛素敏感性的作用、控制胰岛素分泌的作用、抑制抗利尿激素分泌的作用和抑制醛固酮分泌的作用。
[0182]
(8)其他：改善循环的作用、抗炎症作用、控制细胞因子的作用、器官保护作用、抑制氧化应激的作用、组织修复作用(例如，抗褥疮作用)、改善败血症性休克的作用、抑制多器官功能障碍的作用、抑制自身免疫性疾病的作用、抗菌作用、生发作用和护发作用。
[0183]
上述降血压作用优选为血管扩张性降压作用。在上述消化系统的抗炎症作用优选为如类固醇抵抗型或类固醇依赖型的炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病或肠白塞病)这样的炎症性肠病的预防或治疗作用。上述肾上腺髓质素活性通过细胞内camp的浓度升高来表现。因此，可以将细胞内camp的浓度升高作为肾上腺髓质素活性的指标。通过含有由具有上述这样的生物活性的肾上腺髓质素或其修饰物衍生的肽部分b，本发明由式(i)表示的化合物可以表现出与天然肾上腺髓质素实质上基本相同的生物活性(即肾上腺髓质素活性)。
[0184]
上述肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物优选为选自于下述组中的肽：
[0185]
(i)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽；
[0186]
(ii)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0187]
(iii)在(ii)的肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0188]
(iv)在(i)～(iii)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0189]
(v)在(i)～(iv)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0190]
(vi)在(i)～(iv)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0191]
在一个实施方式中，上述肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物优选
为选自于下述组中的肽：
[0192]
(i)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽；
[0193]
(ii)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0194]
(v)在(i)或(ii)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0195]
(vi)在(i)或(ii)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0196]
在另一个实施方式中，上述肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物优选为选自于下述组中的肽：
[0197]
(iv’)在(i)～(iii)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0198]
(v)在(iv’)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0199]
(vi)在(iv’)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0200]
上述(i)～(vi)和(iv’)的肽中，(v)所包含的肽相当于成熟的天然肾上腺髓质素，所述肽由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成，c末端被酰胺化且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键。(i)的由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽相当于在经历c末端酰胺化和半胱氨酸残基的二硫键化的翻译后修饰之前的(即未成熟的)形式的天然肾上腺髓质素。上述(i)～(vi)和(iv’)的肽中，除了上述的肽之外的其他肽相当于肾上腺髓质素的修饰物。
[0201]
上述(ii)的肽可以将上述(i)的肽的两个半胱氨酸残基的硫醇基通过空气氧化或使用适合的氧化剂进行氧化转化为二硫键而形成。通过使用上述(ii)的肽，可以使肽部分b的构象类似为天然肾上腺髓质素的构象。由此，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。
[0202]
上述(iii)的肽可以通过使上述(ii)的肽的二硫键转化为亚乙基而形成。由二硫键向亚乙基的取代可以通过本技术领域众所周知的方法来进行(o.keller等，helv.chim.acta，1974年，第57卷，1253页)。通过使用上述(iii)的肽，可以使肽部分b的构象稳定化。由此，式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0203]
上述(iv)的肽中，缺失、取代或添加的氨基酸残基，优选为1～15个的范围，更优选为1～10个的范围，进一步优选为1～8个的范围，特别优选为1～5个的范围，最优选为1～3个的范围。优选(iv)的肽是在(i)～(iii)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～12位、第1～10位、第1～8位、第1～5位或第1～3位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽，更优选(iv)的肽是在(i)～(iii)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽((iv’)的肽)。上述优选的肽中，还可以进一步缺失、取代或添加1个或更多个(例如，1～5个、1～3个，或者1个或两个)氨基酸残基。通过使用上述(iv)或(iv’)的肽，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，通过使用上述(iv)或(iv’)的肽，式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0204]
上述(vi)或(iv’)的肽可以通过c末端酰胺化酶的作用来使c末端的甘氨酸残基转化为c末端酰胺基，从而转化为上述(v)的肽。因此，通过向给药对象给予上述(vi)或(iv’)的肽，在该给药对象的体内经过一定时间后，可以形成c末端被酰胺化的肽。由此，式(i)表
示的化合物可以在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0205]
更优选地，上述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0206]
(a)由seq id no:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0207]
(b)由seq id no:3的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:3的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0208]
(c)由seq id no:5的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:5的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0209]
(d)由seq id no:7的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:7的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0210]
(e)由seq id no:9的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:9的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0211]
(f)由seq id no:11的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:11的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0212]
(g)在(a)～(f)任一个肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0213]
(h)在(a)～(g)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0214]
(i)在(a)～(h)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0215]
(j)在(a)～(h)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0216]
进一步优选地，在一个实施方式中，上述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0217]
(a)由seq id no:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0218]
(b)由seq id no:3的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:3的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0219]
(c)由seq id no:5的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:5的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0220]
(d)由seq id no:7的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:7的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0221]
(e)由seq id no:9的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:9的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0222]
(f)由seq id no:11的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:11的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0223]
(i)在(a)～(f)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0224]
(j)在(a)～(f)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0225]
进一步优选地，在另一个实施方式中，上述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：
[0226]
(h’)在(a)～(d)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位
的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；或者，在(e)或(f)的肽中从n末端侧起缺失第1～13位、第1～8位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0227]
(i)在(h’)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0228]
(j)在(h’)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。
[0229]
上述(h)的肽中，缺失、取代或添加的氨基酸残基，优选为1～12个的范围，更优选为1～10个的范围，进一步优选为1～8个的范围，特别优选为1～5个的范围，最优选为1～3个的范围。优选(h)的肽是在(a)～(g)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～12位、第1～10位、第1～8位、第1～5位或第1～3位的氨基酸且具有肾上腺髓质素活性的肽，更优选(h)的肽是在(a)～(d)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性，或者，在(e)或(f)的肽中从n末端侧起缺失第1～13位、第1～8位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽((h’)的肽)。上述优选的肽中，还可以进一步缺失、取代或添加1个或更多个(例如，1～5个、1～3个，或者1个或两个)氨基酸。通过使用上述(h)或(h’)的肽，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，通过使用上述(h)或(h’)的肽，式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0230]
式(i)中，a需为含有1个以上peg基的修饰基团。在修饰基团a中，含有1个以上peg基的形式没有特别限制。例如，1个以上peg基可以配置在修饰基团a的末端部，还可以配置在修饰基团a的内部。此外，修饰基团a还可以是本技术领域已知的含有peg基的直链状或支链状基团的各种基团。作为可用作修饰基团a的已知基团没有限制，例如可列举wo 1995/11924、wo 2006/084089、wo 98/41562、wo 2005/079838、wo 2002/060978、wo 2001/048052、wo 1998/055500、wo 1996/021469、wo 2003/040211和日本专利特开平04-108827等公开的基团。通过将含有1个以上peg基的基团用作修饰基团a，式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0231]
优选地，a为由下述式(ii)表示的修饰基团：
[0232]
[化4]
[0233][0234]
式(ii)中，a为1以上的整数，m为1以上的整数，
[0235]
l1为m 1价的直链状或支链状的连接基团，当l1为多个时，这些多个l1可以彼此相同或不同，
[0236]
l2和l2’
彼此独立地为化学键或二价连接基团，当l2’
为多个时，这些多个l2’
可以彼此相同或不同，
[0237]
m1为peg基，当m1为多个时，这些多个m1可以彼此相同或不同，
[0238]
m2为化学键或peg基，当m2为多个时，这些多个m2可以彼此相同或不同，
[0239]
r1为氢或一价基团，
[0240]
*为与剩余部分的结合位置。
[0241]
m为连接基团l1的支链数。例如，当m为1时，l1为二价连接基团，并且相对于末端方向为非支链、即直链状的基团。当m为2以上时，l1为三价以上的连接基团，并且相对于末端
方向为两个支链以上的基团。m通常为1以上的整数且5以下的整数，优选为1～5的范围，更优选为1～4的范围，进一步优选为1～3的范围。当连接基团l1的支链数m在上述范围内时，含有peg基的修饰基团a可以具有直链状或支链状的结构。
[0242]
a为peg基m1和m2，以及连接基团l1和l2’
的单元重复数。例如，当a为1时，上述单元不具有重复结构。当a为2以上，且m为1时，上述单元具有直链状的重复结构。当a为2以上，且m为2以上时，上述单元具有树形支链状的重复结构。a通常为1以上的整数、5以下的整数，优选为1～5的范围，更优选为1～2的范围。当peg基m1和m2，以及连接基团l1和l2’
的单元重复数a在上述范围内时，含有peg基的修饰基团a可以具有直链状或支链状的结构。
[0243]
在m1和m2中，peg基通常为由式(iii)表示的基团：
[0244]
#-(ch2ch2o)
n-**
ꢀꢀꢀ
(iii)。
[0245]
式(iii)中，**为与l1的结合位置，#为与o或l2’
的结合位置。作为在修饰基团a中的由式(iii)表示的peg基的重均分子量的合计，通常为1kda以上，优选为5kda以上，更优选为10kda以上，进一步优选为20kda以上，通常为2000kda以下，优选为1000kda以下，更优选为100kda以下，进一步优选为80kda以下，特别优选为60kda以下。作为修饰基团a中的由式(iii)表示的peg基的合计，通常具有的重均分子量在1～2000kda的范围，例如1～1000kda的范围，优选具有1～100kda的范围的重均分子量，更优选具有5～80kda的范围的重均分子量，进一步优选具有10～60kda的范围的重均分子量，特别优选具有20～60kda的范围的重均分子量。当修饰基团a中的由式(iii)表示的peg基的合计重均分子量在上述范围内时，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，式(i)表示的化合物可以实质性抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0246]
式(iii)中，n为基于上述重均分子量定义的环氧乙烷单元的重复数。当n是基于上述重均分子量的优选范围定义时，通常为约20以上、优选约110以上、更优选约230以上、进一步优选约460以上的整数，通常为约45000以下、优选约22000以下、更优选约2200以下、进一步优选1820以下、特别优选约1360以下的整数。当n是基于上述重均分子量的优选范围定义时，通常为约20～45000的范围，例如约20～22000的范围，优选为约1～2200的范围，更优选为约110～1820的范围，进一步优选为约230～1360的范围，特别优选为约460～1360的范围。当重复数n在上述范围内时，式(ii)表示的修饰基团所含有的peg基的合计重均分子量在上述范围内。因此，当重复数n在上述范围内时，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，式(i)表示的化合物可以实质性抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0247]
r1优选为氢、取代或非取代的c1～c
20
烷基、取代或非取代的c2～c
20
烯基、取代或非取代的c2～c
20
炔基、取代或非取代的c3～c
20
环烷基、取代或非取代的c4～c
20
环烯基、取代或非取代的c4～c
20
环炔基、取代或非取代的3～6元杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
烷基、取代或非取代的c4～c
20
芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳烷基、取代或非取代的5～15元杂芳基、取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
烷基或者取代或非取代的酰基，更优选为氢、取代或非取代的c1～c
20
烷基、取代或非取代的c2～c
20
烯基或者取代或非取代的c2～c
20
炔基，进一步优选为氢、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基或己基，特别优选为甲基。当上述基团被取代时，该取代基各自独立地优选为选自
于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、取代或非取代的c1～c5烷基、取代或非取代的c2～c5烯基、取代或非取代的c2～c5炔基、取代或非取代的c3～c6环烷基、取代或非取代的c3～c6环烯基、取代或非取代的c3～c6环炔基、取代或非取代的氨基和取代或非取代的c1～c5烷氧基，更优选为选自于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、非取代的c1～c5烷基、非取代的c2～c5烯基、非取代的c2～c5炔基、非取代的c3～c6环烷基、非取代的c3～c6环烯基、非取代的c3～c6环炔基、非取代的氨基和非取代的c1～c5烷氧基。当r1为上述基团时，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，式(i)表示的化合物可以实质性抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0248]
l1为m 1价的直链状或支链状的连接基团。l1优选为取代或非取代的m 1价的直链状或支链状的烃基。上述基团可以含有1个以上的杂原子、脂环基、芳基、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)。当上述基团被取代时，该取代基各自独立地优选为选自于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、取代或非取代的直链状或支链状的烃基。
[0249]
l2和l2’
彼此独立地为化学键或二价连接基团。当l2和l2’
为二价连接基团时，l2和l2’
彼此独立地优选为取代或非取代的二价烃基、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)，更优选为取代或非取代的c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c2～c
20
亚烯基、取代或非取代的c2～c
20
亚炔基、取代或非取代的c3～c
20
亚环烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚环烯基、取代或非取代的c4～c
20
亚环炔基、取代或非取代的3～6元亚杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基亚烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳基亚烷基、取代或非取代的5～15元亚杂芳基或者取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
亚烷基、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)。上述基团可以含有1个以上的杂原子、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)。当上述基团被取代时，该取代基各自独立地优选为选自于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、取代或非取代的直链状或支链状的烃基，更优选为选自于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、非取代的c1～c5烷基、非取代的c2～c5烯基、非取代的c2～c5炔基、非取代的c3～c6环烷基、非取代的c3～c6环烯基、非取代的c3～c6环炔基、非取代的氨基和非取代的c1～c5烷氧基。
[0250]
当l1、l2和l2’
为上述基团时，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，式(i)表示的化合物可以实质性抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0251]
优选的修饰基团a为由下述式(v)、(vi)、(vii)或(viii)表示的修饰基团：
[0252]
[化5]
[0253][0254]
式(v)、(vi)、(vii)和(viii)中，
[0255]
a为1以上的整数，
[0256]
m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
彼此独立地为化学键或peg基，当m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
为多个时，这些多个m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
可以彼此相同或不同，且m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
中的至少一个为peg基，
[0257]
r1、r1’
、r
1”和r1”’
彼此独立地为氢或一价基团，
[0258]
r2为化学键或二价基团，
[0259]
r3、r3’
和r
3”彼此独立地为化学键或二价基团，当r3、r3’
和r
3”为多个时，这些多个r3、r3’
和r
3”可以彼此相同或不同，
[0260]
*为与剩余部分的结合位置。
[0261]
a为含有peg基m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
的单元重复数。例如，当a为1时，上述单元不具有重复结构。式(v)中，当a为2以上时，上述单元具有直链状的重复结构。式(vi)、(vii)和(viii)中，当a为2以上时，上述单元具有树形支链状的重复结构。a通常为1以上的整数、5以下的整数，优选为1～5的范围，更优选为1～2的范围。当含有peg基m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
的单元重复数a在上述范围内时，含有peg基的修饰基团a可以具有直链状或支链状的结构。
[0262]
当m3、m3’
、m
3”、m3”’
和m3””
为peg基时，该peg基通常为由式(iii)表示的基团。式(iii)表示的peg基具有与上述相同的含义。这种情况下，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，式(i)表示的化合物可以实质性抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0263]
r1具有与上述相同的含义。此外，r1’
、r
1”和r1”’
具有与上述r1相同的含义。这种情况
下，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，式(i)表示的化合物可以实质性抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0264]
r2优选为化学键、取代或非取代的二价烃基、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)，更优选为化学键、取代或非取代的c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c2～c
20
亚烯基、取代或非取代的c2～c
20
亚炔基、取代或非取代的c3～c
20
亚环烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚环烯基、取代或非取代的c4～c
20
亚环炔基、取代或非取代的3～6元亚杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基亚烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳基亚烷基、取代或非取代的5～15元亚杂芳基或者取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
亚烷基、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)。上述二价烃基可以含有1个以上的杂原子、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)。当上述基团被取代时，该取代基各自独立地优选为选自于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、取代或非取代的c1～c5烷基、取代或非取代的c2～c5烯基、取代或非取代的c2～c5炔基、取代或非取代的c3～c6环烷基、取代或非取代的c3～c6环烯基、取代或非取代的c3～c6环炔基、取代或非取代的氨基和取代或非取代的c1～c5烷氧基，更优选为选自于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、非取代的c1～c5烷基、非取代的c2～c5烯基、非取代的c2～c5炔基、非取代的c3～c6环烷基、非取代的c3～c6环烯基、非取代的c3～c6环炔基、非取代的氨基和非取代的c1～c5烷氧基。r2优选为化学键或取代或非取代的c1～c
10
亚烷基，更优选为化学键、亚甲基、乙烯、丙烯或丁烯，进一步优选为化学键或乙烯。
[0265]
r3、r3’
和r
3”彼此独立地优选为化学键、取代或非取代的二价烃基、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)，更优选为化学键、取代或非取代的c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c2～c
20
亚烯基、取代或非取代的c2～c
20
亚炔基、取代或非取代的c3～c
20
亚环烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚环烯基、取代或非取代的c4～c
20
亚环炔基、取代或非取代的3～6元亚杂环烷基、取代或非取代的c7～c
20
环烷基亚烷基、取代或非取代的3～6元杂环烷基-c1～c
20
亚烷基、取代或非取代的c4～c
20
亚芳基、取代或非取代的c5～c
20
芳基亚烷基、取代或非取代的5～15元亚杂芳基或者取代或非取代的5～15元杂芳基-c1～c
20
亚烷基、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)。上述二价烃基可以含有1个以上的杂原子、酰胺基(-co-nh-)、酯基(-co-o-)或尿烷基(-o-co-nh-)。当上述基团被取代时，该取代基各自独立地优选为选自于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、取代或非取代的c1～c5烷基、取代或非取代的c2～c5烯基、取代或非取代的c2～c5炔基、取代或非取代的c3～c6环烷基、取代或非取代的c3～c6环烯基、取代或非取代的c3～c6环炔基、取代或非取代的氨基和取代或非取代的c1～c5烷氧基，更优选为选自于以下组中的一价基团：卤素(氟、氯、溴或碘)、氰基、硝基、非取代的c1～c5烷基、非取代的c2～c5烯基、非取代的c2～c5炔基、非取代的c3～c6环烷基、非取代的c3～c6环烯基、非取代的c3～c6环炔基、非取代的氨基和非取代的c1～c5烷氧基。r3、r3’
和r
3”优选彼此独立地为化学键、取代或非取代的c1～c
10
亚烷基、含有酰胺基的取代或非取代的c1～c
10
亚烷基或酰胺基(-co-nh-)，更优选彼此独立地为化学键、亚甲基、乙烯、-co-nh-(ch2)
4-、-ch
2-o-co-nh-(ch2)
3-或-co-nh-。
[0266]
r2、r3、r3’
和r
3”为上述基团时，式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天
然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，式(i)表示的化合物可以实质性抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0267]
特别优选的修饰基团a为由下述式(v-1-1)、(vi-1-1)、(vii-1-1)、(vii-1-2)、(vii-2-1)或(viii-1-1)表示的修饰基团：
[0268]
[化6]
[0269][0270]
[式中，n具有与上述定义相同的含义，n’具有与n相关的定义相同的含义，*为与剩余部分的结合位置]。
[0271]
式(v-1-1)中，peg基优选合计具有5kda、10kda、20kda、30kda、40kda、60kda或
80kda的重均分子量。
[0272]
式(vi-1-1)中，peg基优选合计具有40kda的重均分子量。
[0273]
式(vii-1-1)中，peg基优选合计具有5kda、10kda、20kda、30kda、40kda、60kda或80kda的重均分子量。
[0274]
式(vii-1-2)中，peg基优选合计具有50kda的重均分子量。这种情况下，(ch2ch2o)n的环氧乙烷单元通常合计具有40kda的重均分子量，(ch2ch2o)
n’的环氧乙烷单元通常合计具有10kda的重均分子量。
[0275]
式(vii-2-1)中，peg基优选合计具有40kda的重均分子量。这种情况下，(ch2ch2o)n的环氧乙烷单元通常合计具有30kda的重均分子量，(ch2ch2o)
n’的环氧乙烷单元通常合计具有10kda的重均分子量。或者，peg基优选合计具有60kda的重均分子量。这种情况下，(ch2ch2o)n的环氧乙烷单元通常合计具有50kda的重均分子量，(ch2ch2o)
n’的环氧乙烷单元通常合计具有10kda的重均分子量。或者，peg基优选合计具有80kda的重均分子量。这种情况下，(ch2ch2o)n的环氧乙烷单元通常合计具有70kda的重均分子量，(ch2ch2o)
n’的环氧乙烷单元通常合计具有10kda的重均分子量。
[0276]
式(viii-1-1)中，peg基优选合计具有40kda的重均分子量。
[0277]
将上述基团用作修饰基团a，使得式(i)表示的化合物可以保持天然肾上腺髓质素的药理作用，并实质性抑制不良的副作用，在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0278]
式(i)中，肽部分b需要通过其n末端α氨基的氮原子与亚甲基的碳原子共价结合来与剩余部分连接。本发明中，当含有1个以上peg基的修饰基团a与肽部分b通过上述连接形式连接时，有时会记作“烷基胺连接型肾上腺髓质素衍生物”。烷基胺连接型肾上腺髓质素衍生物，与如非专利文献10记载的肾上腺髓质素衍生物这样的肾上腺髓质素的n末端α氨基的氮原子通过形成酰胺键来与剩余部分连接的肾上腺髓质素衍生物(也记作“酰胺连接型肾上腺髓质素衍生物”)相比，具有更高的肾上腺髓质素活性。此外，本发明由式(i)表示的烷基胺连接型肾上腺髓质素衍生物与酰胺连接型肾上腺髓质素衍生物相比，不良的副作用(例如血压过度降低、伴随反射性的交感神经活性增高的心动过速和/或肾素活性增高等)得到进一步抑制。因此，本发明由式(i)表示的化合物与已知的肾上腺髓质素衍生物相比，可以进一步抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0279]
特别优选的式(i)表示的化合物中，
[0280]
a为由式(v-1-1)、(vi-1-1)、(vii-1-1)、(vii-1-2)、(vii-2-1)或(viii-1-1)表示的含有peg基的修饰基团，
[0281]
b为选自于下述组中的肽：
[0282]
(a)由seq id no:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0283]
(b)由seq id no:3的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:3的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0284]
(c)由seq id no:5的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:5的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0285]
(d)由seq id no:7的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:7的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0286]
(e)由seq id no:9的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:9的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0287]
(f)由seq id no:11的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:11的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0288]
(i)在(a)～(f)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0289]
(j)在(a)～(f)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽，
[0290]
或者，为选自于下述组中的肽：
[0291]
(h’)在(a)～(d)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；或者，在(e)或(f)的肽中从n末端侧起缺失第1～13位、第1～8位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0292]
(i)在(h’)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0293]
(j)在(h’)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽，即由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分。具有上述特征的式(i)表示的化合物可以保持天然肾上腺髓质素的药理作用，并实质性抑制不良的副作用，在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0294]
本发明的另一实施方式涉及由式(x)表示的化合物或其盐，或者它们的水合物：
[0295]a’‑
co-b
ꢀꢀꢀ
(x)。
[0296]
在本说明书中，有时将式(x)表示的化合物记作“尿烷连接型肾上腺髓质素衍生物”。
[0297]
式(x)中，b需为由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分。肽部分b具有与由式(i)表示的化合物相关的上述定义相同的含义。
[0298]
a’需为含有1个以上peg基的修饰基团。此外，a’需要通过含有peg基的修饰基团的氧原子与羰基的碳原子共价结合来与剩余部分连接。修饰基团a’具有这种结构，使得式(x)表示的化合物可以具有修饰基团a’与肽部分b通过尿烷键连接的结构。
[0299]
a’优选为由下述式(xi)、(xi’)或(xii)表示的修饰基团：
[0300]r1-o-m
1-*
ꢀꢀꢀ
(xi)
[0301]
[化7]
[0302][0303]
式(xi)、(xi’)和(xii)中，*为与剩余部分的结合位置。
[0304]
式(xi)、(xi’)和(xii)中，a、r1、r1’
、r2、r3、r3’
、r
3”、m1、m3、m3’
和m
3”具有与由式(i)表示的化合物相关的上述定义相同的含义。
[0305]
特别优选的修饰基团a’为由下述式(xi-1-1)、(xii-1-1)或(xii-2-1)表示的修饰
基团：
[0306]
ch3o-(ch2ch2o)
n-*
ꢀꢀꢀ
(xi-1-1)
[0307]
[化8]
[0308][0309]
[式中，n具有与上述定义相同的含义，n’具有与n相关的定义相同的含义，*为与剩余部分的结合位置]。
[0310]
式(xi-1-1)中，peg基优选合计具有5kda、10kda、20kda、30kda、40kda、60kda或80kda的重均分子量。
[0311]
式(xii-1-1)中，peg基优选合计具有5kda、10kda、20kda、30kda、40kda、60kda或80kda的重均分子量。
[0312]
式(xii-2-1)中，peg基优选合计具有40kda的重均分子量。这种情况下，(ch2ch2o)n的环氧乙烷单元通常合计具有30kda的重均分子量，(ch2ch2o)
n’的环氧乙烷单元通常合计具有10kda的重均分子量。或者，peg基优选合计具有60kda的重均分子量。这种情况下，(ch2ch2o)n的环氧乙烷单元通常合计具有50kda的重均分子量，(ch2ch2o)
n’的环氧乙烷单元通常合计具有10kda的重均分子量。或者，peg基优选合计具有80kda的重均分子量。这种情况下，(ch2ch2o)n的环氧乙烷单元通常合计具有70kda的重均分子量，(ch2ch2o)
n’的环氧乙烷单元通常合计具有10kda的重均分子量。
[0313]
将上述基团用作修饰基团a’，使得式(x)表示的化合物可以保持天然肾上腺髓质素的药理作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0314]
式(x)中，肽部分b需要通过其n末端α氨基的氮原子与羰基的碳原子共价结合来与剩余部分连接。尿烷连接型肾上腺髓质素衍生物，与非专利文献10记载的酰胺连接型肾上腺髓质素衍生物相比，具有更高的肾上腺髓质素活性。因此，本发明由式(x)表示的化合物与已知的肾上腺髓质素衍生物相比，可以在体内持续地表现出更高的肾上腺髓质素活性。
[0315]
特别优选的式(x)表示的化合物中，
[0316]
a’为由式(xi-1-1)、(xii-1-1)或(xii-2-1)表示的含有peg基的修饰基团，
[0317]
b为选自于下述组中的肽：
[0318]
(a)由seq id no:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0319]
(b)由seq id no:3的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:3的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0320]
(c)由seq id no:5的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:5的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0321]
(d)由seq id no:7的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:7的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0322]
(e)由seq id no:9的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:9的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0323]
(f)由seq id no:11的氨基酸序列组成的肽，或者由seq id no:11的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；
[0324]
(i)在(a)～(f)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0325]
(j)在(a)～(f)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽，
[0326]
或者b为选自于下述组中的肽：
[0327]
(h’)在(a)～(d)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；或者，在(e)或(f)的肽中从n末端侧起缺失第1～13位、第1～8位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；
[0328]
(i)在(h’)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及
[0329]
(j)在(h’)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽，即由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分。因此，具有上述特征的式(x)表示的化合物与已知的肾上腺髓质素衍生物相比，可以在体内持续地表现出更高的肾上腺髓质素活性。
[0330]
本发明中，式(i)和(x)表示的化合物不仅包含该化合物本身，还包含其盐。当式(i)和(x)表示的化合物为盐的形式时，优选为药学上可接受的盐。作为本发明的化合物的盐的反离子，并没有限制，例如优选为如钠离子、钾离子、钙离子、镁离子，或者取代或者非取代的铵离子这样的阳离子；或者如氯离子、溴离子、碘离子、磷酸根离子、硝酸根离子、硫酸根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、高氯酸离子、甲酸根离子、乙酸根离子、三氟乙酸根离子、丙酸根离子、乳酸根离子、马来酸根离子、羟基马来酸根离子、甲基马来酸根离子、富马酸根离子、己二酸根离子、苯甲酸根离子、2-乙酰氧基苯甲酸根离子、对氨基苯甲酸根离子、烟酸根离子、肉桂酸根离子、抗坏血酸根离子、帕莫酸根离子、琥珀酸根离子、水杨酸根离子、双亚甲基水杨酸根离子、草酸根离子、酒石酸根离子、苹果酸根离子、柠檬酸根离子、葡萄糖酸根离子、天冬氨酸根离子、硬脂酸根离子、棕榈酸根离子、衣康酸根离子、乙醇酸根离子、谷氨酸根离子、苯磺酸根离子、环己基氨基磺酸根离子、甲磺酸根离子、乙磺酸根离子、羟乙磺酸根离子、苯磺酸根离子、对甲苯磺酸根离子或者萘磺酸根离子这样的阴离子。当式(i)和(x)表示的化合物为与上述反离子的盐的形式时，该化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。
[0331]
式(i)和(x)表示的化合物不仅包含上述化合物本身，还包含该化合物或其盐的溶
剂化物。当式(i)和(x)表示的化合物或其盐为溶剂化物的形式时，优选为药学上可接受的溶剂化物。作为可以与上述化合物或其盐形成溶剂化物的溶剂，并没有限制，例如优选为水；或者如甲醇、乙醇、2-丙醇(异丙醇)、二甲基亚砜(dmso)、乙酸、乙醇胺、乙腈或乙酸乙酯这样的有机溶剂。当式(i)和(x)表示的化合物或其盐为与上述溶剂的溶剂化物的形式时，该化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。
[0332]
式(i)和(x)表示的化合物不仅包含上述化合物或下述化合物本身，还包含其受保护形式。本说明书中，“受保护形式”是指在一个或更多个的官能团(例如赖氨酸残基的侧链氨基)中引入保护基的形式。此外，本说明书中，“保护基”是指为了防止不希望的反应进行而引入至特定的官能团的基团，在特定的反应条件下可被定量地除去，且在除此之外的反应条件下基本上稳定，即为反应惰性的基团。作为可以形成上述化合物的受保护形式的保护基，并没有限制，例如可列举：叔丁氧基羰基(boc)、2-溴苄氧基羰基(brz)、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)、对甲苯磺酰基(tos)、苄基(bzl)、4-甲基苄基(4-mebzl)、2-氯苄氧基羰基(clz)、环己基(chex)和苯甲酰甲基(pac)；作为氨基的其他保护基：苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧基羰基、2-(对联苯基)异丙氧基羰基、2-(3,5-二甲氧基苯基)异丙氧基羰基、对苯基偶氮苄氧基羰基、三苯基磷酰基乙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、叔戊氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、烯丙氧基羰基、2-甲基磺酰基乙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、环戊氧基羰基、环己氧基羰基、金刚烷氧基羰基、异莰氧基羰基、苯磺酰基、均三甲苯磺酰基、甲氧基三甲基苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、4-硝基苯磺酰基和4-硝基苯磺酰基；作为羧基的其他保护基：甲酯、乙酯、叔丁酯、对甲氧基苄酯和对硝基苄酯；作为arg的其他侧链保护基：2,2,4,6,7-五甲基-2,3-苯并二氢呋喃-5-磺酰基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基和2-甲氧基苯磺酰基；作为tyr的其他保护基：2,6-二氯苄基、叔丁基和环己基；作为cys的其他保护基：4-甲氧基苄基、叔丁基、三苯甲基、乙酰胺甲基和3-硝基-2-吡啶次磺酰基；作为his的其他保护基：苄氧基甲基、对甲氧基苄氧基甲基、叔丁氧基甲基、三苯甲基和2,4-二硝基苯基；以及作为ser和thr的其他保护基：叔丁基等。当式(i)和(x)表示的化合物为上述保护基的受保护形式时，该化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。
[0333]
此外，式(i)和(x)表示的化合物还包含该化合物的各对映体和非对映体、以及外消旋体这样的该化合物的立体异构体的混合物。
[0334]
具有上述特征，使得式(i)和(x)表示的化合物可以保持天然肾上腺髓质素的药理作用，并实质性抑制不良的副作用，在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。
[0335]
《2.肾上腺髓质素衍生物的药物用途》
[0336]
本发明由式(i)和(x)表示的化合物在体内可以持续地表现出与作为母体分子的肾上腺髓质素实质上基本相同的生物活性(即肾上腺髓质素活性)。因此，本发明涉及一种含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物作为有效成分的药物。
[0337]
当将本发明由式(i)和(x)表示的化合物应用于药物用途时，可以单独使用该化合物，也可以与一种或更多种药学上可接受的成分组合使用。本发明的药物根据所希望的给药方法，可以配制成在本技术领域中常用的各种剂型。因此，本发明的药物还可以提供为含
有本发明由式(i)和(x)表示的化合物和一种或更多种药学上可接受的载体的药物组合物的形式。本发明的药物组合物除了上述成分之外，还可以包含药学上可接受的一种或更多种载体、赋形剂、粘合剂、媒介物、增溶剂、防腐剂、稳定剂、膨化剂、润滑剂、表面活性剂、油性液体、缓冲剂、安抚剂、抗氧化剂、甜味剂和调味剂等。
[0338]
含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物作为有效成分的药物的剂型，并没有特别限制，可以是用于肠胃外给药的制剂，也可以是用于口服给药的制剂。此外，本发明的药物的剂型可以是单位剂量形式的制剂，也可以是多次给药形式的制剂。作为用于肠胃外给药的制剂，例如可列举：水或除水之外的药学上可接受的液体的无菌溶液或混悬液等注射剂。作为可以与注射剂混合的添加剂，并没有限制，例如可列举：如生理盐水、含有葡萄糖或其他辅助剂(例如，d-山梨醇、d-甘露醇或氯化钠)的等渗液这样的媒介物；如醇(例如乙醇或者苄醇)、酯(例如苯甲酸苄酯)、多元醇(例如丙二醇或者聚乙二醇)这样的增溶剂；如聚山梨酯80或聚氧乙烯氢化蓖麻油这样的非离子表面活性剂；如芝麻油或大豆油这样的油性液体；如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液这样的缓冲剂；如苯扎氯铵或盐酸普鲁卡因这样的安抚剂(無痛化剤)；如人血清白蛋白或聚乙二醇这样的稳定剂；以及防腐剂及抗氧化剂等。配制的注射剂通常填充到适当的小瓶(例如安瓿瓶)中，保存在适合的环境下直至使用。
[0339]
作为用于口服给药的制剂，例如可列举：根据需要施以糖衣、水溶性包衣的片剂、胶囊剂、酏剂、微囊剂、片剂、糖浆、混悬液等。作为可以与片剂或胶囊剂等混合的添加剂，并没有限制，例如可列举：如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶这样的粘合剂；如微晶纤维素这样的赋形剂；如玉米淀粉、明胶和海藻酸这样的膨化剂；如硬脂酸镁这样的润滑剂；如蔗糖、乳糖或糖精这样的甜味剂；如薄荷、白珠油(akamono oil)或樱桃这样的调味剂等。当制剂为胶囊剂时，可以进一步含有油脂这样的液状载体。
[0340]
本发明由式(i)和(x)表示的化合物可以在体内持续地表现出与作为母体分子的肾上腺髓质素实质上基本相同的肾上腺髓质素活性。因此，含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物作为有效成分的药物可以配制为长效制剂。这种情况下，可以将呈长效制剂剂型的本发明的药物，例如通过埋入皮下或者肌肉内或肌肉注射来给药。通过将本发明的药物应用于长效制剂，可以长时间持续地表现出本发明由式(i)和(x)表示的化合物的肾上腺髓质素活性。
[0341]
含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物作为有效成分的药物，可以与作为药物有用的一种或更多种其他药剂同时使用。这种情况下，本发明的药物可以提供为包含本发明由式(i)和(x)表示的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物与一种或更多种其他药剂的单一药物的形式，也可以提供为包含本发明由式(i)和(x)表示的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物与一种或更多种其他药剂分别制剂化的多个制剂的药物组合或试剂盒的形式。在药物组合或试剂盒的形式的情况下，可以将各自的制剂同时或分别(例如连续地)给药。
[0342]
当将本发明由式(i)和(x)表示的化合物应用于药物用途时，式(i)和(x)表示的化合物不仅包含该化合物本身，还包含该化合物的药学上可接受的盐及它们的药学上可接受的溶剂化物。作为本发明由式(i)和(x)表示的化合物的药学上可接受的盐及它们的药学上可接受的溶剂化物，并没有限制，例如优选为如上述举例的盐或溶剂化物。当式(i)和(x)表示的化合物为上述盐或溶剂化物的形式时，该化合物可以应用于所希望的药物用途。
[0343]
含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物作为有效成分的药物，可以对由肾上腺髓质素进行预防或治疗的各种状况、疾病和/或紊乱进行同样的预防或治疗。作为上述状况、疾病和/或紊乱，并没有限制，例如可举出如下内容。
[0344]
(1)循环系统疾病：心功能不全、肺动脉高压症、闭塞性动脉硬化症、血栓闭塞性脉管炎、心肌梗塞、淋巴肿大、川崎病、心肌炎、高血压、高血压所致的器官紊乱和动脉硬化症。
[0345]
(2)肾脏与水电解质系统疾病：肾衰竭和肾炎。
[0346]
(3)脑与神经系统疾病：脑梗塞、痴呆症和脑炎。
[0347]
(4)泌尿生殖系统疾病：勃起功能障碍(ed)。
[0348]
(5)消化系统疾病：炎症性肠病、溃疡性疾病、肠白塞病和肝功能不全。
[0349]
(6)骨科疾病：关节炎。
[0350]
(7)内分泌代谢疾病：糖尿病和糖尿病所致的器官紊乱和原发性醛固酮增多症。
[0351]
(8)其他：败血症性休克、自身免疫性疾病、多器官衰竭、褥疮、创伤愈合和脱发症。
[0352]
上述循环系统疾病优选为心肌梗塞、肺动脉高压症或心功能不全等疾病。上述消化系统疾病优选为类固醇抵抗型或类固醇依赖型的炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病或肠白塞病)这样的炎症性疾病。
[0353]
本发明由式(i)和(x)表示的化合物具有连接有作为天然生物活性肽的肾上腺髓质素与修饰基团的结构。因此，本发明由式(i)和(x)表示的化合物安全且毒性低。因此，含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物作为有效成分的药物，可以适用于需要预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的各种给药对象。上述给药对象优选为人或非人哺乳动物(例如，猪、犬、牛、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、猫、猴、狒狒或黑猩猩等温血动物)的受试对象或患者。通过对上述给药对象给予本发明的药物，可以对由肾上腺髓质素进行预防或治疗的各种状况、疾病和/或紊乱进行预防或治疗。
[0354]
本说明书中，“预防”是指实质上防止状况、疾病和/或紊乱的发生(发病或表现)。此外，本说明书中，“治疗”是指抑制(例如抑制发展)、明显缓解、修复和/或治愈发生(发病或发现)的状况、疾病和/或紊乱。
[0355]
本发明由式(i)和(x)表示的化合物可以在具有上述状况、疾病和/或紊乱(例如，循环系统疾病、周围血管疾病或炎症性疾病)的给药对象中，用于预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。因此，本发明的药物优选为用于预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的药物，更优选为用于预防或治疗循环系统疾病、炎症性疾病或周围血管疾病的药物。此外，本发明涉及一种含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物作为有效成分的循环系统疾病、炎症性疾病或周围血管疾病的预防或治疗剂。通过将本发明由式(i)和(x)表示的化合物用于预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱，可以持续地预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。
[0356]
本发明由式(i)和(x)表示的化合物可以在具有上述状况、疾病和/或紊乱(例如，循环系统疾病、周围血管疾病或炎症性疾病)的给药对象中，用于预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。因此，本发明的一个实施方式是预防或治疗上述疾病或者状况的方法，上述方法包括对需要预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的给药对象，给予有效量的本发明由式(i)和(x)表示的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物。上述状况、疾病和/或紊乱优选为循环系统疾病、周围血管疾病或炎症性疾病。通过对需要预防
或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的给药对象给予本发明由式(i)和(x)表示的化合物，可以预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。
[0357]
本发明的另一个实施方式是用于预防或治疗上述说明的状况、疾病和/或紊乱的本发明由式(i)和(x)表示的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物。本发明的其他实施方式是本发明由式(i)和(x)表示的化合物或其药学上可接受的盐或者它们的药学上可接受的水合物用于制备用于预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的药物的用途。上述状况、疾病和/或紊乱优选为循环系统疾病、炎症性疾病或周围血管疾病。通过将本发明的药物用于预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱，可以持续地预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。
[0358]
当将含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物作为有效成分的药物向给药对象、特别是对人患者给药时，精确的给药量和给药次数要考虑到给药对象的年龄、性别、需要预防或治疗的状况、疾病和/或紊乱的精确状态(例如重症度)、以及给药途径等多种因素，主治医生应最终确定治疗上有效的给药量和给药次数。因此，本发明的药物中，作为有效成分的式(i)和(x)表示的化合物可以以有效治疗量和次数向给药对象给药。例如，当本发明的药物对人患者给药时，作为有效成分的式(i)和(x)表示的化合物的给药量通常为在每60kg体重每天0.01～100mg的范围，典型地为每60kg体重每天0.01～10mg的范围。
[0359]
含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物作为有效成分的药物的给药途径和给药次数并没有特别限制，可以口服单次或多次给药，也可以肠胃外单次或多次给药。本发明的药物优选为经静脉给药、灌肠给药、皮下给药、肌肉内给药或腹腔内给药这样的肠胃外途径给药，更优选为静脉给药或皮下给药。此外，本发明的药物优选为单次给药。本发明的药物特别优选为用于经静脉或皮下单次给药。作为本发明由式(i)和(x)表示的化合物的母体分子的肾上腺髓质素具有很强的扩张血管作用。因此，当将有效治疗量的肾上腺髓质素进行单次给药时，由于很强的扩张血管作用，可能引起血压下降过度、伴随反射性的交感神经活性增高的心动过速和/或肾素活性增高这样的不良副作用。与此相对，本发明由式(i)和(x)表示的化合物可在保持与天然肾上腺髓质素实质上基本相同的肾上腺髓质素活性的同时，与天然肾上腺髓质素相比，可显著延长血液中的半衰期。因此，通过将含有本发明由式(i)和(x)表示的化合物作为有效成分的药物经给药对象的静脉单次给药，可以在抑制由肾上腺髓质素的扩张血管作用引起的不良副作用的同时，可以持续地预防或治疗给药对象的状况、疾病和/或紊乱。
[0360]
《3.肾上腺髓质素衍生物的制造方法》
[0361]
本发明还涉及一种本发明由式(i)和(x)表示的化合物的制造方法。
[0362]
[3-1.前体准备步骤]
[0363]
本发明的方法可以包括准备由肾上腺髓质素或其修饰物衍生的肽部分b的前体、含有1个以上聚乙二醇基的修饰基团a或a’的前体中至少任一个的步骤。
[0364]
本发明中，“由肾上腺髓质素或其修饰物衍生的肽部分b的前体”是指肾上腺髓质素或其修饰物，或者在下面说明的连接步骤中，肽部分b和修饰基团a或a’以通过缩合反应而相互连接的形式，经适当改变或活化的它们的衍生物。肽部分b的前体优选为肾上腺髓质素或其修饰物本身，或者它们的受保护形式。
[0365]
修饰基团a的前体通常为由式(i-1)表示的含有1个以上聚乙二醇基的修饰基团a
的前体醛：
[0366]
a-cho
ꢀꢀꢀ
(i-1)。
[0367]
本步骤中，通过准备具有上述特征的前体，可以实施下面说明的连接步骤中的各前体的连接反应，并以高收率获得式(i)表示的化合物。
[0368]
修饰基团a’的前体通常为由式(x-1)表示的含有1个以上聚乙二醇基的修饰基团a’的前体对硝基苯基碳酸酯：
[0369]a’‑
co-o-c6h
4-p-no2ꢀꢀꢀ
(x-1)。
[0370]
或者，修饰基团a’的前体也可以为由式(x-2)表示的含有1个以上聚乙二醇基的修饰基团a’的前体n-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯：
[0371]a’‑
co-o-c4h4no2ꢀꢀꢀ
(x-2)。
[0372]
本步骤中，通过准备具有上述特征的前体，可以实施下面说明的连接步骤中的各前体的连接反应，并以高收率获得式(x)表示的化合物。
[0373]
本步骤中，由肾上腺髓质素或其修饰物衍生的肽部分b的前体，可以通过本技术领域中常用的方法来形成。当肽部分b的前体为肾上腺髓质素或其修饰物本身时，例如，可以使用固相体系或液相体系的肽合成法，也可以使用由可产生肾上腺髓质素的人或非人哺乳动物的组织或细胞中提取天然肽的方法。或者也可以使用将可产生肾上腺髓质素的人或非人哺乳动物中的肾上腺髓质素进行编码的dna(例如，seq id no:2、4、6、8、10或12)，在大肠杆菌或芽殖酵母等的转化体系中大量表达重组蛋白的方法。或者还可以使用购买预先已制备的肽等。在任一种情况下均包含于本步骤的实施方式。
[0374]
在由上述方法形成的肽部分b的前体中，通过将该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基的硫醇基二硫键化，可以得到该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成有二硫键的前体。此外，在由上述方法形成的肽部分b的前体中，通过将在该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键用亚乙基取代，可以得到该二硫键被亚乙基取代的前体。上述二硫键化反应和亚乙基的取代反应可以根据本技术领域中常用的条件来实施。上述二硫键化反应和亚乙基的取代反应可以在本步骤中实施，也可以在下面说明的连接步骤中实施。在任一种情况下均包含于本发明的方法的实施方式中。
[0375]
当肽部分b的前体和修饰基团a或a’的前体中的至少一种为它们的受保护形式时，在本步骤中，根据预期可以实施在肽部分b的前体和修饰基团a或a’中的至少一种中引入一种或更多种保护基的保护步骤和/或实施对肽部分b的前体和修饰基团a或a’的前体的受保护形式中的至少任一种的一种或更多种保护基去保护的去保护步骤。上述保护步骤和去保护步骤可以通过本技术领域中常用的保护化反应和去保护化反应来实施。上述保护步骤和去保护步骤可以在本步骤中实施，也可在下面说明的连接步骤中实施。在任一种情况下均包含于本发明的方法的实施方式中。
[0376]
[3-2.连接步骤]
[0377]
本发明的方法需包括使由肾上腺髓质素或其修饰物衍生的肽部分b的前体、修饰基团a或a’的前体进行连接，得到式(i)或(x)表示的化合物的连接步骤。
[0378]
式(i)中，本步骤通常以使肽部分b的前体和式(i)表示的含有1个以上peg基的修饰基团a的前体醛在还原剂存在下反应来实施。本步骤中使用的还原剂没有限制，例如可列举：氰基硼氢化钠(nacnbh3)、硼氢化钠(nabh4)、硼酸二甲基胺、硼酸三甲基胺、硼酸吡啶、吡
啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷和3-甲基吡啶硼烷。本步骤中的反应温度优选为-20～50℃的范围，更优选为0～15℃的范围。此外，本步骤中的反应时间优选为5分钟～100小时的范围。
[0379]
式(x)中，本步骤通常以使肽部分b的前体和由式(x-1)或式(x-2)表示的含有1个以上peg基的修饰基团a’的前体对硝基苯基碳酸酯或n-羟基琥珀酰亚胺碳酸酯在碱基存在下反应来实施。作为本步骤中所使用的碱基没有限制，例如可列举：三乙胺、吡啶和二甲氨基吡啶。本步骤中的反应温度优选为0～50℃的范围。此外，本步骤中的反应时间优选为5分钟～200小时的范围。
[0380]
实施例
[0381]
下面利用实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明的技术范围并不限于这些实施例。
[0382]
《实验i：全长肾上腺髓质素衍生物的制备》
[0383]
〔实验i-1：全长肾上腺髓质素衍生物的合成〕
[0384]
[实验i-1-1：ch3o-peg(5k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(1))的合成]
[0385]
根据已知文献(kubo,k等,“biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol.”,peptides,2014年,第57卷,118-121页)记载的方法，使用n-羟基琥珀酰亚胺活性酯型的5kda的ch3o-peg化试剂(peg-1)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
5-co-o-nhs)，使与人肾上腺髓质素的第1～52位氨基酸残基(seq id no:1)所对应的肽、即具有h-tyr-arg-gln-ser-met-asn-asn-phe-gln-gly-leu-arg-ser-phe-gly-cys-arg-phe-gly-thr-cys-thr-val-gln-lys-leu-ala-his-gln-ile-tyr-gln-phe-thr-asp-lys-asp-lys-asp-asn-val-ala-pro-arg-ser-lys-ile-ser-pro-gln-gly-tyr-nh2氨基酸序列的肽的cys
16-cys
21
二硫键交联物(以下也记作“h.am(1-52)”)的n末端氨基与重均分子量5kda的聚乙二醇基(以下也记作“peg(5k)”)经由酰胺键连接，从而合成酰胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(5k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(1-52)))(1)。
[0386]
[实验i-1-2：ch3o-peg(20k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(2))的合成]
[0387]
根据与实验i-1-1相同的方法，使用n-羟基琥珀酰亚胺活性酯型的20kda的ch3o-peg化试剂(peg-1)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
5-co-o-nhs)，使h.am(1-52)肽的n末端氨基与重均分子量20kda的聚乙二醇基(以下也记作“peg(20k)”)经由酰胺键连接，从而合成酰胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(20k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(1-52)))(2)。
[0388]
[实验i-1-3：ch3o-peg(10k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(3))的合成]
[0389]
将2mg的h.am(1-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到2ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加16mg醛型的重均分子量10kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收烷基胺连接型peg(10k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(10k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(3)和未反应的h.am(1-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到superdex 200hr 10/30(ge healthcare公司)柱的高效液
相色谱(hplc)系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到1.0mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(3)。
[0390]
[实验i-1-4：ch3o-peg(20k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(4))的合成]
[0391]
将1mg的h.am(1-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到1ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加32mg醛型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收烷基胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(20k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(4)和未反应的h.am(1-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到superdex 200hr 10/30(ge healthcare公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.3mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(4)。
[0392]
[实验i-1-5：ch3o-peg(30k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(5))的合成]
[0393]
将2mg的h.am(1-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到2ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加30mg醛型的重均分子量30kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收烷基胺连接型peg(30k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(30k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(5)和未反应的h.am(1-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到superdex 200hr 10/30(ge healthcare公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：100mm ph6的乙酸钠缓冲液 200mm na2so4，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.8mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(5)。
[0394]
[实验i-1-6：gl-二支链型ch3o-peg(20k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(6))的合成]
[0395]
作为实验i-1-5中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用45mg由式(vii-1-1’)表示的醛型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-3)：
[0396]
[化9]
[0397][0398]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型烷基胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(20k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(6)：
[0399]
[化10]
[0400]
通过制备型hplc得到1.0mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(6)。
[0401]
[实验i-1-7：gl-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(7))的合成]
[0402]
作为实验i-1-5中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用80mg由式(vii-1-1’)表示的醛型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-3)：
[0403]
[化11]
[0404][0405]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型烷基胺连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(7)：
[0406]
[化12]
[0407][0408]
通过制备型hplc得到1.2mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(7)。
[0409]
[实验i-1-8：gl-二支链型ch3o-peg(60k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(8))的制备]
[0410]
作为实验i-1-4中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用40mg由式(vii-1-1’)表示的醛型的重均分子量60kda的ch3o-peg化试剂(peg-3)：
[0411]
[化13]
[0412][0413]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型烷基胺连接型peg(60k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(60k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(8)：
[0414]
[化14]
[0415][0416]
通过制备型hplc得到0.4mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(8)。
[0417]
[实验i-1-9：gl-二支链型ch3o-peg(80k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(9))的合成]
[0418]
作为实验i-1-5中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用121mg(vii-1-1’)表示的醛型的重均分子量80kda的ch3o-peg化试剂(peg-3)：
[0419]
[化15]
[0420][0421]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型烷基胺连接型peg(80k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(60k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(9)：
[0422]
[化16]
[0423][0424]
通过制备型hplc得到1.1mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(9)。
[0425]
[实验i-1-10：lys-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(10))的合成]
[0426]
作为实验i-1-4中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用42.9mg由式(vi-1-1’)表示的醛型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-4)：
[0427]
[化17]
[0428][0429]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有赖氨酸骨架的二支链型烷基胺连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(lys-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(10)：
[0430]
[化18]
[0431][0432]
通过制备型hplc得到0.4mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(10)。
[0433]
[实验i-1-11：gl-四支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(11))的合成]
[0434]
作为实验i-1-3中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用93mg由式(vii-2-1’)表示的醛型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-5)：
[0435]
[化19]
[0436][0437]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的四支链型烷基胺连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-四支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(11)：
[0438]
[化20]
[0439][0440]
通过制备型hplc得到1.1mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(11)。
[0441]
[实验i-1-12：xyl-四支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(12))的合成]
[0442]
作为实验i-1-3中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用94mg由式(viii-1-1’)表示的醛型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-6)：
[0443]
[化21]
[0444][0445]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有木糖骨架的四支链型烷基胺连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(xyl-四支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(12)：
[0446]
[化22]
[0447][0448]
通过制备型hplc得到1.0mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(12)。
[0449]
[实验i-1-13：gl-三支链型ch3o-peg(50k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(13))的合成]
[0450]
作为实验i-1-3中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用94mg由式(vii-1-2’)表示的醛型的重均分子量50kda的ch3o-peg化试剂(peg-7)：
[0451]
[化23]
[0452][0453]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的三支链型烷基胺连接型peg(50k)肾上腺髓质素衍生物(gl-三支链型ch3o-peg(50k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(13)：
[0454]
[化24]
[0455][0456]
通过制备型hplc得到0.9mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(13)。
[0457]
[实验i-1-14：ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(14))的合成]
[0458]
使用fmoc肽合成法，委托合成具有fmoc-tyr-arg-gln-ser-met-asn-asn-phe-gln-gly-leu-arg-ser-phe-gly-cys-arg-phe-gly-thr-cys-thr-val-gln-lys-leu-ala-his-gln-ile-tyr-gln-phe-thr-asp-lys-asp-lys-asp-asn-val-ala-pro-arg-ser-lys-ile-ser-pro-gln-gly-tyr-nh2氨基酸序列的肽的cys
16-cys
21
二硫键交联物(以下也记作“fmoc-α
nh-(h.am(1-52))”)。将18mg的fmoc-α
nh-(h.am(1-52))肽溶解在1.8ml二甲基亚砜(dmso)中。向该溶液中加入9mg碳酸叔丁基琥珀酰亚胺和6μl二异丙基乙胺。将反应溶液搅拌5小时。向得到的反应溶液中加入乙酸水溶液。之后，冷冻干燥该溶液。将残余物溶解在2ml的dmso中。向得到的溶液中加入0.2ml二乙胺。将得到的溶液搅拌70分钟。向反应溶液中加入乙酸水溶液进行稀释。使用反相hplc将得到的溶液分离，得到含有h.am(1-52)肽的级分。将该级分冷冻干燥，得到10mg的h.am(1-52)的4个赖氨酸受boc基团保护的肽，为白色粉末。
[0459]
将2mg的上述得到的肽溶解在2ml的dmso中。在冰冷却下，向该肽溶液中添加15mg的对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-8)(ch3o-(ch2ch2o)
n-co-o-c6h
4-p-no2)。进一步，向该肽溶液中添加6.5μl的0.1m三乙胺/dmso溶液。将反应液在冰冷却下放置1小时。之后，将反应液恢复至室温并放置24小时。进一步将反应液的温度提升至30℃，反应持续2天。冷冻干燥反应液。在冰冷却下，向得到的残余物中添加1ml三氟乙酸。将混合物的温度恢复至室温并放置2小时。接着，使用蒸发器，从混合物中减压蒸馏除去三氟乙酸。向得到的残余物中添加4ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液，使其溶解。使该溶液以1ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(1ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收尿烷连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(1-52)))(14)和未反应的h.am(1-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到tsk gel g2000swxl(60cm，东曹公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到250μg(换算为h.am(1-52))
的目标化合物(14)。
[0460]
[实验i-1-15：ch3o-peg(5k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(35))的合成]
[0461]
作为实验i-1-3中醛型的重均分子量10kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用5mg醛型的重均分子量5kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)，除此以外，按照与上述相同的步骤，得到烷基胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(5k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(35)。通过制备型hplc得到0.8mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(35)。
[0462]
[实验i-1-16：ch3o-peg(40k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(25))的合成]
[0463]
作为实验i-1-3中醛型的重均分子量10kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用40mg醛型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)，除此以外，按照与上述相同的步骤，得到烷基胺连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(40k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)))(25)。通过制备型hplc得到0.6mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(25)。
[0464]
[实验i-1-17：gl-二支链型ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(26))的合成]
[0465]
作为实验i-1-14中对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-8)(ch3o-(ch2ch2o)
n-co-o-c6h
4-p-no2)的替代品，使用25mg由式(xii-1-1’)表示的对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-9)：
[0466]
[化25]
[0467][0468]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型尿烷连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(1-52))(26)：
[0469]
[化26]
[0470]
通过制备型hplc得到0.2mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(26)。
[0471]
[实验i-1-18：gl-二支链型ch3o-peg(40k)-co-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(27))的合成]
[0472]
作为实验i-1-14中对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-8)
(ch3o-(ch2ch2o)
n-co-o-c6h
4-p-no2)的替代品，使用35mg由式(xii-1-1’)表示的对硝基苯酯型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-9)：
[0473]
[化27]
[0474][0475]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型尿烷连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(40k)-co-α
nh-(h.am(1-52))(27)：
[0476]
[化28]
[0477][0478]
通过制备型hplc得到0.2mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(27)。
[0479]
[实验i-1-19：gl-四支链型ch3o-peg(40k)-co-α
nh-(h.am(1-52))(化合物(28))的合成]
[0480]
作为实验i-1-14中对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-8)(ch3o-(ch2ch2o)
n-co-o-c6h
4-p-no2)的替代品，使用40mg由式(xii-2-1’)表示的对硝基苯酯型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-10)：
[0481]
[化29]
[0482][0483]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的四支链型尿烷连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-四支链型ch3o-peg(40k)-co-α
nh-(h.am(1-52))(28)：
[0484]
[化30]
[0485][0486]
通过制备型hplc得到0.2mg(换算为h.am(1-52))的目标化合物(28)。
[0487]
〔实验i-2：全长肾上腺髓质素衍生物的结构分析〕
[0488]
[实验i-2-1：利用断裂肽质谱分析的peg基结合位置的确定(1)]
[0489]
将10μg化合物(3)与70％甲酸和600μg溴化氰(brcn)混合至总共500μl。使混合物在室温下反应过夜。将氯仿、甲醇和含有0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液各1ml依次流过sep pak(沃特世公司)柱，洗涤柱子。之后，流过1ml超纯水以平衡sep pak柱。在溴化氰反应过夜后，向反应液(500μl)中加入4500μl超纯水，得到5ml稀释反应液。使稀释的反应液流过柱子以吸附断裂肽。接着，将超纯水和含有0.1％三氟乙酸的10％乙腈水溶液各1ml依次流过柱子，洗涤柱子以除去未吸附物质。最后，将1ml含有0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液流过柱子，从柱中洗脱断裂肽。
[0490]
从上述处理中得到的sep pak柱的断裂肽洗脱级分中，减压蒸馏出乙腈。通过使用了反相柱(ods-120a tskgel，东曹公司)的反相hplc(rp-hplc)，将得到的残留物纯化并分离。rp-hplc中的洗脱是按照在60分钟内从100％的a液(含有0.1％三氟乙酸的10％乙腈水溶液)变化至100％的b液(含有0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液)的线性梯度程序来进行的。使用质谱分析装置(axima-confidence，岛津制作所)，测量分离的断裂肽的ms谱图。结果证实，断裂肽的分子量与人肾上腺髓质素的第6～52位氨基酸残基所对应的肽的分子量一致((m na)

，计算值：m/z 5385.935；测量值：m/z 5385.9986)。存在于人肾上腺髓质素中的全部赖氨酸残基(从n末端起第25、36、38和46位残基)存在于第6～52位氨基酸残基的范围内。因此，从上述结果可以证实：烷基胺连接型peg(10k)肾上腺髓质素衍生物(3)中的peg基与n末端的α氨基结合。
[0491]
[实验i-2-2：利用断裂肽质谱分析的peg基结合位置的确定(2)]
[0492]
将10～40μg化合物(2)溶解在含有2.5mm乙二胺四乙酸、30％n,n-二甲基甲酰胺和250mm的tris-hcl(ph8.5)的500μl溶液中，利用涡旋混合器和超声波处理进行搅拌和混合。向混合物中加入2.5mg的1,4-二硫苏糖醇，确认混合物的ph值为8.0以上。向混合物中注入氮气并超声波处理5分钟。使该混合物在37℃下反应2小时。反应后，在避光下向反应混合物中加入6.25mg的一碘乙酸，在25℃下进一步反应30分钟。之后，向反应混合物中加入乙酸以使最终浓度变成1n，停止反应。氯仿、甲醇和含有0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液各1ml依次流过sep pak(沃特世公司)柱，洗涤柱子。之后，流过1ml的1n乙酸以平衡sep pak柱。使还原烷基化后的反应液流过柱子以吸附反应肽。接着，将1n乙酸和含有0.1％三氟乙酸的10％乙腈水溶液各1ml依次流过柱子，洗涤柱子以除去未吸附物质。最后，将1ml含有0.1％三氟
乙酸的60％乙腈水溶液流过柱子，从柱中洗脱还原烷基化肽。
[0493]
从上述处理中得到的sep pak柱的还原烷基化肽洗脱级分中，减压蒸馏出乙腈。将得到的还原烷基化肽与赖氨酸肽链内切酶按照肽:赖氨酸肽链内切酶的质量比为20:1的比例混合。向混合物中加入1m的tris-hcl(ph8.5)，制备成200μl的体积和50mm的tris-hcl的最终浓度。将该混合物在37℃下放置过夜(16小时以上)。通过使用了反相柱(ods-120a tskgel，东曹公司)的rp-hplc，将得到的断裂肽纯化并分离。rp-hplc中的洗脱是按照以下步骤来进行：使100％的a液(0.1％三氟乙酸)流过5分钟，之后在60分钟内在100％的a液变化至50％的b液(含有0.1％三氟乙酸的60％乙腈水溶液)的线性梯度条件下流过，进一步100％的b液流过15分钟。作为对照，使用化学合成的标准品h.am(1-52)肽来代替化合物(2)，按照与上述相同的步骤进行反应和利用rp-hplc分离。断裂肽的rp-hplc色谱图如图1所示。图1中，a图表示来自h.am(1-52)肽的断裂肽的rp-hplc色谱图，b图表示来自化合物(2)的断裂肽的rp-hplc色谱图。如图1的a图所示，在来自h.am(1-52)肽的断裂肽的rp-hplc色谱图中，检测到了4个主要峰，即保留时间为28.08分钟(以下也记作“峰(1)”)、36.97分钟(以下也记作“峰(2)”)、54.53分钟(以下也记作“峰(3)”)和67.52分钟(以下也记作“峰(4)”)。另一方面，如图1的b图所示，在来自化合物(2)肽的断裂肽的rp-hplc色谱图中，检测到4个主要峰，即保留时间为28.69分钟(以下也记作“峰(5)”)、36.98分钟(以下也记作“峰(6)”)、54.57分钟(以下也记作“峰(7)”)和72.30分钟(以下也记作“峰(8)”)。从保留时间的对比来看，峰(1)和(5)、峰(2)和(6)以及峰(3)和(7)分别对应相同的肽片段。峰(4)和(8)的保留时间不同。推测峰(8)的化合物为峰(4)的肽片段结合有peg基的化合物。
[0494]
使用化合物(7)、(8)和(26)，按照与上述相同的步骤进行反应和利用rp-hplc分离。结果与使用化合物(2)的情况相同，检测到具有与峰(1)、(2)和(3)相对应的保留时间的峰。此外，如峰(8)那样，还检测到与推测为峰(4)的肽片段结合有peg基的化合物相对应的峰。
[0495]
使用质谱分析装置(qstar elit，sciex公司)，测量分离的断裂肽的ms谱图。人肾上腺髓质素具有4个赖氨酸残基(从n末端侧起第25、36、38和46位残基)。因此，通过赖氨酸肽链内切酶得到的断裂肽是由5个肽片段组成、即具体为从n末端侧起yrqsmnnfqglrsfgcrfgtctvqk(h.am(1-25))、lahqiyqftak(h.am(26-36))、dk(h.am(37-38))、dnvaprsk(h.am(39-46))和ispqgy(h.am(47-52))的肽片段。从得到的ms谱图可以证实：峰(1)和(5)对应h.am(39-46)的肽片段，峰(2)和(6)对应h.am(47-52)的肽片段，峰(3)和(7)对应h.am(26-36)的肽片段，峰(4)对应h.am(1-25)的肽片段。此外，使用质谱分析装置(autoflex ii，布鲁克
·
道尔顿公司)测量峰(8)的肽片段的ms谱图，结果证实峰(8)的化合物为h.am(1-52)肽的n末端侧的肽片段结合有peg基的化合物。因此，从上述结果可以证实：化合物(7)、(8)和(26)中的peg基都与n末端的α氨基结合。
[0496]
[实验i-2-3：利用氨基酸序列分析的peg基结合位置的确定]
[0497]
使用蛋白测序仪(procise 494ht蛋白测序系统，美国应用生物系统公司)，将化合物(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)用于氨基酸序列分析。结果，所有化合物均未检测到相当于人肾上腺髓质素的n末端氨基酸残基的氨基酸。从上述结果可以证实：化合物(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)和(13)中的peg基都与n末端的α氨基结合。
[0498]
[实验i-2-4：利用离子交换hplc的peg基结合位置的确定]
[0499]
通过使用了离子交换柱(cm-2sw，东曹公司)的离子交换hplc，将h.am(1-52)肽和与人肾上腺髓质素的第6～52位氨基酸残基所对应的肽分离。离子交换hplc中的洗脱是按照在0～40分钟内从80％的a液(100mm ph5.0的乙酸钠)和20％的b液(含有1m硫酸钠的100mm ph7.0的乙酸钠)变化至20％的a液和80％的b液的线性梯度程序来进行的。
[0500]
从实验i-2-1中得到的化合物(3)的断裂肽的sep pak柱洗脱级分中减压蒸馏出乙腈，在上述条件下利用离子交换hplc对得到的残留物进行分析。结果，对于化合物(3)，证实与人肾上腺髓质素的第6～52位氨基酸残基所对应的肽具有相同洗脱时间的峰。从与实验i-2-1相同的步骤得到的化合物(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(25)、(27)、(28)和(35)的断裂肽的sep pak柱洗脱级分中减压蒸馏出乙腈，在上述条件下利用离子交换hplc对得到的残留物进行分析，结果证实与化合物(3)的峰一致。因此，从上述结果可以证实：化合物(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(25)、(27)、(28)和(35)中的peg基都与n末端的α氨基结合。
[0501]
[实验i-2-5：利用sds-page的分子量分析]
[0502]
根据实验书(实验医学增刊“蛋白质实验手册”羊土社，竹绳忠臣、伊藤俊树编著)，通过使用了浓度梯度为10％～20％的聚丙烯酰胺凝胶的sds-page，对在实验i-1中得到的化合物(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(25)、(26)、(27)、(28)和(35)(各200ng)分离。结果如图2、3、4所示。图2中，泳道0表示分子量标准物质，泳道1表示化合物(3)，泳道2表示化合物(4)，泳道3表示化合物(5)，泳道4表示化合物(6)，泳道5表示化合物(7)，泳道6表示化合物(8)，泳道7表示化合物(9)，泳道8表示化合物(10)，泳道9表示化合物(11)，泳道10表示化合物(12)。图3中，泳道0表示分子量标准物质，泳道1表示化合物(1)，泳道2表示化合物(2)，泳道3表示化合物(13)，泳道4表示化合物(14)，泳道5表示后述的化合物(15)，泳道6表示后述的化合物(16)，泳道7表示后述的化合物(17)。图4中，泳道0表示分子量标准物质，泳道1表示化合物(25)，泳道2表示化合物(26)，泳道3表示化合物(27)，泳道4表示化合物(28)，泳道5表示后述的化合物(29)，泳道6表示后述的化合物(30)，泳道7表示后述的化合物(31)，泳道8表示后述的化合物(32)，泳道9表示后述的化合物(33)，泳道10表示后述的化合物(34)，泳道11表示后述的化合物(35)，泳道12表示后述的化合物(36)，泳道13表示后述的化合物(37)。分子量标准物质均使用precision plus protein(tm)dual xtra standards(bio-rad公司)。如图2、3、4所示，证实各化合物均具有所需的分子量。
[0503]
[实验i-2-6：利用凝胶过滤hplc的缔合确认]
[0504]
通过使用了凝胶过滤柱(superdex 200 increace 10/300 gl，ge healthcare公司)的凝胶过滤hplc，确认肾上腺髓质素衍生物分子的缔合。将在实验i-1中得到的化合物(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(25)、(27)、(28)和(35)(各50μg)添加到柱中。使洗脱液(100mm乙酸钠和100mm硫酸钠，ph6.0)以0.75ml/分钟的流速流过柱子。从得到的凝胶过滤色谱图中，各化合物显示出具有与分子量相对应的保留时间的单峰。从上述结果可以证实：各肾上腺髓质素衍生物分子没有缔合，而是作为单体存在的。各化合物在上述凝胶过滤色谱中的保留时间如表1所示。
[0505]
[表1]
[0506]
肾上腺髓质素衍生物保留时间(分钟)化合物(3)18.6化合物(4)16.2化合物(5)14.6化合物(6)16.4化合物(7)13.7化合物(8)12.9化合物(9)11.9化合物(10)13.8化合物(11)14.1化合物(12)14.4化合物(13)13.3化合物(25)13.9化合物(27)13.9化合物(28)14.5化合物(35)21.2
[0507]
《实验ii：n末端缺失的肾上腺髓质素衍生物的制备》
[0508]
〔实验ii-1：n末端缺失的肾上腺髓质素衍生物的合成〕
[0509]
[实验ii-1-1：ch3o-peg(5k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(6-52))(化合物(15))的合成]
[0510]
根据已知文献(kubo,k等,“biological properties of adrenomedullin conjugated with polyethylene glycol.”,peptides,2014年,第57卷,118-121页)记载的方法，使用n-羟基琥珀酰亚胺活性酯型的5kda的ch3o-peg化试剂(peg-1)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
5-co-o-nhs)，使与人肾上腺髓质素的第6～52位氨基酸残基所对应的肽、即具有h-asn-asn-phe-gln-gly-leu-arg-ser-phe-gly-cys-arg-phe-gly-thr-cys-thr-val-gln-lys-leu-ala-his-gln-ile-tyr-gln-phe-thr-asp-lys-asp-lys-asp-asn-val-ala-pro-arg-ser-lys-ile-ser-pro-gln-gly-tyr-nh2氨基酸序列的肽的cys
16-cys
21
二硫键交联物(以下也记作“h.am(6-52)”)的n末端氨基与重均分子量5kda的聚乙二醇基(peg(5k))经由酰胺键连接，从而合成酰胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(5k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(6-52)))(15)。
[0511]
[实验ii-1-2：ch3o-peg(5k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(11-52))(化合物(16))的合成]
[0512]
根据与实验ii-1-1相同的方法，使用n-羟基琥珀酰亚胺活性酯型的5kda的ch3o-peg化试剂(peg-1)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
5-co-o-nhs)，使与人肾上腺髓质素的第11～52位氨基酸残基所对应的肽、即具有h-leu-arg-ser-phe-gly-cys-arg-phe-gly-thr-cys-thr-val-gln-lys-leu-ala-his-gln-ile-tyr-gln-phe-thr-asp-lys-asp-lys-asp-asn-val-ala-pro-arg-ser-lys-ile-ser-pro-gln-gly-tyr-nh2氨基酸序列的肽的cys
16-cys
21
二硫键交联物(以下也记作“h.am(11-52)”)的n末端氨基与重均分子量5kda的聚乙二醇基(peg(5k))经由酰胺键连接，从而合成酰胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(5k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(11-52)))(16)。
[0513]
[实验ii-1-3：ch3o-peg(5k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(16-52))(化合物(17))的合成]
[0514]
根据与实验ii-1-1相同的方法，使用n-羟基琥珀酰亚胺活性酯型的5kda的ch3o-peg化试剂(peg-1)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
5-co-o-nhs)，使与人肾上腺髓质素的第16～52位氨基酸残基所对应的肽、即具有h-cys-arg-phe-gly-thr-cys-thr-val-gln-lys-leu-ala-his-gln-ile-tyr-gln-phe-thr-asp-lys-asp-lys-asp-asn-val-ala-pro-arg-ser-lys-ile-ser-pro-gln-gly-tyr-nh2氨基酸序列的肽的cys
16-cys
21
二硫键交联物(以下也记作“h.am(16-52)”)的n末端氨基与重均分子量5kda的聚乙二醇基(peg(5k))经由酰胺键连接，从而合成酰胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(5k)-(ch2)
5-co-α
nh-(h.am(16-52)))(17)。
[0515]
[实验ii-1-4：ch3o-peg(5k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(6-52))(化合物(18))的合成]
[0516]
将0.4mg的h.am(6-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到0.5ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加2mg醛型的重均分子量5kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收烷基胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(5k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(6-52)))(18)和未反应的h.am(6-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到tsk gel g2000swxl(60cm，东曹公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.12mg(换算为h.am(6-52))的目标化合物(18)。
[0517]
[实验ii-1-5：ch3o-peg(5k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(11-52))(化合物(19))的合成]
[0518]
将0.44mg的h.am(11-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到0.5ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加2.5mg醛型的重均分子量5kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收烷基胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(5k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(11-52)))(19)和未反应的h.am(11-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到tsk gel g2000swxl(60cm，东曹公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.1mg(换算为h.am(11-52))的目标化合物(19)。
[0519]
[实验ii-1-6：ch3o-peg(5k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(16-52))(化合物(20))的合成]
[0520]
将0.46mg的h.am(16-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到0.5ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加3mg醛型的重均分子量5kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收烷基胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(5k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(16-52)))(20)和未反应的h.am(16-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到tsk gel g2000swxl(60cm，东曹公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.15mg(换算为h.am(16-52))的目标化合物(20)。
[0521]
[实验ii-1-7：ch3o-peg(20k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(6-52))(化合物(21))的合成]
[0522]
将0.22mg的h.am(6-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到0.2ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加4.1mg醛型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收烷基胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(20k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(6-52)))(21)和未反应的h.am(6-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到tsk gel g2000swxl(60cm，东曹公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.1mg(换算为h.am(6-52))的目标化合物(21)。
[0523]
[实验ii-1-8：ch3o-peg(20k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(11-52))(化合物(22))的合成]
[0524]
将0.22mg的h.am(11-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到0.2ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加4.6mg醛型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗
脱级分中回收烷基胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(20k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(11-52)))(22)和未反应的h.am(11-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到tsk gel g2000swxl(60cm，东曹公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.1mg(换算为h.am(11-52))的目标化合物(22)。
[0525]
[实验ii-1-9：ch3o-peg(20k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(16-52))(化合物(23))的合成]
[0526]
将0.22mg的h.am(16-52)肽溶解在100mm ph5.5的乙酸钠缓冲液中，得到0.2ml的肽溶液。在冰冷却下，向该肽溶液中添加5.2mg醛型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-2)(ch3o-(ch2ch2o)
n-(ch2)
2-cho)。进一步，向该肽溶液中添加nacnbh3至最终浓度为20mm。将反应液在4℃下放置24小时。将得到的反应液用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液稀释5倍。使稀释的反应液以2ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(2ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收烷基胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(ch3o-peg(20k)-(ch2)
2-ch
2-α
nh-(h.am(16-52)))(23)和未反应的h.am(16-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到tsk gel g2000swxl(60cm，东曹公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.1mg(换算为h.am(16-52))的目标化合物(23)。
[0527]
[实验ii-1-10：gl-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(16-52))(化合物(24))的合成]
[0528]
作为实验ii-1-6中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用20mg由式(vii-1-1’)表示的醛型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-3)：
[0529]
[化31]
[0530][0531]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型烷基胺连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(16-52)))(24)：
[0532]
[化32]
[0533]
通过制备型hplc得到0.2mg(换算为h.am(16-52))的目标化合物(24)。
[0534]
[实验ii-1-11：gl-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(6-52))(化合物(29))的合成]
[0535]
作为实验ii-1-7中ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用20mg由式(vii-1-1’)表示的醛型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-3)：
[0536]
[化33]
[0537][0538]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型烷基胺连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(6-52)))(29)：
[0539]
[化34]
[0540][0541]
通过制备型hplc得到0.15mg(换算为h.am(6-52))的目标化合物(29)。
[0542]
[实验ii-1-12：gl-二支链型ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(6-52))(化合物(30))的合成]
[0543]
使用fmoc肽合成法，合成具有fmoc-asn-asn-phe-gln-gly-leu-arg-ser-phe-gly-cys-arg-phe-gly-thr-cys-thr-val-gln-lys-leu-ala-his-gln-ile-tyr-gln-phe-thr-asp-lys-asp-lys-asp-asn-val-ala-pro-arg-ser-lys-ile-ser-pro-gln-gly-tyr-nh2氨基酸序列的肽的cys
16-cys
21
二硫键交联物(以下也记作“fmoc-α
nh-(h.am(6-52))”)。将17mg的fmoc-α
nh-(h.am(6-52))肽溶解在1.8ml的dmso中。向该溶液中加入9mg碳酸叔丁基琥珀酰亚胺和6μl二异丙基乙胺。将反应溶液搅拌5小时。向得到的反应溶液中加入乙酸水溶液。之后，冷冻干燥该溶液。将残余物溶解在2ml的dmso中。向得到的溶液中加入0.2ml二乙胺。将得到的溶液搅拌70分钟。向反应溶液中加入乙酸水溶液进行稀释。使用反相hplc将得到的溶液分离，得到含有h.am(6-52)肽的级分。将该级分冷冻干燥，得到9mg的h.am(6-52)的4个赖氨酸受boc基团保护的肽，为白色粉末。
[0544]
将2mg的上述得到的肽溶解在2ml的dmso中。在冰冷却下，向该肽溶液中添加15mg
由式(xii-1-1’)表示的对硝基苯酯型的重均分子量20kda的gl二支链型ch3o-peg化试剂(peg-9)：
[0545]
[化35]
[0546][0547]
进一步，向该肽溶液中添加6.5μl的0.1m三乙胺/dmso溶液。将反应液在冰冷却下放置1小时。之后，将反应液恢复至室温并放置24小时。进一步将反应液的温度提升至30℃，反应持续2天。冷冻干燥反应液。在冰冷却下，向得到的残余物中添加1ml三氟乙酸。将混合物的温度恢复至室温并放置2小时。接着，使用蒸发器，从混合物中减压蒸馏除去三氟乙酸。向得到的残余物中添加4ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液，使其溶解。使该溶液以1ml/hr的流速流过用50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液平衡的sp-sepharose hp(ge healthcare公司)柱(1ml)。该柱用2ml的50mm ph4.0的乙酸钠缓冲液洗涤。然后，使含有5ml 1m nacl的50mm ph5.0的乙酸钠缓冲液流过柱子，得到洗脱级分。在洗脱级分中回收具有甘油骨架的二支链型尿烷连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(6-52)))(30):
[0548]
[化36]
[0549][0550]
和未反应的h.am(6-52)肽。使用超滤膜(amicon ultra4，millipore公司)将该洗脱级分浓缩至0.2ml。使用连接到tsk gel g2000swxl(60cm，东曹公司)柱的hplc系统(l-2000，日立hightech science公司制)分级纯化所得到的浓缩液(洗脱液：含80mm ph6的乙酸钠缓冲液 80mm na2so4的20％乙腈，流速0.5ml/min)。通过上述制备型hplc得到0.2mg(换算为h.am(6-52))的目标化合物(30)。
[0551]
[实验ii-1-13：gl-二支链型ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(11-52))(化合物(31))的合成]
[0552]
使用fmoc肽合成法，合成具有fmoc-leu-arg-ser-phe-gly-cys-arg-phe-gly-thr-cys-thr-val-gln-lys-leu-ala-his-gln-ile-tyr-gln-phe-thr-asp-lys-asp-lys-asp-asn-val-ala-pro-arg-ser-lys-ile-ser-pro-gln-gly-tyr-nh2氨基酸序列的肽的cys
16-cys
21
二硫键交联物(以下也记作“fmoc-α
nh-(h.am(11-52))”)。使用fmoc-α
nh-(h.am(11-52))，根据与实验ii-1-12相同的步骤，得到6mg的h.am(11-52)的4个赖氨酸受boc基团保护的肽，为白色粉末。
[0553]
将实验ii-1-12中的h.am(6-52)肽变更为上述得到的h.am(11-52)肽，并且使用
20mg由式(xii-1-1’)表示的对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-9)：
[0554]
[化37]
[0555][0556]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型尿烷连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(11-52)))(31)：
[0557]
[化38]
[0558][0559]
通过制备型hplc得到0.2mg(换算为h.am(11-52))的目标化合物(31)。
[0560]
[实验ii-1-14：gl-二支链型ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(16-52))(化合物(32))的合成]
[0561]
使用fmoc肽合成法，合成具有fmoc-cys-arg-phe-gly-thr-cys-thr-val-gln-lys-leu-ala-his-gln-ile-tyr-gln-phe-thr-asp-lys-asp-lys-asp-asn-val-ala-pro-arg-ser-lys-ile-ser-pro-gln-gly-tyr-nh2氨基酸序列的肽的cys
16-cys
21
二硫键交联物(以下也记作“fmoc-α
nh-(h.am(16-52))”)。使用fmoc-α
nh-(h.am(16-52))，根据与实验ii-1-12相同的步骤，得到6mg的h.am(16-52)的4个赖氨酸受boc基团保护的肽，为白色粉末。
[0562]
将实验ii-1-12中的h.am(6-52)肽变更为上述得到的h.am(16-52)肽，并且使用15mg由式(xii-1-1’)表示的对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-9)：
[0563]
[化39]
[0564][0565]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型尿烷连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(20k)-co-α
nh-(h.am(16-52)))(32)：
[0566]
[化40]
[0567][0568]
通过制备型hplc得到0.2mg(换算为h.am(16-52))的目标化合物(32)。
[0569]
[实验ii-1-15：gl-二支链型ch3o-peg(40k)-co-α
nh-(h.am(16-52))(化合物(33))的合成]
[0570]
作为实验ii-1-14中对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-9)的替代品，使用32mg由式(xii-1-1’)表示的对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-9)：
[0571]
[化41]
[0572][0573]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型尿烷连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(40k)-co-α
nh-(h.am(16-52))(33)。通过制备型hplc得到0.15mg(换算为h.am(16-52))的目标化合物(33)。
[0574]
[实验ii-1-16：gl-四支链型ch3o-peg(40k)-co-α
nh-(h.am(6-52))(化合物(34))的合成]
[0575]
作为实验ii-1-12中对硝基苯酯型的重均分子量20kda的ch3o-peg化试剂(peg-9)的替代品，使用20mg由式(xii-2-1’)表示的对硝基苯酯型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-10)：
[0576]
[化42]
[0577][0578]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的四支链型尿烷连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-四支链型ch3o-peg(40k)-co-α
nh-(h.am(6-52))(34)：
[0579]
[化43]
[0580][0581]
通过制备型hplc得到0.15mg(换算为h.am(6-52))的目标化合物(34)。
[0582]
〔实验ii-2：n末端缺失的肾上腺髓质素衍生物的结构分析〕
[0583]
[实验ii-2-1：利用断裂肽质谱分析的peg基结合位置的确定]
[0584]
根据与实验i-2-2相同的步骤，得到用赖氨酸肽链内切酶对化合物(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)和(34)而成的断裂肽。根据与实验i-2-2相同的步骤，使用rp-hplc将得到的断裂肽纯化并分离。结果，在来自所有化合物的断裂肽的rp-hplc色谱图中，检测到与图1所示的峰(5)、(6)、(7)和(8)相对应的峰。从实验i-2-2的结果可以证实：峰(1)和(5)对应h.am(39-46)的肽片段，峰(2)和(6)对应h.am(47-52)的肽片段，峰(3)和(7)对应h.am(26-36)的肽片段，峰(4)对应h.am(1-25)的肽片段，峰(8)对应h.am(1-52)肽的n末端侧的肽片段结合有peg基的化合物。因此，从上述结果可以证实：化合物(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)和(34)中的peg基都与n末端的α氨基结合。
[0585]
[实验ii-2-2：利用氨基酸序列分析的peg基结合位置的确定]
[0586]
使用蛋白测序仪(procise 494 ht蛋白测序系统，美国应用生物系统公司)，将化合物(18)、(21)、(22)、(23)、(24)、(31)、(33)和(34)用于氨基酸序列分析。结果，所有化合物均未检测到相当于人肾上腺髓质素的n末端氨基酸残基的氨基酸。从上述结果可以证实：化合物(18)、(21)、(22)、(23)、(24)、(31)、(33)和(34)中的peg基都与n末端的α氨基结合。
[0587]
[实验ii-2-3：利用sds-page的分子量分析]
[0588]
根据实验书(实验医学增刊“蛋白质实验手册”羊土社，竹绳忠臣、伊藤俊树编著)，通过使用了浓度梯度为10％～20％的聚丙烯酰胺凝胶的sds-page，对在实验ii-1中得到的化合物(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)和(34)(各200ng)分离。结果如图3、4、5所示。图3中，泳道0表示分子量标准物质，泳道1表示上述化合物(1)，泳道2表示上述化合物(2)，泳道3表示上述化合物(13)，泳道4表示上述化合物(14)，泳道5表示化合物(15)，泳道6表示化合物(16)，泳道7表示化合物(17)。图4中，泳道0表示分子量标准物质，泳道1表示上述化合物(25)，泳道2表示上述化合物(26)，泳道3表示上述化合物(27)，泳道4表示上述化合物(28)，泳道5表示化合物(29)，泳道6表示化合物(30)，泳道7表示化合物(31)，泳道8表示化合物(32)，泳道9表示化合物(33)，泳道10表示化合物(34)，泳道11表示上述化合物(35)，泳道12表示后述化合物(36)，泳道13表示后述化合物(37)。图5中，泳道0和泳道1表示分子量标准物质，泳道2表示化合物(18)，泳道3表示
化合物(19)，泳道4表示化合物(20)，泳道5表示化合物(21)，泳道6表示化合物(22)，泳道7表示化合物(23)，泳道8表示化合物(24)。分子量标准物质均使用precision plus protein(tm)dual xtra standards(bio-rad公司)。如图3、4、5所示，证实各化合物均具有所需的分子量。
[0589]
[实验ii-2-4：利用凝胶过滤hplc的缔合确认]
[0590]
通过使用了凝胶过滤柱(superdex 200 increace 10/300 gl，gehealthcare公司)的凝胶过滤hplc，确认肾上腺髓质素衍生物分子的缔合。将在实验ii-1中得到的化合物(18)、(21)、(22)、(23)、(24)、(29)和(34)(各50μg)添加到柱中。使洗脱液(100mm乙酸钠和100mm硫酸钠，ph6.0)以0.75ml/分钟的流速流过柱子。从得到的凝胶过滤色谱图中，各化合物显示出具有与分子量相对应的保留时间的单峰。从上述结果可以证实：各肾上腺髓质素衍生物分子没有缔合，而是作为单体存在的。各化合物在上述凝胶过滤色谱中的保留时间如表2所示。
[0591]
[表2]
[0592]
肾上腺髓质素衍生物保留时间(分钟)化合物(18)21.4化合物(21)16.2化合物(22)16.2化合物(23)16.2化合物(24)13.9化合物(29)13.9化合物(34)14.5
[0593]
《实验iii：c末端添加甘氨酸的肾上腺髓质素衍生物的制备》
[0594]
〔实验iii-1：c末端添加甘氨酸的肾上腺髓质素衍生物的合成〕
[0595]
[实验iii-1-1：gl-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))-gly(化合物(36))的合成]
[0596]
将实验i-1-5中的h.am(1-52)肽变更为h.am(1-52)-gly肽，并且作为ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用80mg由式(vii-1-1’)表示的醛型的重均分子量40kda的ch3o-peg化试剂(peg-3)：
[0597]
[化44]
[0598][0599]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型烷基胺连接型peg(40k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(40k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)-gly))(36)：
[0600]
[化45]
[0601][0602]
通过制备型hplc得到0.8mg(h.am(1-52)-gly换算)的目标化合物(36)。
[0603]
[实验iii-1-2：gl-二支链型ch3o-peg(60k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52))-gly(化合物(37))的合成]
[0604]
将实验i-1-5中的h.am(1-52)肽变更为h.am(1-52)-gly肽，并且作为ch3o-peg化试剂(peg-2)的替代品，使用80mg由式(vii-1-1’)表示的醛型的重均分子量60kda的ch3o-peg化试剂(peg-3)：
[0605]
[化46]
[0606][0607]
除此以外，按照与上述相同的步骤，得到具有甘油骨架的二支链型烷基胺连接型peg(60k)肾上腺髓质素衍生物(gl-二支链型ch3o-peg(60k)-ch
2-α
nh-(h.am(1-52)-gly))(37)：
[0608]
[化47]
[0609][0610]
通过制备型hplc得到0.7mg(h.am(1-52)-gly换算)的目标化合物(37)。
[0611]
〔实验iii-2：c末端添加甘氨酸的肾上腺髓质素衍生物的结构分析〕
[0612]
[实验iii-2-1：利用氨基酸序列分析的peg基结合位置的确定]
[0613]
使用蛋白测序仪(procise 494ht蛋白测序系统，美国应用生物系统公司)，将化合物(36)和(37)用于氨基酸序列分析。结果，所有化合物均未检测到相当于人肾上腺髓质素的n末端氨基酸残基的氨基酸。从上述结果可以证实：化合物(36)和(37)中的peg基都与n末端的α氨基结合。
[0614]
《实验iv：肾上腺髓质素衍生物的使用例》
[0615]
[实验iv-1：肾上腺髓质素衍生物的细胞内camp浓度升高作用]
[0616]
已知肾上腺髓质素(am)的生理作用通过增加细胞内camp的浓度来表现(参考非专利文献1)。所以，向am受体表达培养细胞系(hek293细胞系)中添加在实验i-1、实验ii-1和实验iii-1中制备的各化合物或全长am、n末端缺失的am或c末端添加甘氨酸的am，测定细胞内camp的产量。在0.5mm的ibmx的存在下，在汇合的hek293细胞中添加10-8
mol/l的各化合物
或h.am(1-52)、h.am(6-52)、h.am(11-52)、h.am(16-52)或者h.am(1-52)-gly，培养15分钟。然后，使用camp elisa检测试剂盒(ge healthcare,#rpn2251)，测量各测试样品的hek293细胞中的细胞内camp浓度。肾上腺髓质素衍生物在am受体表达培养细胞中的细胞内camp浓度升高作用如表3所示。
[0617]
[表3]
[0618][0619]
1)添加各化合物时的细胞内camp浓度相对于添加h.am(1-52)时的细胞内camp浓度的百分率(％)。
[0620]
＊)添加各化合物时的细胞内camp浓度相对于添加h.am(6-52)时的细胞内camp浓度的百分率(％)。
[0621]
＊＊)添加各化合物时的细胞内camp浓度相对于添加h.am(11-52)时的细胞内camp浓度的百分率(％)。
[0622]
＊＊＊)添加各化合物时的细胞内camp浓度相对于添加h.am(16-52)时的细胞内camp浓度的百分率(％)。
[0623]
＊＊＊＊)添加各化合物时的细胞内camp浓度相对于添加h.am(1-52)-gly时的细胞内camp浓度的百分率(％)。
[0624]
如表3所示，试验的肾上腺髓质素衍生物显示出与未连接peg基的相应的全长am、n末端缺失的am或c末端添加甘氨酸的am中的任一个具有同等程度的细胞内camp浓度升高作用。因此可以推测，连接有peg基的肾上腺髓质素衍生物保持着与作为母体化合物的全长am、n末端缺失的am或c末端添加甘氨酸的am具有同等程度的生物活性。
[0625]
将具有相同(20kda)重均分子量的peg基和相同氨基酸序列的肽部分(h.am(1-52))，且只有peg基与肽部分的连接形式不同的肾上腺髓质素衍生物即化合物(2)、化合物(4)、化合物(6)和化合物(14)进行对比，结果发现，烷基胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(4)和化合物(6)与酰胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(2)相比，显示出更高的细胞内camp浓度升高作用。同样，尿烷连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(14)与酰胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(2)相比，显示出更高的细胞内camp浓度升高作用。
[0626]
将具有相同(5kda)重均分子量的peg基和相同氨基酸序列的肽部分(h.am(6-52)、h.am(11-52)或h.am(16-52))，且只有peg基与肽部分的连接形式不同的肾上腺髓质素衍生物即化合物(15)、化合物(16)和化合物(17)以及化合物(18)、化合物(19)和化合物(20)分别进行对比，结果发现，酰胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(15)、化合物(16)和化合物(17)随着肽部分的n末端缺失的扩大，细胞内camp浓度升高作用明显降低。另一方面，烷基胺连接型peg(5k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(18)、化合物(19)和化合物(20)中，其肽部分的n末端缺失对细胞内camp浓度升高作用的影响受到抑制。
[0627]
将具有相同(20kda)重均分子量的peg基和相同peg基与肽部分的连接形式，且只有氨基酸序列的肽部分不同的肾上腺髓质素衍生物即化合物(4)以及化合物(21)、化合物(22)和化合物(23)进行对比，结果发现，烷基胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(21)、化合物(22)和化合物(23)中，肽部分的n末端缺失未对细胞内camp浓度升高作用产生影响，显示出较高的细胞内camp浓度升高作用。
[0628]
[实验iv-2：肾上腺髓质素衍生物的降压作用]
[0629]
以1nmol/kg的用量，向麻醉状态下的大鼠静脉内单次给予实验i-1和实验ii-1中制备的各化合物或全长am，观察该大鼠的血压变化。通过异氟烷吸入对11～14周龄的雄性wistar大鼠进行麻醉诱导。切开气管后，以1.5～2.5％的异氟烷浓度和0.6～0.8l/分钟的流量进行吸入麻醉管理。从上述大鼠分离出右侧颈静脉，插入相当于26g的导管。接着，从上述处理后的大鼠分离出左侧颈动脉，插入相当于23g的导管。通过右侧颈静脉的导管，以2.4ml/小时补充生理盐水肝素溶液(生理盐水：100ml；肝素：1000单位)。将1nmol/kg的化合物(2)、化合物(4)、化合物(8)或h.am(1-52)溶解在生理盐水中的形式通过相同导管进行给药。插入颈动脉的导管连接到压力换能器上。随时间推移测量化合物(2)、化合物(4)或h.am(1-52)在给药前的血压和给药后的血压。化合物(2)、化合物(4)、化合物(8)或h.am(1-52)给药开始时起的经过时间与平均血压之间的关系如图6所示。图6的a图表示化合物(2)、化合物(4)和h.am(1-52)的结果，b图表示化合物(8)和h.am(1-52)的结果。需要说明的是，图6中纵轴表示从各药剂给药时的平均血压减去各药剂给药前的平均血压而得到的差值。
[0630]
如图6所示，在未连接peg基的全长am(h.am(1-52))中，观察到在给药之后血压急
剧下降。相反，在连接有peg基的肾上腺髓质素衍生物(化合物(2)、化合物(4)和化合物(8))中，未看到在h.am(1-52)中观察到的给药之后血压急剧下降。因此可以推测，连接有peg基的肾上腺髓质素衍生物能够抑制作为母体化合物的全长am所产生的血压急剧下降这样的不良副作用。
[0631]
将具有相同(20kda)重均分子量的peg基和相同氨基酸序列的肽部分(h.am(1-52))，且只有peg基与肽部分的连接形式不同的肾上腺髓质素衍生物即化合物(2)和化合物(4)以及化合物(8)进行对比，结果发现，烷基胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(4)和化合物(8)与酰胺连接型peg(20k)肾上腺髓质素衍生物即化合物(2)相比，给药之后的血压下降受到进一步抑制。
[0632]
[实验iv-3：肾上腺髓质素衍生物在皮下给药时随时间推移血液浓度的测量(1)]
[0633]
以10nmol/kg的用量，向大鼠的皮下单次给予实验i-1中制备的化合物(8)或全长am，观察肾上腺髓质素衍生物的血液浓度随时间的变化。向7～8周龄的雄性wistar大鼠(约250g)的皮下给予溶解在生理盐水中的化合物(8)或h.am(1-52)。在给药开始时起1天后、7天后和10天后，向腹腔内给予50mg戊巴比妥，在麻醉状态下每次从尾静脉采血300μl。向得到的血液样本中，立即添加300μg的edta-2na和21μg的抑肽酶，并在3000rpm的条件下离心分离10分钟，得到血浆。通过放射免疫分析(ria)法(kitamura k,ichiki y,tanaka m等,immunoreactive adrenomedullin in human plasma.febs lett.第341卷,288-290页,1994年)测量各样本的血浆中am浓度。化合物(8)给药开始时起的经过时间与血浆中am浓度之间的关系如图7所示。
[0634]
如图7所示，在给予化合物(8)的情况下，确认到血浆中am浓度在1天后为2600pm以上，在7天后为740pm以上，在10天后为280pm以上。另一方面，在给药h.am(1-52)的情况下，在给予化合物(8)的1天后血浆中am为6.7pm，在7天后和10天后的测量中，血浆中am均为0pm(检测灵敏度以下)。已知大鼠的血浆中am浓度通常为1pm左右(mori,y.等、long-term adrenomedullin infusion improves survival in malignant hypertensive rats.hypertension,2002年,第40卷,107-113页)。上述结果表明：本发明的烷基胺连接型肾上腺髓质素衍生物与作为母体分子的肾上腺髓质素相比，在相当长的时间内以高浓度存在于血液中。
[0635]
[实验iv-4：肾上腺髓质素衍生物在颈静脉单次给药时随时间推移血液浓度的测量]
[0636]
以3nmol/kg的用量，向麻醉状态下的大鼠静脉内单次给予实验i-1中制备的化合物(6)或全长am，观察肾上腺髓质素衍生物的血液浓度随时间的变化。通过异氟烷吸入对8～9周龄的雄性wistar大鼠(约300g)进行麻醉诱导。切开气管后，以1.5％～2.5％的异氟烷浓度和0.6～0.8l/分钟的流量进行吸入麻醉管理。从上述大鼠分离出右侧颈静脉，插入相当于26g的导管。接着，从上述处理后的大鼠分离出左侧颈动脉，插入相当于23g的导管。通过右侧颈静脉的导管，以2.4ml/小时补充生理盐水肝素溶液(生理盐水：100ml；肝素：1000单位)。通过相同导管，以3nmol/kg的化合物(6)或h.am(1-52)溶解在生理盐水中的形式给药。经插入到颈动脉的导管，在从给药开始时起1小时后、2小时后和4小时后，随时间推移采血300μl。向得到的血液样本中，立即添加300μg的edta-2na和21μg的抑肽酶，并在3000rpm的条件下离心分离10分钟，得到血浆。通过放射免疫分析(ria)法(kitamura k,ichiki y,
tanaka m等,immunoreactive adrenomedullin in human plasma.febs lett.第341卷,288-290页,1994年)测量各样本的血浆中am浓度。化合物(6)或h.am(1-52)给药开始时起的经过时间与血浆中am浓度之间的关系如图8所示。
[0637]
如图8所示，化合物(6)与h.am(1-52)相比，血液中的半衰期明显延长。上述结果表明：本发明的烷基胺连接型肾上腺髓质素衍生物与作为母体分子的肾上腺髓质素相比，血液中的半衰期明显延长。
[0638]
[实验iv-5：自发性高血压大鼠(shr大鼠)中的血压升高抑制作用(1)]
[0639]
以336μg/100μl的用量，向自发性高血压大鼠(shr)的皮下单次给予实验i-1中制备的化合物(8)，观察肾上腺髓质素衍生物的血压升高抑制作用。对8周龄的雄性shr(约200g)给予高盐食物(8％nacl)。在给予高盐食物时，以化合物(8)溶解在生理盐水中的形式给药。作为对照组，对相同条件的雄性shr(约200g)皮下单次给予100μl生理盐水。随时间推移测量化合物(8)或生理盐水给药前2天和给药后9天的血压和脉搏。化合物(8)或生理盐水给药前2天和给药后9天的血压值如图9所示。
[0640]
如图9所示，化合物(8)给药组与对照组(生理盐水给药组)相比，血压升高受到抑制。上述结果表明：本发明的烷基胺连接型肾上腺髓质素衍生物具有抑制血压升高的药理作用。
[0641]
[实验iv-6：肾上腺髓质素衍生物在皮下给药时随时间推移血液浓度的测量(2)]
[0642]
根据与实验iv-3相同的步骤，以10nmol/kg的用量，向大鼠的皮下单次给予实验i-1中制备的化合物(27)，观察肾上腺髓质素衍生物的血液浓度随时间的变化。
[0643]
在给予化合物(27)的情况下，确认到血浆中am浓度在1天后为3600pm以上，在7天后为120pm以上。上述结果表明：本发明的尿烷连接型肾上腺髓质素衍生物与作为母体分子的肾上腺髓质素相比，在相当长的时间内以高浓度存在于血液中。
[0644]
[实验iv-7：肾上腺髓质素衍生物在皮下给药时随时间推移血液浓度的测量(3)]
[0645]
以30nmol/kg的用量，向大鼠的皮下单次给予实验iii-1中制备的化合物(37)，观察肾上腺髓质素衍生物的血液浓度随时间的变化。向7～8周龄的雄性wistar大鼠(约250g)的皮下给予溶解在生理盐水中的化合物(37)。在给药开始时起1天后、2天后、4天后、7天后和9天后，向腹腔内给予50mg戊巴比妥，在麻醉状态下每次从尾静脉采血300μl。向得到的血液样本中，立即添加300μg的edta-2na和21μg的抑肽酶，并在3000rpm的条件下离心分离10分钟，得到血浆。用ria法测量各样本的血浆中am浓度。
[0646]
在给予化合物(37)的情况下，确认到血浆中am浓度在1天后为34000pm以上，在7天后为1600pm以上，在9天后为110pm以上。上述结果表明：本发明的烷基胺连接型添加甘氨酸的肾上腺髓质素衍生物与作为母体分子的肾上腺髓质素相比，在相当长的时间内以高浓度存在于血液中。
[0647]
[实验iv-8：自发性高血压大鼠(shr)中的血压升高抑制作用(2)]
[0648]
以30nmol/kg的用量，在shr的皮下单次给予实验iii-1中制备的化合物(37)，观察肾上腺髓质素衍生物的血压升高抑制作用。对8周龄的雄性shr(约200g)，以化合物(37)溶解在生理盐水中的形式给药。作为对照组，对相同条件的雄性shr(约200g)皮下单次给予100μl生理盐水。随时间推移测量在化合物(37)或生理盐水给药前1天和给药后4天以及给药后9天的血压。化合物(37)或生理盐水给药后4天和给药后9天的相对于给药前一天的平
均收缩压的血压变化值如图10所示。
[0649]
如图10所示，化合物(37)给药组与对照组相比，血压升高受到抑制。上述结果表明：本发明的烷基胺连接型添加甘氨酸的肾上腺髓质素衍生物具有抑制血压升高的药理作用。
[0650]
[实验iv-9：在葡聚糖硫酸钠(dss)诱导结肠炎模型中的药理作用]
[0651]
本发明人研究了皮下给予化合物(8)对dss诱导结肠炎模型的改善作用。将化合物(8)皮下给予小鼠的背部。在给药次日(第0天)，通过给予7天3％dss饮用水，开始制备结肠炎模型。化合物(8)的给药量设定为1nmol/kg、5nmol/kg和25nmol/kg这三种用量。作为介质对照组，给予生理盐水。从dss饮用水开始日(第0天)起的第3、5、7天，按照表4所示的评分对体重和粪便的性状进行评价。化合物(8)给药组和对照组中从制备dss诱导结肠炎模型时起的经过时间与评分合计值之间的关系如图11所示。
[0652]
[表4]
[0653][0654]
如图11所示，确认到化合物(8)给药组在5nmol/kg和25nmol/kg给药组中的评分显著降低。评分降低提示结肠炎的缓解作用。此外，与介质对照组相比，确认到5nmol/kg给药组的肠道湿重趋于减轻，而25nmol/kg给药组的肠道长度趋于变长。上述结果提示：皮下给予化合物(8)对本试验条件下的dss结肠炎模型病症的缓解作用。
[0655]
[实验iv-10：在2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)诱导结肠炎模型中的药理作用]
[0656]
本发明人研究了皮下给予化合物(8)对tnbs诱导结肠炎模型的改善作用。对7周龄的雄性wistar大鼠进行1周的驯化饲养。之后，对大鼠皮下给予化合物(8)(1nmol/kg)或生理盐水(第0天)。此外，在皮下给药的同时禁食24小时，排出体内粪便。按照以下步骤制备结肠炎模型。将tnbs(nacalai tesque公司)制备成30mg/500μl(50％乙醇水溶液中)的浓度。向腹腔内给予50mg戊巴比妥，在麻醉状态下使用饲喂针从肛门缓慢地旋转插入8cm，注入500μl药液(第1天)。之后保持2分钟倒置状态。每天评价体重和腹泻的性状。14天后，向腹腔内给予50mg戊巴比妥，在麻醉状态下进行心脏采血，取出结肠。取出时，测量肠道的长度和重量，进行各组的对比。化合物(8)给药组和对照组中从制备tnbs诱导结肠炎模型时起的经过时间与体重之间的关系如图12所示。图12中，a表示皮下给予化合物(8)或生理盐水开始禁食的日期，b表示给予tnbs的日期。化合物(8)给药组和对照组中的结肠重量如图13所示。化合物(8)给药组和对照组中的结肠肠道长度如图14所示。
[0657]
如图12所示，在介质对照组中确认到结肠炎发病导致的体重下降，而在化合物(8)给药组中，结肠炎发病导致的体重下降则得到了改善。当结肠炎发病时，炎症部位肿胀通常会使结肠的重量增加。如图13所示，化合物(8)给药组与介质对照组相比，结肠重量的增加明显受到抑制。此外，当结肠炎导致的炎症发展时，结肠的肠道长度通常会变短。如图14所示，化合物(8)给药组与介质对照组相比，结肠肠道长度的减少明显受到抑制。从结肠的解
剖结果也可确认到化合物(8)给药组与介质对照组相比，病理变化明显较少。上述结果提示：皮下给予化合物(8)对本试验条件下的tnbs诱导结肠炎模型病症的缓解作用。因此可知，本发明的肾上腺髓质素衍生物对结肠炎具有治疗效果。
[0658]
[实验iv-11：在肺动脉高压症模型中的药理作用]
[0659]
本发明人研究了皮下给予化合物(8)对肺动脉高压症模型的改善作用。购买3周龄的雄性wistar大鼠(日本charles river公司)，进行1周的驯化饲养。之后，对大鼠皮下给予60mg/kg浓度的野百合碱溶液。同时，在背部的其他位置单次皮下给予化合物(8)(1nmol/kg)或生理盐水。作为肺动脉高压症模型中的效果的判定指标，测量普通的心脏右心室与左心室的重量比。该模型中，已知随着病症发展，右心室肥大使得重量比随之增大(miyauchi t.,yorikane r.,sakai s.,sakurai t.,okada m.,nishikibe m.,yano m.,yamaguchi i.,sugishita y.and goto k.:contribution of endogenous endothelinl to the progression of cardiopulmonary alterations in rats with monocrotaline-induced pulmonary hypertension.circ.res.,第73卷,887-897页,1993年)。在给药后14天，向腹腔内给予50mg戊巴比妥，在麻醉状态下从下腔静脉采血。之后，取出心脏并测量重量。取出的心脏分为右心室和左心室，测量各自的重量来计算右心室重量与左心室重量之比。化合物(8)给药组和对照组中的右心室重量与左心室重量之比如图15所示。
[0660]
如图15所示，化合物(8)给药组与介质对照组相比，右心室与左心室重量比明显较低。上述结果提示：皮下给予化合物(8)对本试验条件下的肺动脉高压症模型病症的缓解作用。
[0661]
[实验iv-12：在创伤模型中的药理作用]
[0662]
本发明人研究了皮下给予化合物(8)对创伤模型的药理作用。购买5周龄的雄性balb/c-nu/nu小鼠(日本charles river公司)，进行1周的驯化饲养。之后，向小鼠腹腔内给予5mg戊巴比妥进行麻醉。用消毒用乙醇对皮肤进行消毒。在使小鼠侧卧位的状态下，用手指拉住背部皮肤，在消毒的绘图垫板上，从一侧向相对侧，用皮肤活体组织检查用圆形刀(活检穿孔器)按压切割，制备2个直径各为6mm的缺损创伤。同时，在背部的其他位置单次皮下给予化合物(8)(1nmol/kg)。作为介质对照组，给予生理盐水。涂布创伤敷料覆盖含创伤部位的背部。观察创伤面积随时间推移的变化。化合物(8)给药组和对照组中从制备创伤模型时起的经过时间与创伤面积之间的关系如图16所示。
[0663]
如图16所示，化合物(8)给药组与介质对照组相比，创伤面积缩小迅速。从上述结果可以证实：皮下给予化合物(8)对本试验条件下的创伤的治愈促进作用。
[0664]
[实验iv-13：在血管闭塞模型中的药理作用]
[0665]
本发明人利用莫里斯(morris)水迷宫试验，研究了皮下给予化合物(8)对血管闭塞模型大鼠的学习和记忆障碍的药理作用。在椎动脉闭塞手术前，皮下给予化合物(8)。化合物(8)的给药量设定为1nmol/kg和10nmol/kg这两种用量。作为介质对照组，给予生理盐水。之后，在麻醉状态下永久闭塞两侧椎动脉。次日，在麻醉状态下使用缝合线将两侧颈总动脉闭塞30分钟。之后，去除缝合线，重新开始血流。将两侧颈总动脉闭塞日设定为血管闭塞模型的制备日，即第0天。在制备模型后的第9天，让大鼠在摩里斯水迷宫中训练游泳一次(熟悉水性)。从制备模型后的第10天起，以4次训练/天的间隔进行5天隐匿平台试验(hidden platform test)。在隐匿平台试验的第5天(制备模型后第14天)的最终训练的1小
时后，进行探索试验(probe test)。
[0666]
使用以下实验装置进行摩里斯水迷宫试验。准备直径150cm、高45cm、水深30cm的圆形水池。直径12cm的无色透明平台放置在圆形水池的水面下约1cm的位置。圆形水池的水温设定为23
±
1℃。在设置实验装置的室内设置间接照明，配置可作为动物的视觉提示的物体(日历、球、立方体和条纹图案的纸)。试验期间内，这些配置保持不变。测定使用视频行为学分析装置(smart，panlab公司)。
[0667]
隐匿平台试验按照以下步骤进行。手术后第9天，不设置平台，让大鼠游泳90秒，使其适应水(熟悉水性)。测定从手术后第10天开始。以4次训练/天的间隔进行测定。测定从起点至到达平台的游泳时间(逃避潜伏期)。每次训练时改变起点位置。平台的位置在所有训练中均固定在同一位置。此外，一次训练的最长游泳时间设定为90秒。对于在最长游泳时间内无法到达平台的大鼠，在游泳后，在平台上设置30秒的停留时间。
[0668]
探索试验按照以下步骤进行。在实验装置中，不设置平台，将水池分成四个象限。在隐匿平台试验时，测定在设置平台的象限内的游泳时间。根据测定的游泳时间，并基于以下计算公式计算停留率(％)。探索试验的游泳时间设定为60秒。制备模型后第14天，最终隐匿平台试验结束1小时后只进行一次训练。
[0669]
[数1]
[0670][0671]
化合物(8)给药组和对照组中从制备血管闭塞模型时起的经过时间与隐匿平台试验中的逃避潜伏期之间的关系如图17所示。此外，对于血管闭塞模型大鼠的化合物(8)给药组和对照组中的探索试验停留率如图18所示。如图17所示，在隐匿平台试验中，化合物(8)给药组的1nmol/kg和10nmol/kg给药组与介质对照组相比，到达平台的时间即逃避潜伏期缩短。此外，如图18所示，在探索试验中，化合物(8)给药组的1nmol/kg和10nmol/kg给药组与介质对照组相比，停留率显著提高。本试验中，在两侧颈总动脉闭塞手术时的死亡率中无显著性差异。从上述结果可以证实：皮下给予化合物(8)对本试验条件下的4血管闭塞模型大鼠的学习和记忆障碍的缓解作用。
[0672]
[实验iv-14：在佐剂诱导关节炎模型中的药理作用]
[0673]
本发明人研究了皮下给予化合物(8)对佐剂诱导关节炎模型的药理作用。对大鼠皮下给予化合物(8)。在给予化合物(8)的次日(第1天)，对动物的右侧后肢的皮下按0.1ml/只的给药量给予佐剂(致炎剂)，诱导关节炎。化合物(8)的给药量设定为1nmol/kg和10nmol/kg这两种用量。作为介质对照组，给予生理盐水。使用足趾容积测定装置(mk-550，室町机械株式会社)，在第0天(佐剂给药的前一天)、第4天、第7天、第10天和第14天测定左右脚的足趾容积和肿胀率。此外，根据表5所示的评分，对第0天(佐剂给药的前一天)、第4天、第7天、第10天和第14天的炎症评分进行评价。化合物(8)给药组和对照组中从给药时起的经过时间与佐剂给药后出现的足趾容积之间的关系如图19所示。化合物(8)给药组和对照组中从给药时起的经过时间与佐剂给药后出现的肿胀率之间的关系如图20所示。此外，化合物(8)给药组和对照组中从给药时起的经过时间与佐剂给药后出现的炎症评分之间的关系如图21所示。
[0674]
[表5]
[0675][0676]
另外，如图19、20所示，化合物(8)给药组的1nmol/kg和10nmol/kg给药组与介质对照组相比，足趾容积和肿胀率显著降低。此外，如图21所示，化合物(8)给药组的1nmol/kg和10nmol/kg给药组与介质对照组相比，关节炎评分显著降低。从上述结果可以证实：皮下给予化合物(8)对于本试验条件下的佐剂诱导关节炎模型大鼠的关节炎的缓解作用。
[0677]
本说明书中引用的所有出版物，专利和专利申请均通过引用整体并入本文。