一种可促进血管生成的光固化水凝胶微球的制备方法与流程

1.本发明涉及生物材料制备技术领域，尤其是涉及一种可促进血管生成的可控光固化水凝胶微球的制备方法。
技术背景
2.血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，vegf），又称血管通透因子（vascular permeability factor，vpf）是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。在人类胎盘滋养细胞及血管内皮细胞上有vegf及其受体的表达，说明vegf参与正常妊娠、胎盘血管生成的调节和滋养叶细胞生理性的侵入。但是目前存在的多肽水凝胶无法有效地控制其降解速率。
3.目前在生物医用材料领域，大部分都是特异性多肽与高分子材料混合，无法达到缓释的作用。共价键（covalent bond）是化学键的一种，两个或多个原子共同使用它们的外层电子，在理想情况下达到电子饱和的状态，由此组成比较稳定的化学结构，像这样由几个相邻原子通过共用电子并与共用电子之间形成的一种强烈作用叫做共价键。其本质是原子轨道重叠后，高概率地出现在两个原子核之间的电子与两个原子核之间的电性作用。采用共价接枝的方法所得到的材料除了能得到稳定的效果外，还可能通过控制反应的条件得到可控力学性能、可控接枝率的生物医用材料。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种可促进血管生成的光固化水凝胶微球的制备方法，得到的水凝胶兼具有可控的力学性能及良好的生物相容性，具有促进血管化的作用，在再生医学及临床治疗中应用前景良好，具体包括以下步骤：（1）将碳酸钠加入得到去离子水中，把碳酸钠水溶液稀释调节至ph为 7-10，按50~200g/l的比例将明胶加入碳酸钠溶液中，于35-60
°
c下搅拌溶解，然后加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为1-3:1，反应完成后用去离子水在常温下透析，透析结束后，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸酰化明胶，反应化学式如下：
（2）按50~200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶溶于去离子水中，然后加入丁二酸酐，丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为1-3:1，在25-55℃下搅拌反应24；反应完成后，用去离子水在常温下透析，透析结束后，冷冻干燥后得到得到甲基丙烯酸酰化明胶-cooh，反应化学式如下：（3）按50~200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于pbs溶液中，然后按0.1~0.5g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和0.1~0.5g/l比例的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的混合物，活化反应0.5-4h，按0.1~0.5g/l的比例加入血管内皮生长因子，活化的材料混合搅拌6-24小时，去离子水在常温下透析，透析结束后，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子，反应化学式如下：
（4）在避光条件下，按0.25~3g/100ml的比例取苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)，与超纯水混合于35-50℃下磁力搅拌1~8小时配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)溶液，按50~200g/l的比例将步骤（3）制备的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子溶于基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)溶液中，于50℃下磁力搅拌1~8小时，搅拌均匀制成溶液a；在室温下，按5~20g/l的比例取海藻酸钠粉末搅拌溶解于去离子水中，制成溶液b。
5.（5）按溶液a与溶液b体积比为1:0.5-1:2的比例将溶液a与溶液b混合后加入到注射器中，采用质量百分比浓度为1%-5%的可溶性钙盐水溶液作为接收溶液，在无菌的环境下，基于静电纺丝技术使注射器中溶液a与溶液b的混合液向接收溶液中射出，用光灯照射制备好的微球，照射时间10-90s，得到双交联的促血管生成的多肽天然高分子水凝胶微球。
6.（6）将含有水凝胶微球的接收液倒入45-100um的细胞筛网进行过滤，分离得到水凝胶微球；接着，再用无菌的pbs水溶液进行清洗，并进行常温干燥，以去除所述微球表面残留的钙离子，从而得到清洗后的水凝胶微球，即最终可用微球。
7.优选的，本发明步骤（1）~（3）所述透析的条件为：透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda。
8.优选的，本发明步骤（1）~（3）所述冷冻干燥的条件为：-80℃。
9.优选的，本发明所述1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1-1:3。
10.优选的，本发明所述静电纺丝的条件为：所采用的正电压为15-30kv，负电压为0。
11.优选的，本发明所述可溶性钙盐为氯化钙、碳酸氢钙和乙酸钙中的至少一种。
12.本发明的有益效果：（1）本发明所述方法制备的微球可用作支架，提供细胞三维培养的微环境，与外界进行物质交换，使细胞在体外培养增殖；在移入动物体内后，还能促进不同器官组织的再生，它是无细胞毒性，与生物体相容，可释放细胞因子，形成类器官。
13.（2）本发明所述微球也可以包裹不同种类细胞、细胞因子、蛋白质、外泌体等。它在动物体内是缓慢降解的，随着动物体内各种活性酶的作用，降解后的产物可被动物自身作为营养物质吸收消化，无生物毒性。所述微球还具有亲水性和细胞相容性，可渗透营养物质，柔软且富有弹性，使得微球适应流体条件，而不会引起显着的摩擦力或机械刺激。
14.（3）本发明所述方法以明胶为原料，利用甲基丙烯酸酐对明胶的氨基进行改性引入光交联，采用edc、nhs将甲基丙烯酸酰化明胶的羧基活化，并使多肽的n端和活化位置结合。本发明采用光交联，对天然高分子水凝胶产生光联网络，避免了合成高分子、有毒交联剂的使用，得到的高强度甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子水凝胶。水凝胶兼具优异的可调控力学性能及生物相容性，为制备高强度蛋白质基水凝胶提供一种新的思路及方法，有助于蛋白质基水凝胶材料的开发利用，以便其应用在生物材料、组织工程等领域。
15.（4）本发明所用水凝胶粉为固体，可以长期存放，所占体积小，方便大规模生产和投入市场使用，也可以采用环氧乙烷或辐照灭菌，对生产制备的环境要求低，操作简便，成本低廉，制备得到的光固化凝胶具有良好的光响应性、生物相容性，在体内可降解，具有促进血管化的作用，工业应用前景良好。
附图说明
16.图1为微球示意图；图2为鸡胚的发育情况；图3为包裹细胞微球。
具体实施方式
17.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于所述内容。
18.实施例1一种可促进血管生成的光固化水凝胶微球的制备方法，具体包括以下步骤：（1）将碳酸钠加入得到去离子水中，稀释调节至ph为 7.4，按100g/l的比例将明胶加入碳酸钠溶液中，于50
°
c下搅拌溶解，然后加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为2:1，反应完成后用去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结束后，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸酰化明胶。
19.（2）按100g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶溶于去离子水中，然后加入丁二酸酐，丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为1:1.6，在50℃下搅拌反应24 h；反应完成后，用去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结束后，冷冻干燥后得到得到甲基丙烯酸酰化明胶-cooh。
20.（3）按100g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于pbs溶液中，然后按0.13g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和0.13g/l比例的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的混合物，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:1，活化反应0.5h，按0.5g/l的比例加入血管内皮生长因子，活化的材料混合搅拌8小时，去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结束后，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子。
21.（4）在避光条件下，按1.5g/100ml的比例取苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)，与超纯水混合于50℃下磁力搅拌6小时配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)溶液，按100g/l的比例将步骤（3）制备的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子溶于基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)溶液中，于50℃下磁力搅拌6小时，搅拌均匀制成
溶液a；在室温下，按10g/l的比例取海藻酸钠粉末搅拌溶解于去离子水中，制成溶液b。
22.（5）按溶液a与溶液b体积比为1:1的比例将溶液a与溶液b混合后加入到10ml注射器中，采用质量百分比浓度为3%的cacl2水溶液作为接收溶液，在无菌的环境下，基于静电纺丝技术使注射器中溶液a与溶液b的混合液向接收溶液中射出，用405um蓝光灯照射制备好的微球，照射时间30s，得到双交联的促血管生成的多肽天然高分子水凝胶微球。所述静电纺丝的条件为：所采用的正电压为15kv，负电压为0。
23.（6）将含有水凝胶微球的接收液倒入45-100um的细胞筛网进行过滤，分离得到水凝胶微球；接着，再用无菌的pbs水溶液进行清洗，并进行常温干燥，以去除所述微球表面残留的钙离子，从而得到清洗后的水凝胶微球，即最终可用微球（如图1）。
24.验证实验：第一步：0日龄受精鸡胚于培养箱温度37．5℃、湿度60%的环境中，进行孵育每日观察现象。
25.第一天：照蛋时可以发现蛋黄表面有一颗颜色稍深、四周稍亮的圆点。
26.第二天：可以看到卵黄囊血管区，其形状很像樱桃形。
27.第三天：卵黄囊血管的形状像静止的蚊子，卵黄颜色稍深的下部像月牙。
28.第四天：蛋转动时，卵黄不易跟随着转动，胚胎和卵黄囊血管形状像一只小蜘蛛。
29.第五天：明显看到黑色的眼点。
30.第六天：胚胎形似“电话筒”，一端是头部，另一端为弯曲增大的躯干部，可以看到羊水。
31.第七天：羊水增多，胚胎活动尚不强，正面已布满扩大的卵黄和血管。
32.第八天：胚胎较易看到，像在羊水中浮游一样，卵黄已扩大到背面，蛋转动时两边卵黄不易晃动。
33.第九天：蛋转动时，两边卵黄容易晃动，接着背面尿囊血管迅速伸展出卵黄。
34.通过观察鸡胚的发育情况，至9日龄时，开始下一步操作。
35.第二步：在无菌条件下用牙科锯齿弯镊剥去己标记气室位置的蛋壳部分，取大约1毫升的生理盐水润湿白色蛋膜，用镊子把蛋膜去除，暴露出尿囊膜；放入特氟龙环，将甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子溶液滴加于特氟龙环内的尿囊膜表面，观察cam反映情况。当材料置于正在发育的尿囊膜表面，刺激24-48h。
36.如图2所示材料周围的血管像一个车轮呈放射状，血管密度增加，证明材料有材料有促血管生成的功能。
37.实施例2一种可促进血管生成的光固化水凝胶微球的制备方法，具体包括以下步骤：（1）将碳酸钠加入得到去离子水中，稀释调节至ph为 8，按50g/l的比例将明胶加入碳酸钠溶液中，于35
°
c下搅拌溶解，然后加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为1:1，反应完成后用去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结束后，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸酰化明胶。
38.（2）按50g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶溶于去离子水中，然后加入丁二酸酐，丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为1:1，在25℃下搅拌反应24 h；反应完成后，用去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结
束后，冷冻干燥后得到得到甲基丙烯酸酰化明胶-cooh。
39.（3）按50g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于pbs溶液中，然后按0.1g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和0.3g/l比例的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的混合物，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为1:3，活化反应0.2h，按0.1g/l的比例加入血管内皮生长因子，活化的材料混合搅拌6小时，去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结束后，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子。
40.（4）在避光条件下，按0.25g/100ml的比例取苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)，与超纯水混合于35℃下磁力搅拌8小时配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)溶液，按50g/l的比例将步骤（3）制备的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子溶于基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)溶液中，于50℃下磁力搅拌2小时，搅拌均匀制成溶液a；在室温下，按5g/l的比例取海藻酸钠粉末搅拌溶解于去离子水中，制成溶液b。
41.（5）按溶液a与溶液b体积比为1:0.5的比例将溶液a与溶液b混合后加入到10ml注射器中，采用质量百分比浓度为1%的碳酸氢钙水溶液作为接收溶液，在无菌的环境下，基于静电纺丝技术使注射器中溶液a与溶液b的混合液向接收溶液中射出，用405um蓝光灯照射制备好的微球，照射时间10s，得到双交联的促血管生成的多肽天然高分子水凝胶微球。所述静电纺丝的条件为：所采用的正电压为30kv，负电压为0。
42.（6）将含有水凝胶微球的接收液倒入45-100um的细胞筛网进行过滤，分离得到水凝胶微球；接着，再用无菌的pbs水溶液进行清洗，并进行常温干燥，以去除所述微球表面残留的钙离子，从而得到清洗后的水凝胶微球，即最终可用微球。
43.双交联的促血管生成多肽天然高分子水凝胶微球混合脐带间充质干细胞悬浮液培养，由图3a、3b可知，脐带间充质干细胞在水凝胶微球刺激下生长情况良好。
44.实施例3一种可促进血管生成的光固化水凝胶微球的制备方法，具体包括以下步骤：（1）将碳酸钠加入得到去离子水中，稀释调节至ph为 10，按200g/l的比例将明胶加入碳酸钠溶液中，于60
°
c下搅拌溶解，然后加入甲基丙烯酸酐，甲基丙烯酸酐与明胶体积质量比为3:1，反应完成后用去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结束后，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸酰化明胶。
45.（2）按200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶溶于去离子水中，然后加入丁二酸酐，丁二酸酐与甲基丙烯酸酰化明胶的体积质量比为1:3，在55℃下搅拌反应24 h；反应完成后，用去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结束后，冷冻干燥后得到得到甲基丙烯酸酰化明胶-cooh。
46.（3）按200g/l的比例将甲基丙烯酸酰化明胶-cooh溶于pbs溶液中，然后按0.5g/l的比例加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺（edc）和0.25g/l比例的n-羟基琥珀酰亚胺（nhs）的混合物，1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺与n-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2:1，活化反应4h，按0.3g/l的比例加入血管内皮生长因子，活化的材料混合搅拌24小时，去离子水在常温下透析5d，每12h换一次水，透析袋截留分子量为8kda-14kda，透析结束后，冷冻干燥后得到甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子。
47.（4）在避光条件下，按3g/100ml的比例取苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂
(lap)，与超纯水混合于40℃下磁力搅拌1小时配置成苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)溶液，按200g/l的比例将步骤（3）制备的甲基丙烯酸酰化明胶-血管内皮生长因子溶于基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)溶液中，于50℃下磁力搅拌8小时，搅拌均匀制成溶液a；在室温下，按20g/l的比例取海藻酸钠粉末搅拌溶解于去离子水中，制成溶液b。
48.（5）按溶液a与溶液b体积比为1:2的比例将溶液a与溶液b混合后加入到10ml注射器中，采用质量百分比浓度为5%的乙酸钙水溶液作为接收溶液，在无菌的环境下，基于静电纺丝技术使注射器中溶液a与溶液b的混合液向接收溶液中射出，用405um蓝光灯照射制备好的微球，照射时间90s，得到双交联的促血管生成的多肽天然高分子水凝胶微球。所述静电纺丝的条件为：所采用的正电压为15kv，负电压为0。
49.（6）将含有水凝胶微球的接收液倒入45-100um的细胞筛网进行过滤，分离得到水凝胶微球；接着，再用无菌的pbs水溶液进行清洗，并进行常温干燥，以去除所述微球表面残留的钙离子，从而得到清洗后的水凝胶微球，即最终可用微球。
50.双交联的促血管生成多肽天然高分子水凝胶微球混合脐带间充质干细胞悬浮液培养，脐带间充质干细胞在水凝胶微球刺激下生长情况良好。