一种双歧杆菌的培养基及其培养方法与应用与流程

1.本发明属于微生物培养技术领域，涉及一种双歧杆菌的培养基及其培养方法与应用。


背景技术：

2.双歧杆菌最早由henry tissier于1899年从母乳喂养的婴儿粪便中分离得到，其是一种能对机体有益的生理性细菌，具有营养和保健功能，其作为人体肠道内重要的生理性细菌，其存在和数量是人体健康的一个重要标志。
3.双歧杆菌可以给宿主肠道提供多种营养成分，包括乳酸、乙酸、维生素和蛋白酶等，可以改善机体ph值，促进机体对磷、铁、钙等金属离子、维生素和蛋白质的吸收；双歧杆菌可以和病原菌争夺营养物质和空间位置，还可以通过其代谢产物以及产生抗生素、细菌素等阻止病原体的生长；双歧杆菌具有免疫调节的功能，可以通过刺激和激活免疫系统，使其产生抗体、细胞因子，进而更好地提高人体免疫、抗感染能力；双歧杆菌能明显增加血液中过氧化物歧化酶的含量及其生物活性，有效促进机体内自由基的清除，将体内有害物质毒性降低90％，抑制血浆脂质过氧化反应，具有抗机体衰老的功效。
4.新生儿出生后数小时，双歧杆菌便可以在肠道中定植，然而，由于年龄增长、抗生素的使用、环境因素等原因，双歧杆菌在人体肠道内的数量逐渐下降，从而造成肠道内微生物生态平衡，导致各种疾病或衰老的发生。因此，双歧杆菌常作为活菌制剂的核心成分，广泛用于医疗、保健的市场中。近年来，人们对双歧杆菌的作用有了深层次的研究，发现其具有促进紫外线照射后的dna修复功能，可以对抗紫外线引起的光老化，具有修复皮肤屏障、保护肌肤的功能，因此其在化妆品等日用化工市场也大放异彩，市场对双歧杆菌的需求量进一步上升。
5.然而双歧杆菌属于专性厌氧菌，对氧十分敏感，对低ph耐性差，极易失活，加上它的生存期较短，种子难以保存，这些严格的培养条件限制了双歧杆菌的培养与放大，给工业化生产双歧杆菌带来很大的困难，为此广大研究人员开发了多种双歧杆菌的培养方法。
6.例如cn108085264a公开了一种改良的双歧杆菌番茄培养基及其制备方法。其中，每升双歧杆菌番茄培养液中含有以下组分：糖蜜9-10g、玉米粉89g、异麦芽寡糖1.00-1.50ml磷酸氢二.钾0.4-0.6g、硫酸锰0.005 0.007g、番茄汁基础培养基1l。该改良的双歧杆菌番茄培养基具有培养时间短、活力好、成本低及制备方法操作简单等优点。
7.cn109112089a公开了一种提高双歧杆菌培养浓度的传代培养方法。该发明发现了双歧杆菌的生长惰性并通过有特点的传代培养方案，通过传代培养活细胞浓度提高了10倍以上，这对于制得高浓度的双歧杆菌发酵剂和益生菌制剂与推广其应用都具有重要的价值，同时对于满足人民对高品质食品需求也具有重要意义，其推广应用将具有良好的社会和经济效益。
8.然而，现有技术中提供的双歧杆菌培养方法仍存在着双歧杆菌生长速度慢，产量低的问题，难以用于工业化生产。因此，如何开发一种可提高双歧杆菌生长速度及产量的双
歧杆菌培养方法成为了本领域技术人员亟待解决的问题。


技术实现要素：

9.针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种歧杆菌的培养基及其培养方法与应用。
10.为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
11.第一方面，本发明提供一种双歧杆菌培养基，所述双歧杆菌培养基包括碳源、氮源、无机盐和益生元；
12.所述益生元包括低聚果糖、低酯果胶和菊粉。
13.本发明创造性地将低聚果糖、低酯果胶和菊粉进行这组合作为益生元组分加入双歧杆菌培养基中，三种组分相互配合，协同增效，在促进双歧杆菌增殖，提高菌体产量方面具有意料不到的协同增效的作用。本发明提供的双歧杆菌培养基对双歧杆菌的促增殖效果与市售培养基相比优势显著，具有重要的应用价值。
14.优选地，所述益生元以重量份数计包括低聚果糖1-5份、低酯果胶1-5份和菊粉1-5份。
15.上述1-5份中的具体数值例如1份、1.2份、1.5份、1.7份、2份、2.2份、2.5份、2.7份、3份、3.2份、3.5份、3.7份、4份、4.2份、4.5份、4.7份、5份等。
16.优选地，所述双歧杆菌培养基以浓度计包括碳源10-15g/l、氮源30-45g/l、无机盐3-5g/l、l-半胱氨酸0.1-1g/l、吐温80 0.1-1g/l和益生元1-5wt％。
17.上述10-15g/l中的具体数值例如10g/l、10.5g/l、11g/l、11.5g/l、12g/l、12.5g/l、13g/l、13.5g/l、14g/l、14.5g/l、15g/l等。
18.上述30-45g/l中的具体数值例如30g/l、31g/l、32g/l、33g/l、34g/l、35g/l、36g/l、37g/l、38g/l、39g/l、40g/l、41g/l、42g/l、43g/l、44g/l、45g/l等。
19.上述3-5g/l中的具体数值例如3g/l、3.2g/l、3.4g/l、3.6g/l、3.8g/l、4g/l、4.2g/l、4.4g/l、4.6g/l、4.8g/l、5g/l等。
20.上述0.1-1g/l中的具体数值例如0.1g/l、0.2g/l、0.3g/l、0.4g/l、0.5g/l、0.6g/l、0.7g/l、0.8g/l、0.9g/l、1g/l等。
21.上述1-5wt％中的具体数值例如1wt％、1.5wt％、2wt％、2.5wt％、3wt％、3.5wt％、4wt％、4.5wt％、5wt％等。
22.优选地，所述碳源包括葡萄糖。
23.优选地，所述氮源包括肝浸粉、植物胨、胰蛋白胨、胰酪蛋白胨或酵母粉中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如肝浸粉和植物胨的组合、植物胨和胰蛋白胨的组合、胰蛋白胨和胰酪蛋白胨的组合等，其他任意的组合方式均可，优选为胰蛋白胨。
24.与其他选择相比，选择胰蛋白胨或胰酪蛋白胨作为氮源时，其促进双歧杆菌增殖的效果更显著，出于降低成本的考虑，本发明优选胰蛋白胨作为氮源。
25.优选地，所述无机盐包括氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸镁或氯化钙中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如、磷酸氢二钾与磷酸二氢钾的组合、硫酸锰与硫酸镁的组合、硫酸镁与氯化钙的组合等，其他任意的组合方
式均可，优选为氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸镁和氯化钙的组合。
26.当培养基配方中同时含有氯化钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸镁和氯化钙时，可为双歧杆菌提供其生长所需的钾、钠、铁、镁、钙、磷、硫等元素，这些元素对维持酶的活性、调节菌体内外的渗透压非常重要，促进了菌体的生长和增殖。
27.优选地，所述无机盐以重量份数计包括氯化钠0.8-1.2份、磷酸氢二钾0.8-1.2份、磷酸二氢钾0.8-1.2份、硫酸亚铁0.008-0.012份、硫酸锰0.002-0.008份、硫酸镁0.2-0.8份和氯化钙0.1-0.2份。
28.上述0.8-1.2份中的具体数值例如0.8份、0.85份、0.9份、0.95份、1.0份、1.05份、1.1份、1.15份、1.2份等。
29.上述0.008-0.012份中的具体数值例如0.008份、0.0085份、0.009份、0.0095份、0.010份、0.0105份、0.011份、0.0115份、0.012份等。
30.上述0.002-0.008份中的具体数值例如0.002份、0.0025份、0.003份、0.0035份、0.004份、0.0045份、0.005份、0.0055份、0.006份、0.0065份、0.007份、0.0075份、0.008份等。
31.上述0.2-0.8份中的具体数值例如0.2份、0.25份、0.3份、0.35份、0.4份、0.45份、0.5份、0.55份、0.6份、0.65份、0.7份、0.75份、0.8份等。
32.上述0.1-0.2份中的具体数值例如0.1份、0.11份、0.12份、0.13份、0.14份、0.15份、0.16份、0.17份、0.18份、0.19份、0.2份等。
33.优选地，所述双歧杆菌培养基的ph值为6.0-7.0，例如6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0等。
34.当培养基的ph在上述范围内时，更利于双歧杆菌的生长和增殖，培养得到的双歧杆菌的产量更高。
35.第二方面，本发明提供一种双歧杆菌的培养方法，所述双歧杆菌的培养方法包括将双歧杆菌接种于如第一方面所述的双歧杆菌培养基中进行培养。
36.优选地，所述培养的温度为35-40℃，所述培养的时间为20-30h。
37.上述35-40℃中的具体数值例如35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃等。
38.上述20-30h中的具体数值例如20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h、30h等。
39.优选地，所述双歧杆菌的接种量为1-3％，例如1％、1.2％、1.4％、1.6％、1.8％、2.0％、2.2％、2.4％、2.6％、2.8％、3.0％等。
40.优选地，所述培养还包括补料，所述补料包括补加碳源。
41.本发明创造性地在在培养过程增加补料工艺，能够显著促进双歧杆菌对培养基中营养成分的充分利用，从而大幅度提高了增菌效果，提高了菌体产量。
42.优选地，所述补料是指在菌体长至对数生长中期或后期时进行。
43.补料的时机对增菌效果有一定的影响，当在对数生长中期或后期进行补料操作时，其增菌效果更好，菌体产量更高。
44.第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的双歧杆菌的培养方法在制备食品、
药品或化妆品中的应用。
45.本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
46.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
47.本发明创造性地将菊粉、低聚果糖与低酯果胶的组合作为益生元成分加入到双歧杆菌的培养基中，三者相互配合，协同增效，增菌效果显著，大大提高了双歧杆菌的产量。另外，氮源的选择对增菌效果有一定的影响，本发明采用胰蛋白作为氮源，其成本较低，且与其他氮源相比具有更好的增菌效果。此外，本发明创造性地在培养过程中增加补料工艺，能够显著促进双歧杆菌对培养基中营养成分的充分利用，从而大幅度提高了增菌效果，提高了菌体产量。此外，补料的时机对增菌效果有一定的影响，优选在对数生长中期或后期进行补料操作。本发明提供的双歧杆菌培养基及培养方法与市售培养基及常规培养方法相比，显著促进了双歧杆菌的增殖，提高了菌体的产量，具有重要的应用价值。
附图说明
48.图1为实施例1、2、3和6的od600的结果对比图，其中，实施例1为ph6.5、实施例2为ph 6.0、实施例3为ph 7.0、实施例6为ph 5.0。
49.图2为不同氮源培养的od600的结果对比图。其中实施例1为胰蛋白胨、实施例7为肝浸粉、实施例8为植物胨、实施例9为酵母粉、实施例10为胰酪蛋白胨。
50.图3为不同益生元培养的od600的结果对比图。其中实施例1为益生元组合、对比例4为低聚果糖、对比例5为低酯果胶、对比例6为菊粉。
具体实施方式
51.为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
52.下述实施例、对比例所涉及的低聚果糖购自郑州万博化工产品有限公司、低酯果胶购自山东百龙创园生物科技有限公司、菊粉购自重庆骄王农业开发有限公司。下述实施例、对比例所涉及的双歧杆菌为婴儿双歧杆菌，购自广东省委生物菌种保藏中心，保藏编号为cicc6069。
53.实施例1
54.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，具体如下：
55.培养基配方为：胰蛋白胨36.0g/l、葡萄糖12.0g/l、氯化钠1.0g/l、磷酸氢二钾1.0g/l、磷酸二氢钾1.0g/l、七水合硫酸亚铁0.01g/l、硫酸锰0.005g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钙0.15g/l、l-半胱氨酸0.5g/l、吐温80 0.5g/l、菊粉1wt％、低聚果糖1wt％、低酯果胶1wt％，溶剂为水。
56.(1)按配方配制培养基，用naoh水溶液调节ph至6.5，121℃高温灭菌20min待用。
57.(2)将双歧杆菌冻存管从-80℃冰箱中取出，冻融后吸取1ml种子液，接种于种子活化培养基(商用mrs培养基，规格027312)中，置于37℃条件下静置培养24h，得活化后的双歧杆菌。
58.(3)将步骤(2)活化好的双歧杆菌以2％的接种量接种于步骤(1)配置好的培养基中，于37℃下培养，当菌体长至对数生长中期时补加50wt％的葡萄糖水溶液，补料速度为50ml/h，补料后进行搅拌(50rpm，每50min搅拌5min)。共培养24h。
59.实施例2
60.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，具体如下：
61.培养基配方为：胰蛋白胨32.0g/l、葡萄糖10.0g/l、氯化钠1.5g/l、磷酸氢二钾1.5g/l、磷酸二氢钾1.5g/l、七水合硫酸亚铁0.02g/l、硫酸锰0.005g/l、硫酸镁0.5g/l、氯化钙0.10g/l、l-半胱氨酸0.8g/l、吐温80 0.2g/l、菊粉2wt％、低聚果糖0.5wt％、低酯果胶1wt％，溶剂为水。
62.(1)按配方配制培养基，用naoh水溶液调节ph至6.0，121℃高温灭菌20min待用。
63.(2)将双歧杆菌冻存管从-80℃冰箱中取出，冻融后吸取1ml种子液，接种于种子活化培养基(商用mrs培养基，规格027312)中，置于37℃条件下静置培养24h，得活化后的双歧杆菌。
64.(3)将步骤(2)活化好的双歧杆菌以2％的接种量接种于步骤(1)配置好的培养基中，于39℃下培养，当菌体长至对数生长中期时补加50wt％的葡萄糖水溶液，补料速度为50ml/h，补料后进行搅拌(50rpm，每50min搅拌5min)。共培养24h。
65.实施例3
66.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，具体如下：
67.培养基配方为：胰蛋白胨42.0g/l、葡萄糖15.0g/l、氯化钠0.8g/l、磷酸氢二钾1.1g/l、磷酸二氢钾1.1g/l、七水合硫酸亚铁0.02g/l、硫酸锰0.008g/l、硫酸镁0.8g/l、氯化钙0.2g/l、l-半胱氨酸0.3g/l、吐温80 0.8g/l、菊粉0.8wt％、低聚果糖1.2wt％、低酯果胶1.2wt％，溶剂为水。
68.(1)按配方配制培养基，用naoh水溶液调节ph至7.0，121℃高温灭菌20min待用。
69.(2)将双歧杆菌冻存管从-80℃冰箱中取出，冻融后吸取1ml种子液，接种于种子活化培养基(商用mrs培养基，规格027312)中，置于37℃条件下静置培养24h，得活化后的双歧杆菌。
70.(3)将步骤(2)活化好的双歧杆菌以2％的接种量接种于步骤(1)配置好的培养基中，于35℃下培养，当菌体长至对数生长后期时补加50wt％的葡萄糖水溶液，补料速度为50ml/h，补料后进行搅拌(50rpm，每50min搅拌5min)。共培养24h。
71.实施例4
72.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将步骤(3)中“当菌体长至对数生长中期时补加50wt％的葡萄糖水溶液”改为“当菌体长至对数生长前期时补加50wt％的葡萄糖水溶液”，其他参照实施例1。
73.实施例5
74.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于步骤(3)不进行补料操作，直接在开始培养时加入与实施例1补料操作中加入量相等的葡萄糖水溶液，其他参照实施例1。
75.实施例6
76.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基的ph
从“6.5”调整为“5.0”，其他组分及含量均不变。
77.其制备方法参照实施例1。
78.实施例7
79.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的氮源“胰蛋白胨”替换为等量的“肝浸粉”，其他参照实施例1。
80.实施例8
81.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的氮源“胰蛋白胨”替换为等量的“植物胨”，其他参照实施例1。
82.实施例9
83.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的氮源“胰蛋白胨”替换为等量的“酵母粉”，其他参照实施例1。
84.实施例10
85.本实施例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的氮源“胰蛋白胨”替换为等量的“胰酪蛋白胨”，其他参照实施例1。
86.对比例1
87.本对比例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的益生元“菊粉1wt％、低聚果糖1wt％、低酯果胶1wt％”替换为“菊粉1.5wt％、低聚果糖1.5wt％”，其他参照实施例1。
88.对比例2
89.本对比例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的益生元“菊粉1wt％、低聚果糖1wt％、低酯果胶1wt％”替换为“菊粉1.5wt％、低酯果胶1.5wt％”，其他参照实施例1。
90.对比例3
91.本对比例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的益生元“菊粉1wt％、低聚果糖1wt％、低酯果胶1wt％”替换为“低聚果糖1.5wt％、低酯果胶1.5wt％”，其他参照实施例1。
92.对比例4
93.本对比例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的益生元“菊粉1wt％、低聚果糖1wt％、低酯果胶1wt％”替换为“低聚果糖3wt％”，其他参照实施例1。
94.对比例5
95.本对比例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的益生元“菊粉1wt％、低聚果糖1wt％、低酯果胶1wt％”替换为“低酯果胶3wt％”，其他参照实施例1。
96.对比例6
97.本对比例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中的益生元“菊粉1wt％、低聚果糖1wt％、低酯果胶1wt％”替换为“菊粉3wt％”，其他参照实施例1。
98.对比例7
99.本对比例提供一种双歧杆菌培养方法，其与实施例1的区别仅在于将培养基中缺少益生元“菊粉、低聚果糖和低酯果胶”，缺少的量用水补足，其他参照实施例1。
100.测试例1
101.受试组别：实施例1-10，对比例1-7。
102.通过测量培养结束后菌液中的od600数值的方式对双歧杆菌的增菌效果进行评判。
103.培养结束后，将菌液15000rpm条件下离心，收集菌体，干燥后称量，得双歧杆菌的产量。
104.各组测试结果如表1所示。
105.为使结果更加直观，将部分数据整理成图。
106.图1为实施例1、2、3和6的od600的结果对比图，其中，实施例1为ph6.5、实施例2为ph 6.0、实施例3为ph 7.0、实施例6为ph 5.0。
107.图2为不同氮源培养的od600的结果对比图。其中实施例1为胰蛋白胨、实施例7为肝浸粉、实施例8为植物胨、实施例9为酵母粉、实施例10为胰酪蛋白胨。
108.图3为不同益生元培养的od600的结果对比图。其中实施例1为益生元组合、对比例4为低聚果糖、对比例5为低酯果胶、对比例6为菊粉。
109.表1
110.[0111][0112]
结果显示：实施例1-3提供的双歧杆菌培养方法能够显著促进双歧杆菌增殖，得到的菌体产量较高。对比例1-7的培养方法的增菌效果及菌体产量相较于实施例1较低，说明在培养基中加入益生元起到了促进双歧杆菌增殖的作用，当采用菊粉、低聚果糖与低酯果胶的组合作为益生元成分时，其增菌效果比采用单一组分或任意两种组分的组合更优，证明了三者在促进双歧杆菌增殖方面的协同增效作用。实施例7-9的培养方法的增菌效果及菌体产量相较于实施例1较低，说明培养基中氮源的选择对双歧杆菌的增殖有一定的影响，与肝浸粉、植物胨和酵母粉相比，本发明选择胰蛋白胨作为氮源，其增菌效果更佳。实施例10的培养方法的增菌效果及菌体产量与实施例1比较接近，说明采用胰酪蛋白胨作为氮源，其增菌效果与胰蛋白胨接近，但出于降低成本的考虑，本发明优选胰蛋白胨作为氮源。实施例6的培养方法的增菌效果及菌体产量相较于实施例1较低，说明培养基的ph对双歧杆菌的生长增殖影响较大，当培养基ph为6.0-7.0时，其增菌效果更好，产量更高。实施例4-5的培养方法的增菌效果及菌体产量相较于实施例1较低，说明在培养过程增加补料工艺，能够显著促进双歧杆菌对培养基中营养成分的充分利用，从而大幅度提高了增菌效果，提高了菌体产量。此外，补料的时机对增菌效果有一定的影响，优选在对数生长中期或后期进行补料操作。本发明提供的采用相应培养方法制得的双歧杆菌可以很好地应用在食品、药品或化妆品中。
[0113]
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种双歧杆菌的培养基及其培养方法与应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
[0114]
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0115]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。