鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株及其制备方法、疫苗

1.本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株及其制备方法、疫苗。


背景技术：

2.鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis,ib)是由鸡传染性支气管炎病毒 (infectious bronchitis,ibv)感染引起的一种严重危害家禽养殖业的高传染性疾病。ibv主要侵害鸡的呼吸系统、泌尿系统和消化系统。可造成雏鸡肾脏病变和输卵管永久性退化，从而导致肉鸡饲料报酬率降低，蛋鸡产蛋率和产蛋质量均下降。ibv属于γ-冠状病毒，1937年beaudette等首次分离到该病毒，命名为 beaudette。ibv是一种单股正链rna病毒，基因组全长约为27.6kb，其5’端和 3’端各有一个非编码区(untranslated region,utr)3’utr后具有polya尾。ibv 至少有10个明显的开放阅读框(orf)，分别编码病毒的结构蛋白和非结构蛋白。现已确定的orf的定位次序是5’1a-1b-s-3a-3b-e-m-5a-5b-n-3’。其5’端2/3 基因组编码具有活性的复制酶，3’端1/3基因组主要编码结构蛋白，包括纤突蛋白(s)、膜蛋白(m)、核衣壳蛋白(n)和小膜蛋白(e)。其中s蛋白构成了ibv的最表层纤状突起，由s1和s2亚基构成，在病毒吸附细胞过程中发挥作用，决定病毒的组织嗜性，但并不是ibv毒力的唯一决定性因素。s蛋白是最重要的保护性抗原蛋白，其作用表现为刺激机体产生中和抗体。ibv的核酸 (全长mrna)具有感染性。在辅助蛋白的协同下能在宿主细胞内有效复制，组装成病毒颗粒。
3.标记疫苗含有特殊的核酸序列，在疫检过程中能通过测序准确区分受检动物所携带的病毒是来自于疫苗接种还是自然感染，从而能更精准地配予相应防控措施。标记疫苗包括基因缺失、基因沉默突变、引入报告基因等。目前报道最多的标记疫苗发明有猪瘟病毒、新城疫和口蹄疫等，其中口蹄疫已有相应的标记疫苗上市应用，但ibv尚未标记疫苗相关报道。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株，其可有效区分受检动物所携带的病毒是来自于疫苗接种还是自然感染，为 ibv标记疫苗提供标记位点参考。
5.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的制备方法。
6.本发明还要解决的技术问题在于，提供一种鸡传染性支气管炎标记疫苗。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其包括：
8.(1)获取ibv-beaudette病毒基因组全长cdna重组质粒；
9.(2)构建a21963g沉默突变和g22170c沉默突变的ibv-beaudette病毒全长cdna重
组质粒；
10.(3)转染细胞，拯救获得的病毒即为鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。
11.作为上述技术方案的改进，步骤(1)中，分别获取pibvcdna-1a质粒、 pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、pibvcdna-4d质粒和pibvcdna-5e 质粒。
12.作为上述技术方案的改进，步骤(2)中，采用核苷酸序列如seq id no.1～10 所示的引物，分别构建pibvcdna-4x质粒、pibvcdna-5y质粒和 pibvcdna-6z质粒，并连接形成a21963g沉默突变和g22170c沉默突变的 ibv-beaudette病毒全长cdna重组质粒。
13.作为上述技术方案的改进，步骤(2)包括：
14.(2.1)采用核苷酸序列如seq id no.1～2所示的引物，以pibccdna-4d 质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pibvcdna-4x质粒；
15.(2.2)采用核苷酸序列如seq id no.3～8所示的引物，以pibvcdna-5e 质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pibvcdna-5y质粒；
16.(2.3)采用核苷酸序列如seq id no.9～10所示的引物，以pibvcdna-5e 质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pibvcdna-6z质粒；
17.(2.4)将pibvcdna-1a质粒、pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、 pibvcdna-4x质粒，pibvcdna-5y质粒和pibvcdna-6z质粒连接，形成 a21963g沉默突变和g22170c沉默突变的ibv-beaudette病毒全长cdna重组质粒。
18.作为上述技术方案的改进，步骤(2.1)和步骤(2.3)中，所述质粒载体为 pclone007 blunt vector；
19.步骤(2.2)中，所述质粒载体为t-vector pmd19。
20.作为上述技术方案的改进，步骤(2.4)中，将pibvcdna-1a质粒、 pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、pibvcdna-4x质粒，pibvcdna-5y 质粒和pibvcdna-6z质粒分别采用bsmbi、bsai、bsai、bsai、bsmbi和bsai 酶切，回收片段后连接，形成a21963g沉默突变和g22170c沉默突变的 ibv-beaudette病毒全长cdna重组质粒。
21.作为上述技术方案的改进，步骤(3)包括：
22.(3.1)将步骤(2.4)所得的连接产物转录；
23.(3.2)采用转录产物转染细胞，拯救获得的病毒即为鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。
24.相应的，本发明还公开了一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株，其由上述的构建方法构建所得。
25.相应的，本发明还公开了一种鸡传染性支气管炎标记疫苗，其包括上述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。
26.实施本发明，具有如下有益效果：
27.本发明构建了a21963g和g22170c双位点沉默点突变的基因标记毒株 ribv-simutδbeaudette，其与wt-beaudette-p65的病毒滴度相差无几，且具有vero 细胞适应性，可为ibv基因标记疫苗的研制提供可行的标记位点参考。
附图说明
28.图1是pibvcdna-4x质粒的结构图谱；
29.图2是ibvcdna-5y质粒的结构图谱；
30.图3是ibvcdna-6z质粒的结构图谱；
31.图4是a21963g沉默突变和g22170c沉默突变的ibv-beaudette病毒全长 cdna克隆的构建策略示意图；
32.图5是a21963g沉默突变和g22170c沉默突变的ibv-beaudette病毒全长 cdna重组质粒的连接效率鉴定结果图，其中，m为dna标记，fl为全长cdna；
33.图6是体外转录产物的鉴定图，其中，m为dna标记，1、2为全长cdna 体外转录产物；
34.图7是ribv-simutδbeaudette毒株的rt-pcr鉴定结果；其中，2k dna maker 为dna标记，negative control为阴性对照，f1、f2为ribv-simutδbeaudette毒株rt-pcr产物；
35.图8是ribv-simutδbeaudette毒株的rt-pcr测序结果；其中，wt-beaudette 为鸡传染性支气管炎病毒母本毒；
36.图9是ribv-simutδbeaudette毒株鸡胚致死率和致侏儒矮化率测试图；
37.图10是不同代ribv-simutδbeaudette毒株的电镜观察图。
具体实施方式
38.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
39.本发明提供了一种鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株的构建方法，其包括以下步骤：
40.(1)获取ibv-beaudette病毒基因组全长cdna重组质粒；
41.具体的，上述重组质粒包括：pibvcdna-1a质粒、pibvcdna-2b质粒、 pibvcdna-3c质粒、pibvcdna-4d质粒和pibvcdna-5e质粒(具体构建方法可参见fang s,bo c,tay f,et al.an arginine-to-proline mutation in a domainwith undefined functions within the helicase protein(nsp13)is lethal to thecoronavirus infectious bronchitis virus in cultured cells[j].virology,2007, 358(1):136-147.)本发明中上述质粒、鸡传染性支气管炎病毒母本毒 wt-beaudette(p65)和vero细胞均由华南农业大学刘定祥教授赠予。
[0042]
(2)构建a21963g沉默突变和g22170c沉默突变的ibv-beaudette病毒全长cdna重组质粒；
[0043]
具体的，步骤(2)包括：
[0044]
(2.1)采用核苷酸序列如seq id no.1～2所示的引物，以pibccdna-4d 质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pibvcdna-4x质粒；
[0045]
参见图1、表1，用ibvcdna-4x-newf(bsai)和ibvcdna-4x-newr(bsai) 引物，以pibvcdna-4d质粒为模板pcr扩增4x片段，纯化回收后的核酸与pclone007 blunt vector(pc007)进行连接获得pibvcdna-4x质粒。
[0046]
表1构建质粒pibvcdna-4x，pibvcdna-5y和pibvcdna-6z的引物序列
[0047][0048]
其中，具体的扩增体系为：
[0049][0050]
扩增程序为：
[0051][0052]
(2.2)采用核苷酸序列如seq id no.3～8所示的引物，以pibvcdna-5e 质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pibvcdna-5y质粒；
[0053]
参表1和图2，用ibvcdna-5y-newf(bsmbi)，ibvcdna-5y-newr(bsmbi)， t601_mlui_mutr，t601_mlui_mutf，t532_mlui_mutf和t532_mlui_mutr引物，以pibvcdna-5e质粒为模板overlop pcr扩增5y，将a21963g和g22170c 双位点沉默突变片段5y通过同源重组克隆到t-vector pmd19，构建 pibvcdna-5y质粒。
[0054]
其中，具体的mlu i del突变overlop扩增体系为：
[0055][0056]
扩增程序为：
[0057][0058]
其中，具体的mlu i add突变overlop扩增体系为：
[0059][0060][0061]
扩增程序为：
[0062][0063]
(2.3)采用核苷酸序列如seq id no.9～10所示的引物，以pibvcdna-5e 质粒为模板扩增，然后与质粒载体连接，即得pibvcdna-6z质粒；
[0064]
参见图3和表1，用ibvcdna-6z-newf(bsai)和ibvcdna-6z-newr(bsai) 引物，以pibvcdna-5e为模板pcr扩增6z片段，纯化回收的核酸与pclone007 blunt vector进行连接构建获pibvcdna-6z质粒。
[0065]
其中，具体的扩增体系为：
[0066][0067]
扩增程序为：
[0068][0069][0070]
(2.4)将pibvcdna-1a质粒、pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、 pibvcdna-4x质粒，pibvcdna-5y质粒和pibvcdna-6z质粒连接，形成 a21963g沉默突变和g22170c沉默突变的ibv-beaudette病毒全长cdna重组质粒。
[0071]
具体的，将pibvcdna-1a质粒、pibvcdna-2b质粒、pibvcdna-3c质粒、pibvcdna-4x质粒，pibvcdna-5y质粒和pibvcdna-6z质粒分别用 bsmbi、bsai、bsai、bsai、bsmbi和bsai酶切(参图4)，回收片段1a、2b、 3c、4x、5y和6z片段用20μl体系的t4 dna连接酶，于37℃水浴连接过夜， 0.4％琼脂糖胶鉴定连接效率，结果如图5所示，其中，m为dna标记，fl为全长cdna；由图中可以看出：连接产物最大条带大于λdna/hindiii maker最大条带23130bp，与
全长cdna fl 28088bp相符。
[0072]
具体的，酶切体系包括：
[0073][0074]
(3)转染细胞，拯救获得的病毒即为鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。
[0075]
具体的，步骤(3)包括：
[0076]
(3.1)将步骤(2.4)所得的连接产物转录；
[0077]
其中，将步骤(2.4)所得的连接产物经3m naac沉淀纯化后，用mmessagemmachine
tm t7 transcription kit并按说明书进行体外转录。取1/10体积转录产物0.8％琼脂糖胶鉴定，结果如图6。从图中可以看出：全长fl cdna成功被转录成mrna。
[0078]
(3.2)采用转录产物转染细胞，拯救获得的病毒即为鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。
[0079]
其中，取转录产物，以110v、25ms参数电转vero细胞，转染后培养即可收获病毒，即为鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株(ribv-simutδbeaudette)。
[0080]
进一步的，在得到鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株，还包括对其进行鉴定，具体包括：
[0081]
(4)ribv-simutδbeaudette的rt-pcr鉴定
[0082]
取ribv-simutδbeaudette毒株，用takara rna提取试剂盒(takara minibest universal rna extraction kit)提取病毒rna。将提取的rna用生工mightyscript 第一链cdna合成master mix，用特异性检测引物进行pcr鉴定，扩增产物并送二代测序，结果显示a21963g和g22170c双位点沉默点突变的基因标记毒株 ribv-simutδbeaudette拯救成功(如图7、图8)
[0083]
其中，rt-pcr引物为：
[0084]
p65-s1(5y-wt)fw：gtggtcgtgttgttaatgctt；
[0085]
p65-s1(5y/5e-wt)rev：agcgaaggacctccatat。
[0086]
(5)eid50和tcid50测定
[0087]
取传代至p3代的细胞毒，测定其eid50和tcid50。结果显示 ribv-simutδbeaudette具有一定的鸡胚致死率和至侏儒矮化率，结果见表2和图 9。经测定该重组的eid50和tcid50略低于wt-beaudette-p65，表明两者的病毒滴度几乎没有差别。
[0088]
表2 ribv-simutδbeaudette和wt-beaudette-p65的eid50和tcid50测定结果
[0089][0090]
(6)电镜检查
[0091]
取电转后的细胞，观察其状态，直至出现细胞融合，收取细胞于-80℃冻融 3次，传代扩大培养，取不同代的毒株，观察细胞是否具有细胞融合现象，结果见图10，从图中看出，ribv-simutδbeaudette毒株具有与母本毒株wt-beaudette 一样的vero适应性。
[0092]
相应的，本发明还公开了一种鸡传染性支气管炎标记疫苗，其包括上述的鸡传染性支气管炎标记疫苗毒株。
[0093]
以上所述的仅为本发明一种较佳实施例而已，不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。