三萜类化合物及其制备方法和应用

1.本发明属于医药技术领域，涉及三萜类化合物及其制备方法和应用，具体涉及从岗梅中得到的三萜类化合物及其制备方法和在制备抗炎药物中的应用。


背景技术：

2.岗梅，别名称星树、土甘草、天星木等，为冬青科植物梅叶冬青(ilex asprella(hook.et arn.)champ.ex benth.)的干燥根及根茎，始载于《生草药性备要》，是中国岭南地区的习用中药。岗梅味苦、性寒，具有清热解毒、生津利咽、散瘀止痛的功效，一般与其它中药配伍使用，是多种市售解热镇痛、除湿导滞类中成药，如感冒灵颗粒、外感颗粒、青梅感冒冲剂、广东凉茶颗粒、沙溪凉茶等的主要处方成分。
3.几十年来，国内外学者对岗梅的化学成分进行了研究，三萜及其苷类为岗梅中最主要的一类成分，此外还有甾体及其苷类、木脂素类、黄酮类等结构类型。现代药理学研究表明，岗梅中的三萜类化合物主要具有抗炎、降脂、抗菌、抗肿瘤等作用。但对于岗梅的抗炎药效物质基础的研究却很少。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的缺陷，本发明以岗梅(ilex asprella(hook.et arn.)champ.ex benth.)为研究对象，对其乙醇提取物进行了分离和纯化，得到了五个新的三萜类化合物，对这些化合物进行了结构鉴定和生物活性研究，发现这些化合物具有很好的抗炎活性，具有潜在的药用价值。
5.本发明通过如下技术方案实现：
6.本发明提供式i-v所示的化合物或其药学上可接受的盐；
[0007][0008]
所述的式i-v的化合物命名分别为ileasposide a、4-methyl-11α,12α-epoxy-2-hydroxy-3,5-dioxoursa-1,4-dine-28-oic acidγ-lactone、4-methyl-11α,12α-epoxy-2-hydroxy-3,5-dioxoursa-1,4,20、(29)-triene-28-oic acidγ-lactone、11α,12α-epoxy-3β-hydroxy-24-norursa-4(23)-en-28,13β-olide。
[0009]
本发明还提供了式i-v的化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：
[0010]
(1)岗梅干燥根，用乙醇提取浓缩，得总浸膏；
[0011]
(2)总浸膏用水混悬后，上大孔树脂吸附柱，用0-95％乙醇梯度洗脱，得ia-a、ia-b、ia-c、ia-d、ia-e五个流分；
[0012]
(3)ia-c和ia-e分别经过硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇体系(100:0-0:100)进行梯度洗脱，分别得到流分ia-c1—ia-c12和ia-ea—ia-en；
[0013]
(4)ia-c9经过ods柱色谱分离，以甲醇-水体系(10％-100％)进行梯度洗脱，得到ia-c1-a—ia-c1-a-i；
[0014]
(5)ia-c9-d和ia-c9-e分别经过硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水体系(9:1:0.1-6:4:0.8)进行梯度洗脱，分别得到ia-c9-d1—ia-c9-d4和ia-c9-e1；
[0015]
(6)ia-c9-d4在甲醇中得到结晶，得到化合物ⅱ；ia-c9-e3进行进一步的制备高效液相(hplc)的分离，得到化合物i；
[0016]
(7)ia-ec进行进一步的sephadex lh-20柱色谱分离纯化，二氯甲烷-甲醇体系(体积比为1:1)进行等度洗脱，得到流分ia-ec-2；
[0017]
(8)ia-ec-2经过硅胶柱色谱分离，以环己烷-丙酮体系(体积比为100:0-0:100)依次进行梯度洗脱，得到ia-ec-21—ia-ec-29；
[0018]
(9)ia-ec-26经过ods柱色谱分离，以甲醇-水体系(体积百分含量为50％，-100％)依次进行梯度洗脱，得到ia-ec-261—ia-ec-265；
[0019]
(10)ia-ec-263进行进一步的制备高效液相(hplc)的分离，得到化合物ⅲ；
[0020]
(11)ia-ec-27经过ods柱色谱分离，以甲醇-水体系(体积百分含量为50％-100％)依次进行梯度洗脱，得到ia-ec-271-ia—ec-275；
[0021]
(12)ia-ec-274进行制备高效液相(hplc)的分离，得到化合物ⅳ和化合物
ⅴ
。
[0022]
其中，步骤(1)中，乙醇的体积浓度为60-90％，采用加热回流提取1-3次，每次1-3小时；
[0023]
步骤(6)中的流动相为10-20％的乙腈-水溶液；
[0024]
步骤(10)中的流动相为60-70％的甲醇-水溶液；
[0025]
步骤(12)中的流动相为60-75％的甲醇-水溶液。
[0026]
本发明提供了一种药物组合物，包含所述的式i-v所示的化合物或其药学上可接受的盐中的一种或几种。
[0027]
本发明提供了一种药物组合物，包含所述的式i-v所示的化合物或其药学上可接受的盐中的一种或几种或药学上可接受的载体或赋形剂。
[0028]
本发明还提供也所述的式i-v所示的化合物或其药学上可接受的盐或其药和组合物在制备预防和/或治疗炎症的药物中的应用。所述的炎症可以为胃炎、肺炎、肝炎、乳腺炎或外伤炎症等。
附图说明：
[0029]
图1为化合物ⅰ和ⅱ对lps诱导inos蛋白和cox-2蛋白表达的影响；
[0030]
其中，lps是指脂多糖；inos是指诱导型一氧化氮合酶；cox-2是指环氧化酶2。
[0031]
图2为化合物ⅰ和ⅱ对lps诱导iκb-α蛋白降解的影响；
[0032]
其中iκb-α是指人核因子κb抑制蛋白α。
[0033]
图3为化合物ⅰ和ⅱ对lps诱导erk1/2、jnk、p38蛋白磷酸化的影响。
具体实施方式：
[0034]
其中erk1/2是指细胞外调节蛋白激酶；jnk是指应激活化蛋白激酶；p38是指丝裂原活化蛋白激酶。
[0035]
实施例1制备岗梅的乙醇提取物
[0036]
岗梅干燥根18.9kg，用10倍量60％乙醇加热回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压回收溶剂，浓缩后得总浸膏2.56kg。取其中1.2kg提取物浸膏，用5倍量水(6l)混悬，然后经d101大孔吸附树脂柱色谱分离，乙醇-水梯度洗脱，得到水洗脱部位(ia-a，508.0g)、30％乙醇洗脱部位(ia-b，73.0g)、50％乙醇洗脱部位(ia-c，123.7g)、70％乙醇洗脱部位(ia-d，260.6g)和95％乙醇洗脱部位(ia-e，85.1g)五个流份。
[0037]
实施例2化合物的制备方法
[0038]
岗梅乙醇提取物的50％乙醇洗脱部位(ia-c)经过硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇体系(二氯甲烷-甲醇的体积比为100:0，99:1，98:2，97:3，95:5，93:7，9:1，8:2，7:3，6:4，1:1，0:100)依次进行梯度洗脱，每个体系洗4个保留体积，每个体积1000ml。根据薄层层析色谱行为分析，在二氯甲烷-甲醇(体积比100:0和99:1)得到流分ia-c1；在二氯甲烷-甲醇(体积比99:1)得到流分ia-c2；在二氯甲烷-甲醇(体积比98:2)得到流分ia-c3；在二氯甲
烷-甲醇(体积比97:3)得到流分ia-c4；在二氯甲烷-甲醇(体积比95:5)得到流分ia-c5；在二氯甲烷-甲醇(体积比93:7)得到流分ia-c6；在二氯甲烷-甲醇(体积比9:1)得到流分ia-c7；在二氯甲烷-甲醇(体积比8:2)得到流分ia-c8；在二氯甲烷-甲醇(体积比7:3)得到流分ia-c9；在二氯甲烷-甲醇(体积比6:4)得到流分ia-c10；在二氯甲烷-甲醇(体积比1:1)得到流分ia-c11；在二氯甲烷-甲醇(体积比0:100)得到流分ia-c12。共得到12个流分，将各流分冷冻干燥。
[0039]
ia-c9(38.0g)经过ods柱色谱分离，以甲醇-水体系(甲醇-水的体积百分含量为10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，100％)依次进行梯度洗脱，每个体系洗4个保留体积，每个体积300ml。根据薄层层析色谱显色行为分析，在体积百分含量为10％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-a；在体积百分含量为20％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-b；在体积百分含量为30％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-c；在体积百分含量为40％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-d；在体积百分含量为50％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-e；在体积百分含量为60％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-f；在体积百分含量为70％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-g；在体积百分含量为80％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-h；在体积百分含量为100％的甲醇-水溶液中得到流分ia-c9-i。共得到9个流分，将各流分冷冻干燥。
[0040]
ia-c9-d(825.9mg)经过硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水体系(二氯甲烷-甲醇-水的体积比为9:1:0.1，8:2:0.2，7:3:0.5，6:4:0.8)依次进行梯度洗脱，每个体系洗4个保留体积，每个体积1000ml。根据薄层层析色谱行为分析，在二氯甲烷-甲醇-水(体积比9:1:0.1)得到流分ia-c9-d1；在二氯甲烷-甲醇(体积比8:2:0.2)得到流分ia-c9-d2；在二氯甲烷-甲醇(体积比7:3:0.5)得到流分ia-c9-d3；在二氯甲烷-甲醇(体积比6:4:0.8)得到流分ia-c9-d4。共得到4个流分，将各流分冷冻干燥。
[0041]
ia-c9-d4(281.5mg)在甲醇中得到结晶，为化合物ⅱ(178.3mg)。
[0042]
ia-c9-e(4.7g)经过硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇-水体系(二氯甲烷-甲醇-水的体积比为9:1:0.1，8:2:0.2，7:3:0.5，6:4:0.8)依次进行梯度洗脱，每个体系洗4个保留体积，每个体积1000ml。根据薄层层析色谱行为分析，在二氯甲烷-甲醇-水(体积比9:1:0.1)得到流分ia-c9-e1；在二氯甲烷-甲醇(体积比8:2:0.2)得到流分ia-c9-e2；在二氯甲烷-甲醇(体积比7:3:0.5)得到流分ia-c9-e3；在二氯甲烷-甲醇(体积比6:4:0.8)得到流分ia-c9-e4。共得到4个流分，将各流分冷冻干燥。
[0043]
ia-c9-e3(2.8g)进行进一步的制备高效液相(hplc)的分离，以示差检测器为检测手段，以体积百分含量为19％的乙腈-水溶液为洗脱剂进行hplc制备，流速为4ml/min，收集28min的色谱峰，得到化合物ⅰ(226.6mg)。
[0044]
岗梅乙醇提取物的95％乙醇洗脱部位(ia-e)经过硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇体系(二氯甲烷-甲醇的体积比为100:0，99:1，98:2，97:3，95:5，93:7，9:1，8:2，7:3，6:4，1:1，0:100)依次进行梯度洗脱，每个体系洗4个保留体积，每个体积1000ml。根据薄层层析色谱行为分析，在二氯甲烷-甲醇(体积比100:0)得到流分ia-ea、ia-eb和ia-ec；在二氯甲烷-甲醇(体积比99:1)得到流分ia-ed；在二氯甲烷-甲醇(体积比98:2)得到流分ia-ee；在二氯甲烷-甲醇(体积比97:3)得到流分ia-ef；在二氯甲烷-甲醇(体积比95:5)得到流分ia-eg；在二氯甲烷-甲醇(体积比93:7)得到流分ia-eh；在二氯甲烷-甲醇(体积比9:1)得到
流分ia-ei；在二氯甲烷-甲醇(体积比8:2)得到流分ia-ej；在二氯甲烷-甲醇(体积比7:3)得到流分ia-ek；在二氯甲烷-甲醇(体积比6:4)得到流分ia-el；在二氯甲烷-甲醇(体积比1:1)得到流分ia-em；在二氯甲烷-甲醇(体积比0:100)得到流分ia-en。共得到14个流分，将各流分冷冻干燥。
[0045]
ia-ec(3.8g)进行进一步的sephadex lh-20柱色谱分离纯化，二氯甲烷-甲醇体系(体积比为1:1)进行等度洗脱，得到流分ia-ec-2，并将该流分冷冻干燥。
[0046]
ia-ec-2(2.9g)经过硅胶柱色谱分离，以环己烷-丙酮体系(环己烷-丙酮的体积比为100:0，99:1，98:2，97:3，95:5，93:7，9:1，8:2，7:3，6:4，1:1，0:100)依次进行梯度洗脱，每个体系洗4个保留体积，每个体积1000ml。根据薄层层析色谱行为分析，在环己烷-丙酮(体积比100:0)得到流分ia-ec-21；在环己烷-丙酮(体积比99:1)得到流分ia-ec-22；在环己烷-丙酮(体积比98：2和97：3)得到流分ia-ec-23；在环己烷-丙酮(体积比95:5和93:7)得到流分ia-ec-24；在环己烷-丙酮(体积比9:1)得到流分ia-ec-25；在环己烷-丙酮(体积比8:2)得到流分ia-ec-26；在环己烷-丙酮(体积比7:3)得到流分ia-ec-27；在环己烷-丙酮(体积比6:4)得到流分ia-ec-28；在环己烷-丙酮(体积比1:1)得到流分ia-ec-29。共得到9个流分，将各流分冷冻干燥。
[0047]
ia-ec-26(773.2mg)经过ods柱色谱分离，以甲醇-水体系(甲醇-水的体积百分含量为50％，60％，70％，80％，100％)依次进行梯度洗脱，每个体系洗4个保留体积，每个体积300ml。根据薄层层析色谱显色行为分析，在体积百分含量为50％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-261；在体积百分含量为60％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-262；在体积百分含量为70％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-263；在体积百分含量为80％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-264；在体积百分含量为100％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-265。共得到5个流分，将各流分冷冻干燥。
[0048]
ia-ec-263(82.7mg)进行进一步的制备高效液相(hplc)的分离，以示差检测器为检测手段，以体积百分含量为70％的甲醇-水溶液为洗脱剂进行hplc制备，流速为4ml/min，收集35min的色谱峰，得到化合物ⅲ(32.2mg)。
[0049]
ia-ec-27(657.8mg)经过ods柱色谱分离，以甲醇-水体系(甲醇-水的体积百分含量为50％，60％，70％，80％，100％)依次进行梯度洗脱，每个体系洗4个保留体积，每个体积300ml。根据薄层层析色谱显色行为分析，在体积百分含量为50％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-271；在体积百分含量为60％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-272；在体积百分含量为70％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-273；在体积百分含量为80％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-274；在体积百分含量为100％的甲醇-水溶液中得到流分ia-ec-275。共得到5个流分，将各流分冷冻干燥。
[0050]
ia-ec-274(128.1mg)进行进一步的制备高效液相(hplc)的分离，以示差检测器为检测手段，以体积百分含量为75％的甲醇-水溶液为洗脱剂进行hplc制备，流速为4ml/min，收集14和32min的色谱峰，得到化合物ⅳ(45.6mg)和化合物
ⅴ
(30.2mg)。
[0051]
实施例3化合物的结构鉴定
[0052]
化合物ⅰ和ⅱ的氢谱(1h-nmr)和碳谱(
13
c-nmr)的核磁数据如表1所示：
[0053]
表1化合物ⅰ和ⅱ的1h-nmr和
13
c-nmr的核磁数据(pyridine-d5)
[0054]
[0055]
[0056][0057]
化合物ⅲ、ⅳ和
ⅴ
的氢谱(1h-nmr)和碳谱(
13
c-nmr)的核磁数据如表2所示：
[0058]
表2化合物ⅲ、ⅳ和
ⅴ
的1h-nmr和
13
c-nmr的核磁数据(cdcl3)
[0059]
[0060][0061]
m代表多重峰或与其他信号重叠。
[0062]
本发明中式ⅰ所示化合物、式ⅱ所示化合物、式ⅲ所示化合物、式ⅳ所示化合物、式
ⅴ
所示化合物的理化性质如下：
[0063]
化合物ⅰ(ileasposide a)
[0064]
白色粉末，liebermann-burchard反应呈阳性，molish反应呈阳性。分子式c
41h65o16
sna。esi-ms给出m/z 869[m h]

,m/z 891[m na]

,m/z 845[m-na]-；hr-esi-ms给出m/z 845.3983[m-na]-(c
41h65o16
s，计算值为845.3993)。
[0065]
化合物ⅱ(ileasposide b)
[0066]
白色粉末，liebermann-burchard反应呈阳性，molish反应呈阳性。分子式c
41h65o16
sna。esi-ms给出m/z 869[m h]

,m/z 891[m na]

,m/z 845[m-na]-；hr-esi-ms给出m/z 845.3946[m-na]-(c
41h65o16
s，计算值为845.3993)。
[0067]
化合物ⅲ4-methyl-11α,12α-epoxy-2-hydroxy-3,5-dioxoursa-1,4-dine-28-oic acidγ-lactone
[0068]
白色粉末。esi-ms(negative)给出m/z 479.3[m-h]-，hr-esi-ms给出m/z481.2594[m h]

(c
29h37
o6，计算值为481.2590)，从而确定该化合物分子式为c
29h36
o6。
[0069]
化合物ⅳ4-methyl-11α,12α-epoxy-2-hydroxy-3,5-dioxoursa-1,4,20(29)-triene-28-oic acidγ-lactone
[0070]
白色粉末。esi-ms(negative)给出m/z 476.9[m-h]-，推测该化合物的分子量为478。
[0071]
化合物
ⅴ
11α,12α-epoxy-3β-hydroxy-24-norursa-4(23)-en-28,13β-olide
[0072]
白色粉末。esi-ms(negative)给出m/z 455.0[m h]

，hr-esi-ms给出m/z 477.2971[m na]

(c
29h42
nao4，计算值为477.2981)，从而确定该化合物分子式为c
29h42
o4。
[0073]
实施例4化合物的抗炎活性
[0074]
测试用细胞：小鼠单核巨噬细胞raw 264.7购自中国科学院上海细胞库，用含有10％胎牛血清的rpmi 1640培养液在37℃、5％co2培养箱中培养，当培养皿内的细胞面积达到培养皿的70％-80％时，进行传代，具体操作如下：首先，将培养皿中的细胞全部收集到50ml无菌离心管中，然后放入低温离心机(4℃)中以1000rpm离心3min。离心完成后去上清，加入新的rpmi-1640培养液轻轻吹打底部细胞，使之形成均匀细胞液后，再分别转入新的培
养皿中，放入培养箱继续进行培养。实验时取对数生长期的细胞即可。
[0075]
被测样品溶液：实施例2中制备得到的化合物ⅰ和ⅱ，分别用细胞培养级dmso溶解，配制成浓度为50mm的储存原液，放置于-25℃冰箱中保存备用，使用前用细胞培养级dmso将储存原液进行稀释至所使用浓度。
[0076]
细胞毒性评价：在上述培养板每孔中加入mtt溶液(终浓度200μg/ml)，置于5％二氧化碳培养箱中继续培养4h后，弃去上清，吸干残留液体，加入dmso150μl，振摇10min使生成的甲瓒结晶充分溶解后，以630nm为参比波长在570nm下测定吸光值。
[0077][0078]
pge2释放量的测定：用rpmi 1640培养液将小鼠巨噬细胞raw 264.7稀释至5
×
105cells/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔加入200μl细胞悬浮液。co2培养箱中培养1h后，每孔加入lps(终浓度1μg/ml)和不同浓度的测试样品，同时设lps组(不加入被测试样品)和空白对照组(等体积dmso)，每个样品4个平行孔。在37℃、co2恒温培养箱中培养24h后吸取培养液上清100μl，按照试剂盒说明书进行测定。pge2抑制率越高，表明化合物的抗炎活性越强。
[0079]
化合物的细胞毒性：
[0080]
表3化合物对raw 264.7的细胞生存率
[0081][0082]
对脂多糖诱导raw 264.7细胞释放pge2的抑制活性
[0083]
表4对raw 264.7细胞释放pge2的抑制活性
[0084][0085]
考察了化合物ⅰ和ⅱ对脂多糖诱导raw264.7细胞释放pge2的抑制活性，选择氢化可的松(hydrocortisone)作为阳性药。测试结果显示，化合物ⅰ和ⅱ显示出明显强于阳性药hydrocortisone的活性，且不具有毒性。
[0086]
实施例5化合物的抗炎机制
[0087]
蛋白抽提用于测定inos和cox-2：取对数生长期的小鼠巨噬细胞raw264.7，稀释成含1
×
106个/ml的单细胞悬液，然后接种于60mm
×
15mm规格的培养皿中，置于37℃培养箱中培养1h。待细胞贴壁后，将细胞分为三组，即空白组、lps组、给药组。lps组加入1g/ml lps，给药组分别加入不同浓度的ia-c9e6-4和ia-c9d4a(终浓度分别为12.5、25、50、100μm)和1g/ml lps。培养24h后，分别弃去各组细胞的上清液，用pbs终止反应并洗涤细胞，再加入1ml pbs，用细胞刮刀收集细胞于1.5ml离心管中。13000r/min离心6min，尽量吸去上清液后加入含1％pmsf的pbs 60μl，采用超声破碎机将离心管置于冰水浴中进行细胞破碎。13000r/min离心，离心6min后，吸出上清液至0.5ml离心管中，蛋白浓度通过bradford法用试剂盒测定。按4:1比例向0.5ml离心管中加入5
×
蛋白上样缓冲液，放置沸水浴中5min进行蛋白变性，放于-20℃冰箱保存备用。
[0088]
蛋白抽提用于测定iκb-α：取对数生长期的小鼠巨噬细胞raw 264.7，稀释成含1
×
106个/ml的单细胞悬液，然后接种于60mm
×
15mm规格的培养皿中，置于37℃培养箱中培养24h。24h后将细胞分为三组，即空白组、lps组、给药组。给药组分别加入不同浓度的ia-c9e6-4和ia-c9d4a(终浓度分别为12.5、25、50、100μm)，继续培养1h后，给药组和lps组加入1g/ml lps作用10min。分别弃去各组细胞的上清液，加入1ml pbs终止反应并洗涤细胞，再加入1ml pbs，用细胞刮刀收集细胞于1.5ml离心管中；13000r/min离心6min，尽量吸去上清液后加入含1％pmsf的pbs 60μl，采用超声破碎机将离心管置于冰水浴中进行细胞破碎。13000r/min离心，离心6min后，吸出上清液至0.5ml离心管中，蛋白浓度通过bradford法用试剂盒测定。按4:1比例向0.5ml离心管中加入5
×
蛋白上样缓冲液，放置沸水浴中5min进行蛋白变性，放于-20℃冰箱保存备用。
[0089]
蛋白抽提用于测定erk和p-erk：取对数生长期的小鼠巨噬细胞raw264.7，稀释成含1
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106个/ml的单细胞悬液，然后接种于60mm
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15mm规格的培养皿中，置于37℃培养箱中培养24h。24h后将细胞分为三组，即空白组、lps组、给药组。给药组分别加入不同浓度的ia-c9e6-4和ia-c9d4a(终浓度分别为12.5、25、50、100μm)，继续培养1h后，给药组和lps组加入1g/ml lps作用1h。分别弃去各组细胞的上清液，加入1ml pbs终止反应并洗涤细胞，再加入1ml pbs，用细胞刮刀收集细胞于1.5ml离心管中；13000r/min离心6min，尽量吸去上清液后加入含1％pmsf的pbs 60μl，采用超声破碎机将离心管置于冰水浴中进行细胞破碎。13000r/min离心，离心6min后，吸出上清液至0.5ml离心管中，蛋白浓度通过bradford法用试剂盒测定。按4:1比例向0.5ml离心管中加入5
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蛋白上样缓冲液，放置沸水浴中5min进行蛋白变性，放于-20℃冰箱保存备用。
[0090]
western blot：取30g蛋白进行凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜上，将膜封闭在pbs缓冲液稀释的5％脱脂奶粉中室温下封闭4小时。用tbst(20mm tris-hcl，150mm nacl，0.05％吐温20)清洗膜三次后，用相对应的一抗溶液(抗inos，抗cox-2，抗iκb-α，抗磷酸化erk，抗磷酸化jnk，抗磷酸化p38，抗非磷酸化erk，抗非磷酸化jnk，抗非磷酸化p38)在4℃下孵育过夜。用tbst洗膜三次后，用辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育1小时。将膜用tbst洗三次，蛋白印迹用化学发光试剂盒(ecl)检测，并曝光于胶片上。采集图像，并将与蛋白对应的inos、cox-2、iκb-α、erk、jnk、p38、phospho-erk、phospho-jnk、phospho-p38条带用bandscan4.0软件进行密度分析，对蛋白进行定量。将inos，cox-2，iκb-α蛋白条带分析后所得数据以β肌动蛋白为内参进行处理，phospho-erk、phospho-jnk、phospho-p38蛋白条带
分析后所得数据以erk、jnk、p38为参比进行处理，得到相对蛋白含量，最终所得数值以平均值
±
s.d.表示，组间比较采用t检验，p《0.05被认为有显著性差异。
[0091]
试验结果见图1-图3。
[0092]
结果表明：
[0093]
化合物ⅱ高浓度对lps诱导raw 264.7细胞inos和cox-2蛋白高表达具有抑制作用，而化合物ⅰ对lps诱导raw 264.7细胞inos和cox-2蛋白高表达无明显抑制作用。
[0094]
化合物ⅰ高浓度和化合物ⅱ低、中、高三个浓度对lps诱导raw 264.7细胞iκb-α蛋白降解具有抑制作用。
[0095]
化合物ⅰ和ⅱ能够阻断mapk/erk蛋白和mapk/p38蛋白的磷酸化，但对mapk/jnk蛋白的磷酸化影响较小。mapk信号通路对inos、cox-2蛋白的表达具有调控作用，该类化合物通过阻断mapk/erk/p38信号通路，进一步下调inos、cox-2蛋白的表达，发挥抗炎作用。