一种乳糖修饰的酶敏感支化聚合物及其制备方法和作为肝癌靶向MRI对比剂的用途

一种乳糖修饰的酶敏感支化聚合物及其制备方法和作为肝癌靶向mri对比剂的用途
技术领域
1.本发明属于医学成像技术领域，具体涉及一种乳糖修饰的酶敏感支化聚合物及其制备方法和作为肝癌靶向mri对比剂的用途。


背景技术：

2.mri对比剂在临床诊断中通常用于增强病变和正常组织的对比信号，从而提高疾病的检出率和诊断正确率。目前，临床上使用的是基于金属类的小分子磁共振对比剂，如二乙烯-三胺五乙酸-gd(iii)(dtpa-gd)、超顺磁性 fe3o4纳米粒子，这些对比剂均存在着灵敏度低、非特异性和体内代谢速率快等不足，限制了其在临床应用的范围。
3.近年来，研究人员将小分子顺磁单位与聚合物、脂质体、多糖、蛋白质等大分子的偶联可以克服小分子金属类磁共振对比剂的不足。分子量大、尺寸大的大分子mri对比剂具有更高的纵向弛豫率、肿瘤积累和更长的血液循环时间。既往已经进行了很多努力来探索更有效的大分子mri对比剂。
4.n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(phpma)及其类似物n-(1，3-二羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(pdhpma)，具有结构可控、水溶性好、循环时间长、生物相容性较好、多功能和无免疫原性等优点，已被广泛用于构建大分子对比剂。而phpma和pdhpma最大的缺点是没有组织特异性，不能主动靶向地富集于病变组织，从而导致组织成像效果不佳。因此，需要寻求兼顾水溶性，生物相容性和组织靶向性的大分子聚合物。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种乳糖修饰的酶敏感支化聚合物及其制备方法和作为肝癌靶向mri对比剂的用途。
6.本发明提供了一种乳糖修饰的酶敏感支化聚合物，它的结构如式(i)所示：
[0007][0008]
其中，
[0009]
x为0～2的整数；
[0010]
z为0～2的整数；
[0011]
y为0～2的整数；
[0012]
m为0～200的整数；
[0013]
n为0～2的整数；
[0014]
o为0～10的整数；
[0015]
p为0～160的整数；
[0016]
q为0～2的整数；
[0017]
r选自
[0018]
进一步地，所述聚合物的结构如式(ii)所示：
[0019][0020]
其中，
[0021]
x为0～2的整数；
[0022]
z为0～2的整数；
[0023]
y为0～2的整数；
[0024]
m为0～200的整数；
[0025]
n为0～2的整数；
[0026]
o为0～10的整数；
[0027]
p为0～160的整数；
[0028]
q为0～2的整数。
[0029]
进一步地，所述聚合物的平均分子量为50kda～80kda。
[0030]
本发明还提供了一种制备前述的酶敏感支化聚合物的方法，它包括如下步骤：
[0031]
[0032]
[0033]
[0034][0035]
步骤1、branch-lama-ptema的制备：单体lama、ptema、 ma-gflgk-ma和ma-gflg-cta在raft反应引发剂作用下，在溶剂中发生raft聚合反应，得到branch-lama-ptema；
[0036]
步骤2、branch-lama-sh的的制备：branch-lama-ptema与dtt在溶剂中反应，得到branch-lama-sh；
[0037]
步骤3、branch-lama-dota-cy5.5的制备：branch-lama-sh与 mal-cy5.5和mal-dota在溶剂中发生巯基-烯点击反应，得到 branch-lama-dota-cy5.5；
[0038]
步骤4、branch-lama-dota-cy5.5-gd的制备：将 branch-lama-dota-cy5.5在溶剂中与gdcl3·
6h2o反应，得到 branch-lama-dota-cy5.5-gd。
[0039]
进一步地，
[0040]
步骤1中，所述单体lama、ptema、ma-gflgk-ma、ma-gflg-cta 和raft反应引发剂的摩尔比为(1～5)：(1～5)：(0.01～0.1)：(0.01～0.1)：(0.01～0.1)；
[0041]
和/或，步骤2中，所述branch-lama-ptema与dtt的质量比为(1～5)： (1～5)；
[0042]
和/或，步骤3中，所述branch-lama-sh与mal-cy5.5和mal-dota的质量比为(10～100)：(1～10)：(100～200)；
[0043]
和/或，步骤4中，所述branch-lama-dota-cy5.5和gdcl3·
6h2o的质量比为(1～5)：(1～5)。
[0044]
进一步地，
[0045]
步骤1中，所述单体lama、ptema、ma-gflgk-ma、ma-gflg-cta 和raft反应引发剂的
摩尔比为(3～4)：(2～3)：(0.06～0.07)：(0.03～0.04)： (0.01～0.02)；
[0046]
和/或，步骤2中，所述branch-lama-ptema与dtt的质量比为1：1；
[0047]
和/或，步骤3中，所述branch-lama-sh与mal-cy5.5和mal-dota的质量比为75：1：125；
[0048]
和/或，步骤4中，所述branch-lama-dota-cy5.5和gdcl3·
6h2o的质量比为1：1；
[0049]
优选地，
[0050]
步骤1中，所述单体lama、ptema、ma-gflgk-ma、ma-gflg-cta 和raft反应引发剂的摩尔比为3.19：2.55：0.0638：0.0312：0.0122。
[0051]
进一步地，
[0052]
步骤1中，所述raft反应引发剂为va044；
[0053]
和/或，步骤1中，所述溶剂为甲醇和水混合物；
[0054]
和/或，步骤2中，所述溶剂为水；
[0055]
和/或，步骤3中，所述溶剂为水和dmso混合物；
[0056]
和/或，步骤4中，所述溶剂为水；
[0057]
优选地，步骤1中，所述溶剂为体积比1:2的甲醇和水混合物，溶剂用量为反应物料的3-5倍体积/质量比，将溶剂加入反应物料中时冰水浴冷却，氩气鼓泡30-40分钟；
[0058]
和/或，步骤2中，所述溶剂用量为反应物料的10-20倍体积/质量比；
[0059]
和/或，步骤3中，所述溶剂为体积比1:2的水和dmso混合物，溶剂用量为反应物料的10-20倍体积/质量比；
[0060]
和/或，步骤4中，所述溶剂用量为反应物料的40-50倍体积/质量比。
[0061]
进一步地，
[0062]
步骤1中，所述反应为在避光条件下，40～45℃反应10～12h；
[0063]
和/或，步骤2中，所述反应为在室温条件下反应过夜；
[0064]
和/或，步骤3中，所述反应为在branch-lama-sh中加入mal-cy5.5后在避光条件下室温反应1～5小时后，加入mal-dota继续反应20～24h；
[0065]
和/或，步骤4中，所述反应在ph5.2至5.4之间进行；
[0066]
和/或，步骤4中，所述反应为在避光条件下室温反应20～24小时。
[0067]
进一步地，
[0068]
步骤1中，所述反应后进行提纯，方法为反应物冷却后滴加到丙酮中，将析出的固体在水中透析后冷冻干燥；
[0069]
和/或，步骤2中，所述反应后进行提纯，方法为反应物在水中透析后冷冻干燥；
[0070]
和/或，步骤3中，所述反应后进行提纯，方法为反应物在水中透析后冷冻干燥；
[0071]
和/或，步骤4中，所述反应后进行提纯，方法为反应物在水中透析后冷冻干燥。
[0072]
本发明还提供了前述的酶敏感支化聚合物在制备磁共振成像对比剂中的用途；
[0073]
优选地，所述磁共振成像对比剂是用于检测肝癌的磁共振成像对比剂。
[0074]
本发明将乳糖进行甲基丙烯酰修饰后，通过优选甲基丙烯酰修饰的乳糖单体，与甲基丙烯酰修饰的二硫吡啶单体，以及组织蛋白酶b作用下可降解四肽gflg修饰的单体之间的比例进行聚合，再与钆剂(dota-gd)偶联，得到肝癌特异靶向的，且肿瘤细胞内组织蛋白酶b响应性降解的支化大分子 bldcgd。本发明支化大分子bldcgd的弛豫率是临床小分子
的4倍左右，实验证明bldcgd更容易靶向和富集在肝癌组织，有着更高的肝癌组织mri增强信号，显著出优异的肝癌组织靶向能力。同时，bldcgd安全性好，对各组织和器官无毒。本发明支化大分子bldcgd可以作为一种安全的肝癌靶向磁共振成像对比剂，在临床诊断中具有潜在的应用价值。
[0075]
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0076]
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
[0077]
图1为branch-lama-ptema在d2o中的1hnmr谱。
[0078]
图2为branch-lama-sh在d2o/d6-dmso(v/v:6/1)中的1hnmr谱。
[0079]
图3为branch-lama-dota-cy5.5在d2o/d6-dmso(v/v:6/1)中的1hnmr谱。
[0080]
图4为bldcgd的表征结果：a为bldcgd的dls结果；b为bldcgd的tem结果；c为不同生理环境中gd的释放试验；d为bldcgd用2μm木瓜蛋白酶培养3小时的tem图。
[0081]
图5为3.0tmri弛豫率测量结果：a为dtpa-gd、bdgd和bldcgd的mrit1wi图像；b为三组对比剂的r1值。
[0082]
图6为体内肝癌mri成像结果：a为体内肿瘤的mrit1加权图像；b为dtpa-gd、bldcgd和bdgd注射后肿瘤部位(红色虚线圈)相对增强信号比的定量分析。
[0083]
图7为主要器官和肿瘤的荧光图像和平均信号强度：a和c分别为bdgd的荧光图像和平均信号强度；b和d分别为bldcgd的荧光图像和平均信号强度。
[0084]
图8注射生理盐水(第1组)、bdgd(第2组)和bldcgd(第3组)后1天小鼠的组织学图像；比例尺：10μm。
具体实施方式
[0085]
除另有说明外，本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
[0086]
主要实验材料
[0087]
制备和分析过程中使用的化合物是购买的，无需进一步纯化即可使用。raft反应引发剂va044和二硫苏糖醇(dtt)购自aladdinreagentinc.(中国上海)，gdcl3·
6h2o购自tokyochemicalindustry(tci，日本)，mal-cy5.5(maleimide-cy5.5)购自西安confluore生物科技有限公司(中国西安)。交联剂ma-gflgk-ma、raft聚合单体(ma-gflg-cta、lactose-ma和ptema)以及mal-dota(maleimide-dota)通过文献(w.xiaomingetal./appliedmaterialstoday17(2019)92
–
103)方法合成。
[0088]
ma-gflgk-ma的结构为ma-gflg-cta的结构为 lactose-ma(lama)的结构为ptema的结构为 mal-dota的结构为
[0089]
聚合物通过快速蛋白质液相色谱(fplc)纯化，并通过尺寸排阻色谱 (sec)、1h nmr分析(400mhz bruker advanced spectrometer)、电感耦合等离子体质谱(icp-ms)、动态光散射(dls)表征研究(布鲁克海文仪器公司，纽约，美国)和透射电子显微镜(tem)(tecnai g2 f20 s-twin，fei，美国)。聚合物中的mal-cy5.5负载量通过uv-vis(uv1800eng240 v，soft， shimadzu，japan)测量。
[0090]
实施例1、本发明磁共振对比剂branch-lama-dota-cy5.5-gd (bldcgd)的合成
[0091]
bldcgd的合成路线如下：
[0092]
[0093]
dmso。将mal-cy5.5(2mg)溶解在1ml dmso中并加入上述溶液中。在黑暗中搅拌4小时后，向反应混合物中加入mal-dota(250mg)，并继续反应24小时。将反应混合物用ro水(2kda，mwco)透析48小时。冻干后得到190mg branch-lama-dota-cy5.5(蓝色固体)，产率为48％。 branch-lama-dota-cy5.5在d2o/d6-dmso(v/v:6/1)中的1h nmr谱如图3所示。
[0103]
4、branch-lama-dota-cy5.5-gd(bldcgd)的制备
[0104]
将branch-lama-dota-cy5.5(170mg)溶解在15ml ro水中，将 gdcl3·
6h2o(170mg)添加到上述溶液中。使用0.2n naoh调节ph值保持在5.2至5.4之间。将反应混合物在黑暗中搅拌24小时，然后用ro水(2kda， mwco)透析24小时，并冻干至干燥。以蓝色固体形式获得148mgbranch-lama-dota-cy5.5-gd(bldcgd)，收率为87％。通过icp-ms分析得bldcgd的gd(iii)含量为5.65wt％，通过紫外线-可见光分析得bldcgd 的mal-cy5.5负载量为1.5wt％。
[0105]
本发明首先采用单体lama、ptema、ma-gflgk-ma和 ma-gflg-cta通过raft聚合反应构建支化大分子 branch-lama-ptema。branch-lama-ptema的成功制备通过质子核磁共振谱(1h nmr)验证，如图1所示，可以看到烷基链质子峰(δ＝0.5-1.5)、乳糖(δ＝2.5-4.5)，gflg上的苯基和ptema的吡啶基(δ＝7.0-8.5)特征质子峰；没有看到甲基丙烯酰基上的双键质子峰(δ＝5.4-6.0)，说明单体已通过透析去除。branch-lama-sh是用二硫苏糖醇(dtt)破坏 branch-lama-ptema的二硫键而获得，位于7.0-8.5之间的吡啶基质子峰的消失说明成功去除吡啶基团(图2)。通过“巯基-烯点击反应”将mal-dota 和mal-cy5.5与branch-lama-sh缀合获得branch-lama-dota-cy5.5， 3.0-3.3之间质子峰的增强表明成功将mal-dota与大分子结合(图3)。 mal-cy5.5的质子峰由于含量太低而看不到(表1)。在ph＝5.2-5.4的水溶液中，将gdcl3·
6h2o与branch-lama-dota-cy5.5螯合获得肝癌靶向大分子对比剂branch-lama-dota-cy5.5-gd。由于负载顺磁性gd离子， branch-lama-dota-cy5.5-gd未进行1h nmr表征。通过icp-ms分析得bldcgd的gd(iii)含量为5.65wt％，通过紫外线-可见光分析得bldcgd的 mal-cy5.5负载量为1.5wt％。
[0106]
bldcgd的表征结果：
[0107]
合成bldcgd的过程中，各聚合物的性质表征结果见表1。
[0108]
表1.每一步聚合物的性质表征结果
[0109][0110]
注：a表示分子量的多分散指数，b表示粒径的多分散指数。
[0111]
通过动态光散射(dls)法测定bldcgd在水相中聚集体的动力学尺寸，结果为59
±
12nm(图4a)，多分散指数(pdi)为0.209，大于透射电子显微镜(tem)测试结果(图4b)，tem结果为20-30nm，是在干燥状态下的粒径。纳米颗粒较小的尺寸可能与相对低的分子量有关(81kda，表1)，与之前报道的支化大分子branch-pdhpma-gd(bdgd)相比(w.xiaoming et al. /applied materials today 17(2019)92
–
103)，较小的纳米颗粒可能更有利于肿瘤组织的渗透。特别是bldcgd中的gflg连接键，会在肿瘤细胞溶酶体中过表达的组织蛋白酶b的
作用下降解，形成更小的纳米颗粒。 branch-lama-ptema在水中的表面zeta电位为15.84
±
0.96mv(表1)，正电荷可能是由富电子的吡啶基引起的，它会从水中捕获氢正离子。没有吡啶基的branch-lama-sh几乎是中性的。与含有三个羧基的mal-dota结合的 branch-lama-dota-cy5.5的电位为-9.13
±
2.83mv。bldcgd的电位为 7.28
±
1.34mv，表明正电性gd
3
的成功配位。
[0112]
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
[0113]
试验例1、bldcgd的体外gd释放
[0114]
一、实验方法
[0115]
在生理环境中进行bldcgd体外gd释放试验。具体而言，将bldcgd 分别溶解在含2μm木瓜蛋白酶的pbs(ph＝5.4)、pbs(ph＝7.4)和pbs (ph＝5.4)中，以10.0μg gd(iii)/ml的初始浓度制备3ml溶液。将配制好的溶液置于透析袋(2kda，mwco)中，浸入50ml相同的空白pbs溶液中，37℃摇床孵育。在预定时间(0h、1h、3h、6h、12h、24h、36h、48 h)取出透析袋中各释放液3
×
100μl。每个样品用水稀释至4ml，并通过icp-ms测量钆浓度。
[0116]
将bldcgd(350μg/ml)同具有与组织蛋白酶b相似功能的木瓜蛋白酶(300μg/ml)孵育3小时后，通过tem进行形态变化测试。
[0117]
二、实验结果
[0118]
bldcgd体外gd释放试验结果表明，bldcgd可以在生理环境中快速释放gd离子(图4c)，并在24小时内几乎降至基线水平。gd
3
的快速释放会降低gd在组织中滞留潜在的毒性问题。
[0119]
tem结果显示bldcgd在木瓜蛋白酶作用下，解离成更小的颗粒 7-11nm(图4d)。形态变化结果表明，bldcgd可以在体内降解，从而降低大分子聚合物在体内积累引起的组织毒性。
[0120]
试验例2、本发明磁共振对比剂bldcgd的效果验证
[0121]
一、实验方法
[0122]
1、肿瘤动物模型
[0123]
所有balb/c实验小鼠(8-10周，20
±
2g)均购自成都达硕实验动物有限公司。h22细胞购自procell生命科技有限公司。50μl的h22细胞磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，pbs)经小鼠背部皮下注射制作皮下肝癌模型，接种细胞数为2
×
105个，当肿瘤直径达到100mm3时用于mri成像。
[0124]
2、磁共振成像
[0125]
使用自旋回波(se)序列收集t1加权mri图像，图像采集参数包括回波时间为6.9ms，重复时间为20、30、50、70、90、125、150、175、200、 300、400、500、700、850和1000ms，视野200
×
200mm，层厚1.0mm，矩阵256
×
256。
[0126]
采用se序列获取小鼠肿瘤mri图像，图像采集参数为重复时间500ms，回波时间12ms，视野60
×
60mm，体素大小0.2
×
0.2
×
1.5mm3，层厚1.2mm。
[0127]
bldcgd、bdgd和dtpa-gd的样品在2ml pcr管中制备，gd(iii)浓度为0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45mm，溶解在0.1m pbs 中用于体外纵向弛豫率的测定。在临床3.0t mri成像设备(siemens trio tim) 上收集数据。扫描参数如上所述。相应的1/t1值是从它们的t1加权mri 图像中获得的。弛豫率值(r1)是通过绘制1/t1作为不同gd
3
浓度的函
数来计算的。
[0128]
随机挑选15只荷瘤balb/c小鼠进行肿瘤部位磁共振成像。将小鼠任意分为三组(n＝5)。用1％
–
2％异氟醚麻醉后，采用mri t1 se序列行横断位扫描。小鼠肿瘤研究的mri序列和参数如上所述。通过尾静脉注射bldcgd、bdgd和dtpa-gd(剂量为0.08mmol gd
3
/kg)之后，获取各时间点肿瘤部位的mri图像信号强度(signal intensity，si)，然后在各图像集肿瘤中心绘制圆形感兴趣区域，对信号强度进行定量分析。最后，如文献(shiwei guo,等. reductive microenvironment responsive gadolinium-based polymers as potentialsafe mri contrast agents.biomater.sci.,2019,7,1919.)获得了mri si的增强变化值(si％)。
[0129]
按照本发明类似方法，不加lama制备bdgd，bdgd的结构式为：
[0130][0131]
其中，
[0132]
x为0～2的整数；m为0～200的整数；n为0～2的整数；o为0～10的整数；p为0～160的整数；q为0～2的整数；z为0～2的整数；y为0～2的整数。
[0133]
dtpa-gd(二乙烯三胺五乙酸钆)为市售的磁共振对比剂。
[0134]
3、体外荧光成像
[0135]
比较bldcgd和bdgd的体外荧光成像。将40只荷瘤balb/c小鼠随机分为两组，分别通过尾静脉注射bldcgd和bdgd，在注射后0.5、1、2、 24小时处死小鼠，取心、肝、脾、肺、肾及肿瘤进行荧光成像(ivis spectrum)。
[0136]
二、实验结果
[0137]
1、体外弛豫率
[0138]
纵向弛豫率是评价mri t1对比剂增强效果的重要指标。选用临床小分子dtpa-gd和大分子bdgd作为对照组，如图5所示，大分子对比剂bldcgd 和bdgd的mri信号强度明显高于dtpa-gd。bldcgd和bdgd的r1值分别为12.62mm-1
s-1
和12.23mm-1
s-1
，比dtpa-gd(r1＝3.42mm-1
s-1
)高约4 倍。这种增加可能是由于bldcgd和bdgd具有更大的分子量和粒径，使得旋转相关时间(τr)增加。根据bloembergen-solomom-morgan理论，较长的旋转相关时间(τr)导致纵向弛豫率增加。
[0139]
2、体内肝癌mri成像
[0140]
比较三组mri对比剂在小鼠肝癌模型中的增强效果。如图6所示，注射 dtpa-gd后，肿瘤mri信号强度在30分钟内持续升高并达到峰值，增加幅度约120％，随后信号强度降低，4小时恢复到注射前的基线水平。
[0141]
另外两组注射mri大分子对比剂后，10分钟肿瘤部位开始出现mri增强信号，但两组存在明显差异。bdgd组在10分钟后肿瘤内部出现少许斑片状强化，而大部分未强化，1小时后强化达到峰值，增强幅度最高达134％， 24小时观察mri信号恢复至注射前水平。bldcgd组10分钟后肿瘤部位呈明显强化，2小时内持续增强并达到强化峰值，增强幅度最高可达184％，肿瘤内部强化较为均匀，8小时观察仍有明显强化，24小时观察恢复至注射前水平。与dtpa-gd相比，bldcgd和bdgd的增强效果更明显，这是大分子mri对比剂能够通过高通透性和滞留效应(enhanced permeability andretention effect,epr)效应在肿瘤部位积累的结果。此外，在bldcgd和bdgd 之间，bldcgd在肿瘤部位具有更高的增强程度、更均匀的分布和更长的成像窗口，bldcgd作为磁共振对比剂成像效果显著优于大分子bdgd。
[0142]
3、体内荧光成像分布
[0143]
注射bldcgd和bdgd后，不同器官和肿瘤部位的荧光图像如图7所示。在肝肿瘤部位，两组荧光强度持续上升并在2小时内达到峰值，24小时后显着下降。bldcgd的荧光强度在所有时间点均强于bdgd，与mri结果一致。这种差异进一步证实了bldcgd可以被肝癌细胞识别并结合，使其在肿瘤中不断积累，说明对于肝癌的靶向性bldcgd强于bdgd。
[0144]
试验例3、体内毒性研究
[0145]
一、实验方法
[0146]
将15只健康雌性balb/c小鼠(8-10周，20
±
2g)随机分为3组(n＝5)：注射生理盐水组(group1)、bdgd组(group2)和bldcgd组(group3)。三组小鼠分别尾静脉注射0.08mmol gd
3
/kg的bldcgd和bdgd以及生理盐水(对照组)，1天后处死所有小鼠。采集主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，用4％多聚甲醛溶液固定48小时，石蜡包埋。h&e染色后分析组织切片。
[0147]
二、实验结果
[0148]
bldcgd和bdgd注射24小时后，未发现明显的急性毒副作用。随后，处死所有实验小鼠，收集主要器官(心、肝、脾、肺、肾)并进行病理分析。结果表明，与生理盐水组相比，实验组没有明显的组织病理学异常(图8)。这也证明了在mri成像剂量下，bldcgd和bdgd对活体动物的器官和组织是无毒的。
[0149]
综上，本发明合成了一种支化大分子bldcgd，本发明支化大分子 bldcgd的弛豫率是临床小分子的4倍左右，实验证明bldcgd更容易靶向和富集在肝癌组织，有着更高的肝癌
组织mri增强信号，显著出优异的肝癌组织靶向能力。同时，bldcgd安全性好，对各组织和器官无毒。本发明支化大分子bldcgd可以作为一种安全的肝癌靶向磁共振成像对比剂，在临床诊断中具有潜在的应用价值。