一种抗菌肽及其制备方法与流程

1.本发明属于医药领域，涉及到一种抗菌肽及其制备方法与应用，具体而言涉及到一组具有较高抗菌活性的十肽及其合成制备。


背景技术：

2.随着抗生素的广泛应用，细菌耐药性问题，已经成为一个全球性医学难题。近些年来，临床上日益增多的多重耐药(multidrug resistance，mdr)革兰氏阴性细菌，尤其是碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌的流行，给感染治疗带来巨大的挑战。由于新型抗菌药物研究开发进展缓慢，多黏菌素这种早期因肾毒性和神经毒性问题被限制使用的抗菌药物，因体外对多重耐药及泛耐药(pan-drug resistance，pdr)革兰氏阴性菌存在显著的抗菌活性而作为治疗革兰氏阴性耐药菌引起严重感染的最后一道防线。
3.天然多黏菌素由线性三肽部分连接n-脂肪酰基链和环状七肽构成，4-位的l-dab(2，4-二氨基丁酸)与10-位的l-thr缩合形成七肽环。用于临床的多黏菌素主要为多黏菌素b(polymyxin b，pmb)和多黏菌素e(colistin，cst，又称粘菌素)，两者的主要区别在于6号位上一个氨基酸的差异，其中pmb是d-苯丙氨酸，cst是d-亮氨酸(cui,et.al.research development of polymyxins[j].world notes on antibiotics,2015,36(5):205-210)。
[0004]
多黏菌素是一个研究历史较长的抗生素，目前研究者对其做了许多结构改造，但结果往往不能令人满意，抗菌活性与毒性不能兼顾。因此，寻找毒性低且具有高效杀菌活性的多黏菌素类似物成为一种迫切的需要。


技术实现要素：

[0005]
本发明涉及一种抗菌肽及其制备合成方法与应用，具体而言涉及到一组具有较高抗菌活性的十肽及其合成制备。
[0006]
本发明的一个方面，提供一种式i所示的多肽及其可药用盐，
[0007][0008]
其中，l为环化连接基团或缺失；可选择的，当l为环化连接基团时，本发明所述的多肽为环状多肽；当l为缺失时，本发明所述的多肽主链为直链；优选的，l具有式ii所示的结构通式，
[0009][0010]
t1、t2可互为苯环取代的邻位、对位和间位，t1、t2可同时为相同的结构或不同的结构；l可以通过式v化合物中-br与cys上的巯基发生取代反应得到，其中z1或z2为直链或支链烷基或缺失，-z
1-br、-z
2-br可互为苯环取代的邻位、对位和间位，-z
1-br、-z
2-br可同时为
相同的结构或不同的结构；
[0011][0012]
r1选自脂肪族直链或支链c
2-c
18
的酰基基团，带有联苯结构的酰基基团，或带有噻唑结构的酰基基团中的一种或缺失；
[0013]
xaa1选自dab，lys或aib中的一种或缺失，优选为dab或缺失；
[0014]
xaa2选自thr，ser，tyr或aib中的一种或缺失，优选为thr或缺失；
[0015]
xaa3选自dab，lys或aib中的一种或缺失，优选为dab或缺失；
[0016]
xaa4选自dab，lys或aib中的一种，优选为dab；
[0017]
xaa5选自d-leu，d-phe或aib中的一种，优选为d-leu或d-phe；
[0018]
xaa6选自leu，ile，ala，val或aib中的一种，优选为leu；
[0019]
xaa7选自dab，lys或aib中的一种，优选为dab；
[0020]
xaa8选自dab，lys或aib中的一种，优选为dab。
[0021]
在一些实施方案中，所述多肽由序列中两个cys上的巯基与式v化合物中中的两个-br分别发生取代反应成环。在一些实施方案中，式v化合物选自1，2-二(溴甲基)苯，1，3-二(溴甲基)苯或1，4-二(溴甲基)苯。在一些具体实施方案中，l为1，3-二(溴甲基)苯。
[0022]
在一些实施方案中，所述r1选自乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基，庚酰基，甲基庚酰基，辛酰基，甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，十八烷酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。
[0023]
在本发明的一些实施方案中，所述多肽的结构通式为式iii所示：
[0024][0025]
其中，l为环化连接基团或缺失；优选的，l具有式ii所示的结构通式，
[0026][0027]
t1、t2可互为苯环取代的邻位、对位和间位，t1、t2可同时为相同的结构或不同的结构；l可以通过式v化合物中-br与cys上的巯基发生取代反应得到，其中z1或z2为直链或支链烷基或缺失，-z
1-br、-z
2-br可互为苯环取代的邻位、对位和间位，-z
1-br、-z
2-br可同时为相同的结构或不同的结构；更优选的，式v化合物为1，2-二(溴甲基)苯，1，3-二(溴甲基)苯或1，4-二(溴甲基)苯，进一步优选的，l为1，3-二(溴甲基)苯。
[0028]
r1选自乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基，庚酰基，甲基庚酰基，辛酰基，甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，十八烷酸酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲
酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。优选为正戊酰基，正己酰基，正庚酰基，6-甲基庚酰基，正辛酰基，6-甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，十八烷酸酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。
[0029]
在本发明的一些实施方案中，所述多肽的结构通式为式ⅳ所示：
[0030][0031]
其中，r1选自乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基，庚酰基，甲基庚酰基，辛酰基，甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，十八烷酸酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。优选为乙酰基，正丙酰基，正丁酰基，正戊酰基，正己酰基，正庚酰基，6-甲基庚酰基，正辛酰基，6-甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。
[0032]
在一些具体的实施方案中，本发明所述的环肽主链上n端第1位、第2位、第3位、第5位、第6位、第7位、第8位或第9位氨基酸存在一处或多处aib替换，或不替换。
[0033]
在一些具体的实施方案中，本发明所述的多肽为选自lamp-1～lamp-29的多肽。
[0034]
表1.lamp-1～lamp-29环肽
[0035]
[0036]
[0037][0038]
本发明所涉及到的环肽，是由序列中两个cys的巯基与苯试剂上的溴取代基发生反应而成环。
[0039]
在本发明的一些实施方案中，所述多肽的结构通式为r
1-dab-thr-dab-cys-dab-d-leu-leu-dab-dab-cys-nh2，
[0040]
其中，r1选自乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基，庚酰基，甲基庚酰基，辛酰基，甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，十八烷酸酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。优选为正戊酰基，正己酰基，正庚酰基，6-甲基庚酰基，正辛酰基，6-甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。
[0041]
在一些具体的实施方案中，本发明所述的多肽为选自lamp-30～lamp-44的直链多肽。
[0042]
表2.lamp-30～lamp-44直链肽
[0043]
[0044][0045]
本发明的另一方面，提供一种本发明所述多肽的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0046]
(1)采用树脂载体固相合成方法合成本发明所述多肽的氨基酸主链；
[0047]
(2)将步骤(1)的产物用强酸进行裂解；加入侧链保护基清除剂，过滤，有机溶剂沉淀多肽，离心，洗涤沉淀，干燥，得到粗肽。
[0048]
(3)可选择的，将步骤(2)所得粗肽与环化试剂进行环化反应，得到环化多肽。
[0049]
在一些实施方案中，步骤(1)中所述的树脂载体选自wang树脂、2-ctc树脂或rink amide mbha树脂中的一种。在一些具体的实施方案中，如本发明所涉及的多肽c末端为羧酸形式，则步骤(1)采用wang树脂或2-ctc树脂进行合成；在一些具体的实施方案中，如本发明所涉及的多肽c末端为酰胺形式，则步骤(1)采用rink amide mbha树脂进行合成。
[0050]
在一些具体的实施方案中，所述步骤(1)包括如下步骤：
[0051]
(a)溶剂浸泡树脂—投料(首个氨基酸)—测定树脂取代值—脱除氨基保护基—溶剂洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—溶剂洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸—直到最后一个氨基酸脱除氨基保护基并洗涤；
[0052]
(b)最后偶联r1—监测—洗涤。
[0053]
步骤(a)中所述的氨基保护基是指为保护参与缩合反应的氨基而引入的化学基团。在一些实施方案中，所述的氨基保护基可选自叔丁氧羰基(boc)、苄氧羰基(z)或9-芴基-甲氧羰基(fmoc)，优选9-芴基-甲氧羰基(fmoc)。
[0054]
步骤(1)所述的固相多肽合成中，可对部分氨基酸的侧链可以引入化学基团进行保护，例如cys可以采用三苯甲基(trt)保护；dab可以采用叔丁氧羰基(boc)保护；thr可以采用叔丁基(tbu)保护。例如，本发明中fmoc-l-dab(boc)-oh具有式(ⅳ)所示的结构：
[0055][0056]
在一些实施方案中，步骤(a)所用溶剂选自：二甲基甲酰胺(dmf)、二氯甲烷(dcm)或n-甲基吡咯烷酮(nmp)，优选dmf或dcm。
[0057]
在一些实施方案中，步骤(a)中脱除氨基保护基的脱除剂选自浓度10-40％的哌啶/dmf(pip)，优选浓度为20-25％的哌啶/dmf(pip)；脱除时间可选为20-50min，优选脱除时间为25-35min。
[0058]
在一些实施方案中，步骤(a)中所述偶联氨基酸的步骤需要加入偶联试剂，所述偶联试剂选自碳二亚胺型试剂、苯并三氮唑鎓盐型试剂或1-羟基苯并三唑(hobt)中的一种或两种组合。在一些实施方案中，所述碳二亚胺型试剂选自二环己基碳二亚胺(dcc)、二异丙基碳二亚胺(dic)或n-二氨基丙基-n-乙基碳二亚胺(edc)中的一种。在一些实施方案中，所述苯并三氮唑鎓盐型试剂选自2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)、o-苯并三唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐(hbtu)、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(bop)或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(pybop)中的一种。在一些实施方案中，所述偶联试剂优选二异丙基碳二亚胺(dic)与1-羟基苯并三唑(hobt)组成的混合试剂(n:n＝1:1)，或2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯(tbtu)与1-羟基苯并三唑(hobt)组成的混合试剂(n:n＝1:1)，进一步优选dic(二异丙基碳二亚胺)与1-羟基苯并三唑(hobt)组成的混合试剂(n:n＝1:1)。
[0059]
在一些实施方案中，步骤(a)中所述的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
[0060]
在一些实施方案中，步骤(a)中所述的顺序偶联剩余氨基酸是指根据多肽氨基酸序列从c端向n端逐个连接氨基酸。
[0061]
在一些实施方案中，步骤(b)中所述的偶联r1是将步骤(a)所得多肽中氨基与脂肪酸羧基形成酰胺键，偶联试剂优选dic与hobt组成的混合试剂(n:n＝1:1)，或tbtu与hobt组成的混合试剂(n:n＝1:1)，进一步优选dic与hobt组成的混合试剂(n:n＝1:1)。
[0062]
在一些实施方案中，步骤(2)中所述的侧链保护基清除剂选自茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇或间甲酚中的一种、两种或几种组合，并与三氟乙酸或氢氟酸按5-20％(v/v)进行配制得到。在一些具体的实施方案中，步骤(2)中所述的侧链保护基清除剂选自三氟乙酸(tfa)：三异丙基硅烷：水＝95:2.5:2.5(v/v/v)。
[0063]
在一些实施方案中，步骤(3)中所述的环化反应需加入环化试剂和碳酸氢铵(nh4hco3)，其中环化试剂选自1，2-(二溴甲基)苯、1，3-(二溴甲基)苯、1，4-(二溴甲基)苯或其他溴烷基取代的苯试剂中的一种或几种组合，优选1，2-(二溴甲基)苯、1，3-(二溴甲基)苯或1，4-(二溴甲基)苯，进一步优选1，3-(二溴甲基)苯。
[0064]
特别有益的是为满足医药用途的质量要求，本发明所提供的多肽制备方法从步骤(3)获得粗品后还可以进一步包括纯化步骤。所采用的纯化方法包括但不限于反相色谱法或离子交换色谱法，优选反相色谱法。
[0065]
在本发明的另一个方面，还提供了前述的多肽或其药用盐的用途。本发明所涉及的多肽可以用于抑菌、抗菌或制备抗菌物质。
[0066]
在一些实施方案中，所述抗菌物质为抗菌药物或抗菌剂，所述菌为细菌或真菌。在一些实施方案中，本发明的多肽可以用于抗阴性菌或抗耐药菌，或制备抗阴性菌或抗耐药菌药物。在一些实施方案中，所述细菌、真菌或耐药菌是鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumanii)，耐药鲍曼不动杆菌(drug resistant acinetobacter baumanii)，铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)，耐药铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)，金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)，大肠杆菌(escherichia coli)，和/或白色念珠菌(candida albicans)中的一种或几种，更优选地，是铜绿假单胞菌，耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌。
[0067]
在一些实施方案中，本发明涉及抗菌物质。在一些具体实施方式中，所述抗菌物质为抗菌药物或抗菌剂。本发明的抗菌物质或菌剂包括本发明所述的多肽，以及药学上可接受的盐和/或载体、赋形剂中的一种或几种。
[0068]
在一些实施方案中，本发明提供一种可用于抗菌的药物组合物，其包含本技术的多肽或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，本技术的药物组合物还包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。
[0069]
在一些实施方案中，提供本发明所述的多肽或其药学上可接受的盐在制备预防或者治疗细菌或真菌感染性疾病的药物和/或药物组合物中的用途。
[0070]
在本发明的另一个方面，本发明提供一种预防或治疗哺乳动物的由感染菌引起的疾病的方法，包括对需要该治疗的哺乳动物，优选人类，给予治疗有效量的本发明的多肽或其药学上可接受的盐、或其药物组合物。
[0071]
上述治疗方法可以如下方式给予：(a)单一药物组合物，其包含本技术的多肽、至少一种本文中描述的附加的治疗剂、和药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体；或(b)两种单独的药物组合物，其包括(i)包含本技术的多肽及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的第一组合物，及(ii)包含至少一种附加的治疗剂和药学上可接受的赋形剂、稀释剂、或载体的第二组合物。所述药物组合物可以同时或相继和以任何顺序给予。
[0072]
本发明所涉及多肽的体外抗菌活性可以通过测定其最低抑菌浓度(mic)来鉴定。美国临床实验室标准化委员会(nccls)推荐采用微量肉汤稀释法来测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(mic)，培养基采用mueller-hinton(mh)肉汤培养基以及改良型rpmi-1640培养基。以硫酸多黏菌素e及盐酸万古霉素作为阳性对照。体外活性测定表明，本发明提供的抗菌肽具有较高的抗菌活性，特别是抗革兰氏阴性菌(如铜绿假单胞菌)，且稳定性好，在体内仍保持较好的抗菌活性。
[0073]
定义
[0074]
除非另有说明，本技术中所用的下列术语具有下列含义。一个特定的术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照本领域普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
[0075]
术语“脂肪族直链或支链c
2-c
18
的酰基基团”，是指含有羰基基团部分和非羰基基团部分的取代基，所述非羰基基团包括脂肪族直链或支链基团，包括但不限于烷基、环烷基、烯烃基以及炔基。本发明中包括但不限于已知多黏菌素化合物中发现的酰基基团，其包括，庚酰基、甲基庚酰基(包括(s)-6-甲基庚酰基)、辛酰基、甲基辛酰基(包括(s)-6-甲基辛酰基、(s)-7-甲基辛酰基)、壬酰基、甲基壬酰基(包括(s)-6-甲基壬酰基、(s)-7-甲基壬酰基和(s)-8-甲基壬酰基)和癸酰基。本发明中，还包括乙酰基、丙酰基、丁酰基、戊酰基、己酰基、月桂酰基、棕榈酰基、肉豆蔻酰基以及十八烷酰基。所述“乙酰基”是指乙酸酐中乙酰氧基被取代；所述“丙酰基”、“丁酰基”、“戊酰基”、“己酰基”、“月桂酰基”、“棕榈酰基”、“肉豆蔻酰基”以及“十八烷酸酰基”是指丙酸、丁酸、戊酸、己酸、月桂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸以及十八烷酸中羟基被取代。
[0076]
术语“被取代的”是指特定原子上的任意一个或多个氢原子被取代基取代，只要特定原子的价态是正常的并且取代后的化合物是稳定的。当取代基为酮基(即＝0)时，意味着两个氢原子被取代，酮取代不会发生在芳香基上。
[0077]
术语“任选”或“任选地”是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，该描述包括发生所述事件或情况和不发生所述事件或情况。例如，乙基“任选”被卤素取代，指乙基可以是未被取代的(ch2ch3)、单取代的(如ch2ch2f)、多取代的(如chfch2f、ch2chf2等)或完全被取代的(cf2cf3)。本领域技术人员可理解，对于包含一个或多个取代基的任何基团，不会引入任何在空间上不可能存在和/或不能合成的取代或取代模式。
[0078]
本文所用的c
m-n
指该部分中具有m-n个碳原子。例如，“碳3-10环烷基”指该环烷基具有3-10个碳原子。“碳0-6亚烷基”指该亚烷基具有0-6个碳原子，当亚烷基具有0个碳原子时，该基团为键。
[0079]
本文中的数字范围，是指给定范围中的各个整数。例如“c
1-6”是指该基团可具有1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子、4个碳原子、5个碳原子或6个碳原子。
[0080]
当任何变量(例如r)在化合物的组成或结构中出现一次以上时，其在每一种情况下的定义都是独立的。因此，例如，如果一个基团被2个r所取代，则每个r都有独立的选项。
[0081]
术语“卤”或“卤素”是指氟、氯、溴和碘。
[0082]
术语“酰基”指-co-基团。
[0083]
术语“羧基”指-cooh基团。
[0084]
术语“羟基”指-oh基团。
[0085]
术语“氰基”指-cn基团。
[0086]
术语“巯基”指-sh基团。
[0087]
术语“氨基”指-nh2基团。
[0088]
术语“硝基”指-no2基团。
[0089]
术语“烷基”是指通式为c
nh2n 1
的烃基。该烷基可以是直链或支链的。例如，术语“烃1-6烷基”指含有1至6个碳原子的单价直链或支链脂肪族基团(例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、新戊基、3,3-二甲基丙基、己基、2-甲基戊基等)。类似地，烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、烷基磺酰基和烷硫基的烷基部分(即烷基)具有上述相同定义。
[0090]
术语“烷氧基”指-o-烷基。
[0091]
术语“烷硫基”指-s-烷基。
[0092]
术语“烷基氨基”指-nh(烷基)。
[0093]
术语“二烷基氨基”指-n(烷基)2。
[0094]
术语“烯基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个双键的不饱和脂肪族烃基。烯基的非限制性实例包括但不限于乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基、1-丁烯基、异丁烯基、1,3-丁二烯基等。
[0095]
术语“炔基”是指由碳原子和氢原子组成的直链或支链的具有至少一个三键的不饱和脂肪族烃基。炔基的非限制性实例包括但不限于乙炔基(-c由碳原)、1-丙炔基(-c基(原子和3)、2-丙炔基(-ch
2-ch(原)、1,3-丁二炔基(-c炔基(子和氢原)等。
[0096]
术语“环烷基”指完全饱和的并且可以以呈单环、稠环或螺环存在的碳环。除非另有指示，该碳环通常为3至10元环，优选为3至8元环。环烷基非限制性实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、降冰片基(双环[2.2.1]庚基)、双环[2.2.2]辛基、金刚烷基等。
[0097]
术语“芳基”是指具有共轭的π电子体系的全碳单环或稠合多环的芳香环基团。例如，芳基可以具有6-20个碳原子，6-14个碳原子或6-12个碳原子。芳基的非限制性实例包括但不限于苯基、萘基和蒽基等。
[0098]
术语“杂芳基”是指单环或稠合多环体系，其中含有至少一个选自n、o、s的环原子，其余环原子为c，并且具有至少一个芳香环。优选的杂芳基具有单个4至8元环，尤其是5至8元环，或包含6至14个，尤其是6至10个环原子的多个稠合环。杂芳基的非限制性实例包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、喹啉基、异喹啉基、四唑基、三唑基、三嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、异吲哚基等。
[0099]
术语“治疗”意为将本技术所述化合物或制剂进行给药以预防、改善或消除疾病或与所述疾病相关的一个或多个症状，且包括：
[0100]
(i)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中出现，特别是当这类哺乳动物易患有该疾病状态，但尚未被诊断为已患有该疾病状态时；
[0101]
(ii)抑制疾病或疾病状态，即遏制其发展；
[0102]
(iii)缓解疾病或疾病状态，即使该疾病或疾病状态消退。
[0103]
术语“治疗有效量”意指(i)治疗或预防特定疾病、病况或障碍，(ii)减轻、改善或消除特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状，或(iii)预防或延迟本文中所述的特定疾病、病况或障碍的一种或多种症状发作的本技术化合物的用量。构成“治疗有效量”的本技术化合物的量取决于该化合物、疾病状态及其严重性、给药方式以及待被治疗的哺乳动物的年龄而改变，但可例行性地由本领域技术人员根据其自身的知识及本公开内容而确定。
[0104]
术语“药学上可接受的”，是针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
[0105]
作为药学上可接受的盐，例如，可以提及金属盐、铵盐、与有机碱形成的盐、与无机酸形成的盐、与有机酸形成的盐、与碱性或者酸性氨基酸形成的盐等。金属盐的非限制性实例包括但不限于碱金属的盐，例如钠盐、钾盐等；碱土金属的盐，例如钙盐、镁盐、钡盐等；铝盐等。与有机碱形成的盐的非限制性实例包括但不限于与三甲胺、三乙胺、吡啶、甲基吡啶、2,6-二甲基吡啶、乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、环己胺、二环己基胺等形成的盐。与无机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与盐酸、氢溴酸、硝酸、硫酸、磷酸等形成的盐。与有机酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与甲酸、乙酸、三氟乙酸、富马酸、草酸、苹果酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲基苯磺酸等形成的盐。与碱性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸等形成的盐。与酸性氨基酸形成的盐的非限制性实例包括但不限于与天冬氨酸、谷氨酸等形成的盐。
[0106]
术语“药物组合物”是指一种或多种本技术的化合物或其盐与在本领域中通常接受的用于将生物活性化合物输送至有机体(例如人)的赋形剂、稀释剂、或载体的制剂。药物组合物的目的是有利于对有机体给予本技术的化合物。
[0107]
术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂、或载体”是指对有机体无明显刺激作用，而且不会损害该活性化合物的生物活性及性能的那些赋形剂、稀释剂、或载体。合适的载体、稀释剂及赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且包括诸如碳水化合物、蜡、水溶性和/或水可膨胀的聚合物、亲水性或疏水性材料、明胶、油、溶剂、水等原料。
[0108]
本技术还包括与本文中记载的那些相同的，但一或多个原子被原子量或质量数不同于自然中通常发现的原子量或质量数不同的原子置换的同位素标记的本技术化合物。可结合到本技术化合物的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘和氯的同位素，诸如分别为2h、3h、11c、13c、14c、13n、15n、15o、17o、18o、31p、32p、35s、18f、123i、125i和36cl等。
[0109]
某些同位素标记的本技术化合物(例如用3h及14c标记的那些)可用于化合物和/或底物组织分布分析中。氚化(即3h)和碳-14(即14c)同位素对于由于它们易于制备和可检测性是尤其优选的。此外，用较重同位素(诸如氘(即2h))取代可以提供某些由更高的代谢稳定性产生的治疗优点(例如增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在某些情形下可能是优选的。正电子发射同位素，诸如15o、13n、11c和18f可用于正电子发射断层扫描(pet)研究以测定底物占有率。通常可以通过与公开于下文的方案和/或实施例中的那些类似的下列程序，通过同位素标记试剂取代未经同位素标记的试剂来制备同位素标记的本技术化合物。
[0110]
本发明所涉及的氨基酸若不特别限定其结构，则默认为l型氨基酸。
[0111]
本发明所涉及到的多肽为环肽，是由序列中两个cys的巯基与苯试剂上的溴取代基发生反应而成环。
[0112]
本发明所涉及到的肽其c末端既可以是羧基形式，也可以是酰胺形式，优选为酰胺形式。
[0113]
表3：天然氨基酸三字母代码表
[0114][0115][0116]
本发明还包括以下内容：
[0117]
1.式i所示的多肽及其可药用盐，
[0118]
[0119]
其中，l为环化连接基团或缺失；
[0120]
r1选自脂肪族直链或支链c
2-c
18
的酰基基团，带有联苯结构的酰基基团，或带有噻唑结构的酰基基团中的一种或缺失；
[0121]
xaa1选自dab，lys或aib中的一种或缺失；
[0122]
xaa2选自thr，ser，tyr或aib中的一种或缺失；
[0123]
xaa3选自dab，lys或aib中的一种或缺失；
[0124]
xaa4选自dab，lys或aib中的一种；
[0125]
xaa5选自d-leu，d-phe或aib中的一种；
[0126]
xaa6选自leu，ile，ala，val或aib中的一种；
[0127]
xaa7选自dab，lys或aib中的一种；
[0128]
xaa8选自dab，lys或aib中的一种。
[0129]
2.根据项1所述的多肽，其特征在于所述l具有式ii所示的结构通式，
[0130][0131]
其中，t1、t2可互为苯环取代的邻位、对位和间位。
[0132]
3.根据项1或2所述的多肽，其特征在于所述t1、t2可同时为相同的结构或不同的结构。
[0133]
4.根据项1-3任一项所述的多肽，其特征在于所述l可通过式v化合物中-br与cys上的巯基发生取代反应得到；
[0134][0135]
5.根据项4所述的多肽，其特征在于z1或z2为直链或支链烷基或缺失。
[0136]
6.根据项4或5所述的多肽，其特征在于-z
1-br、-z
2-br可互为苯环取代的邻位、对位和间位。
[0137]
7.根据项4-6任一项所述的多肽，其特征在于-z
1-br、-z
2-br可同时为相同的结构或不同的结构。
[0138]
8.根据项4-7任一项所述的多肽，其特征在于所述式v化合物选自1，2-二(溴甲基)苯，1，3-二(溴甲基)苯或1，4-二(溴甲基)苯，优选1，3-二(溴甲基)苯。
[0139]
9.根据项1-8任一项所述的多肽，其特征在于所述r1选自乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基，庚酰基，甲基庚酰基，辛酰基，甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，十八烷酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。
[0140]
10.根据项1-9任一项所述的多肽，其特征在于所述xaa1为dab。
[0141]
11.根据项1-10任一项所述的多肽，其特征在于所述xaa2为thr。
[0142]
12.根据项1-11任一项所述的多肽，其特征在于所述xaa3为dab。
[0143]
13.根据项1-12任一项所述的多肽，其特征在于所述xaa4为dab。
[0144]
14.根据项1-13任一项所述的多肽，其特征在于所述xaa5为d-leu或d-phe。
[0145]
15.根据项1-14任一项所述的多肽，其特征在于所述xaa6为leu。
[0146]
16.根据项1-15任一项所述的多肽，其特征在于所述xaa7为dab。
[0147]
17.根据项1-16任一项所述的多肽，其特征在于所述xaa8为dab。
[0148]
18.根据项1-17任一项所述的多肽，其特征在于所述多肽的结构通式为式iii所示：
[0149][0150]
其中，l为环化连接基团，具有式ii所示的结构通式，
[0151][0152]
t1、t2可互为苯环取代的邻位、对位和间位；
[0153]
r1选自乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基，庚酰基，甲基庚酰基，辛酰基，甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，十八烷酸酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。
[0154]
19.根据项18所述的多肽，其特征在于所述多肽的结构通式为式ⅳ所示：
[0155][0156]
20.根据项1所述的多肽，其特征在于所述多肽的结构通式为r
1-dab-thr-dab-cys-dab-d-leu-leu-dab-dab-cys-nh2，
[0157]
其中，r1选自乙酰基，丙酰基，丁酰基，戊酰基，己酰基，庚酰基，甲基庚酰基，辛酰基，甲基辛酰基，癸酰基，月桂酰基，肉豆蔻酰基，棕榈酰基，十八烷酸酰基，4'-(叔丁基)-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-氯-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-异丁基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基，4'-乙基-3-甲基-[1,1'-联苯]-4-甲酰基或2-(4-异丁基苯基)-4-甲基噻唑-5-甲酰基中的一种，或缺失。
[0158]
21.根据项1-20任一项所述的多肽，其特征在于所述多肽为lamp-1、lamp-2、lamp-3、lamp-4、lamp-5、lamp-6、lamp-7、lamp-8、lamp-9、lamp-10、lamp-11、lamp-12、lamp-13、lamp-14、lamp-15、lamp-16、lamp-17、lamp-18、lamp-19、lamp-20、lamp-21、lamp-22、lamp-23、lamp-24、lamp-25、lamp-26、lamp-27、lamp-28、lamp-29、lamp-30、lamp-31、lamp-32、lamp-33、lamp-34、lamp-35、lamp-36、lamp-37、lamp-38、lamp-39、lamp-40、lamp-41、lamp-42、lamp-43、lamp-44、lamp-45。
[0159]
22.项1-21任一项所述多肽的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
[0160]
(1)采用树脂载体固相合成方法合成多肽的氨基酸主链；
[0161]
(2)将步骤(1)的产物用强酸进行裂解；加入侧链保护基清除剂，过滤，有机溶剂沉淀多肽，离心，洗涤沉淀，干燥，得到粗肽。
[0162]
(3)可选择的，将步骤(2)所得粗肽与环化试剂进行环化反应，得到环化多肽。
[0163]
23.根据项22所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中树脂载体选自wang树脂、2-ctc树脂或rink amide mbha树脂中的一种。
[0164]
24.根据项22或23所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)中固相多肽合成中可对部分氨基酸的侧链可以引入化学基团进行保护。
[0165]
25.根据项22-24任一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(1)包括：
[0166]
(a)溶剂浸泡树脂—投料(首个氨基酸)—测定树脂取代值—脱除氨基保护基—溶剂洗涤—监测—偶联氨基酸—监测—溶剂洗涤—脱除氨基保护基—顺序偶联剩余氨基酸—直到最后一个氨基酸脱除氨基保护基并洗涤；
[0167]
(b)最后偶联r1—监测—洗涤。
[0168]
26.根据项25所述的制备方法，其特征在于所述步骤(a)中氨基保护基选自叔丁氧羰基、苄氧羰基(z)或9-芴基-甲氧羰基，优选9-芴基-甲氧羰基。
[0169]
27.根据项25或26所述的制备方法，其特征在于所述步骤(a)溶剂选自：dmf、dcm或nmp，优选dmf或dcm。
[0170]
28.根据项25-27任一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(a)中脱除氨基保护基的脱除剂为哌啶/dmf(pip)。
[0171]
29.根据项25-28任一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(a)中脱除氨基保护基的脱除剂选自哌啶/dmf(pip)的浓度为10-40％，优选浓度为20-25％。
[0172]
30.根据项25-29任一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(a)中脱除氨基保护基的脱除时间为20-50min，优选脱除时间为25-35min。
[0173]
31.根据项25-30任一项所述的制备方法，其特征在于所述步骤(a)中顺序偶联剩余氨基酸步骤需要加入偶联试剂，所述偶联试剂选自碳二亚胺型试剂、苯并三氮唑鎓盐型试剂或1-羟基苯并三唑中的一种或两种组合。
[0174]
32.根据项31所述的制备方法，其特征在于所述碳二亚胺型试剂选自二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺或n-二氨基丙基-n-乙基碳二亚胺中的一种。
[0175]
33.根据项31所述的制备方法，其特征在于所述苯并三氮唑鎓盐型试剂选自2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯、o-苯并三唑-n,n,n',n'-四甲基脲六氟磷酸盐、六氟磷酸苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷或六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷中的一种。
[0176]
34.根据项31所述的制备方法，其特征在于所述偶联试剂选自二异丙基碳二亚胺与1-羟基苯并三唑组成的混合试剂，或2-(1h-苯并三偶氮l-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯与1-羟基苯并三唑组成的混合试剂，进一步优选dic(二异丙基碳二亚胺)与1-羟基苯并三唑组成的混合试剂。
[0177]
35.根据项25-34任一项所述的制备方法，其特征在于步骤(a)中所述的“监测”采用茚三酮检测法监测多肽的缩合反应。
[0178]
36.根据项25-35任一项所述的制备方法，其特征在于步骤(b)中所述的偶联r1是将步骤(a)所得多肽中氨基与脂肪酸羧基形成酰胺键。
[0179]
37.根据项22-36任一项所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的侧链保护基清除剂选自茴香硫醚、三异丙基硅烷、苯酚、水、1,2-乙二硫醇或间甲酚中的一种、两种或几种组合，并与三氟乙酸或氢氟酸按5-20％进行配制得到。
[0180]
38.根据项25-37任一项所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中所述的侧链保护基清除剂为三氟乙酸(tfa)：三异丙基硅烷：水的混合试剂，体积比为95:2.5:2.5。
[0181]
39.根据项25-35任一项所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述的环化反应需加入环化试剂，其中环化试剂选自1，2-(二溴甲基)苯、1，3-(二溴甲基)苯、1，4-(二溴甲基)苯或其他溴烷基取代的苯试剂中的一种或几种组合，优选1，2-(二溴甲基)苯、1，3-(二溴甲基)苯或1，4-(二溴甲基)苯，进一步优选1，3-(二溴甲基)苯。
[0182]
40.项1-21任一项所述的多肽在制备抑菌或抗菌物质中的用途。
[0183]
41.根据项40所述的用途，其特征在于所述菌为细菌或真菌。
[0184]
42.根据项40或41所述的用途，其特征在于所述菌为鲍曼不动杆菌，铜绿假单胞菌，耐药铜绿假单胞菌，枯草芽孢杆菌，金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，和/或白色念珠菌中的一种或几种，更优选地，是铜绿假单胞菌，耐药鲍曼不动杆菌、耐药铜绿假单胞菌。
[0185]
43.项1-21任一项所述的多肽在制备治疗或预防细菌或真菌引起的疾病的药物中的用途。
具体实施方案
[0186]
本技术的化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本技术的实施例。
[0187]
本技术具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本技术的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本技术的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。
[0188]
以下实施例仅代表本发明阐述的一个方面，不是本发明主题的局限。
[0189]
实施例一：lamp-1的制备与纯化
[0190]
结构式：
[0191][0192]
(1)材料及试剂
[0193]
rink amide mbha树脂，取代值0.47mmol/g。
[0194]
氨基酸为：fmoc-cys(trt)-oh，fmoc-dab(boc)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-d-leu-oh，fmoc-thr(tbu)-oh。
[0195]
合成试剂：hobt，dic，dmf，dcm，哌啶。
[0196]
(2)仪器
[0197]
cs-bio型多肽合成仪、waters600半制备型高效液相色谱仪、beckman离心机、buchi旋蒸仪。
[0198]
(3)操作步骤(以0.4mmol为例)
[0199]
a.固相化学合成多肽
[0200]
称取rink amide mbha树脂0.85g，置于多肽合成仪反应器中，加入10ml dcm，浸泡1h，排干溶剂，加入20％pip/dmf溶液15ml，混合20min脱除氨基保护基，dmf洗涤树脂6次；称取三倍量的fmoc-cys(trt)-oh，dic，hobt加入10ml dmf溶解后，投入反应器中进行反应，反应温度为室温，反应时间为1h，以茚三酮反应监测反应进程，监测为蓝紫色则表示缩合反应不完全，无色则为反应完成，然后用dmf洗涤树脂6次；随后加入20％pip/dmf溶液15ml，混合20min脱除氨基保护基，dmf洗涤树脂6次，此时茚三酮检测为蓝紫色。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成。
[0201]
b.裂解及沉淀
[0202]
肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照10ml裂解试剂/1g树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为tfa:三异丙基硅烷:水＝95：2.5：2.5(v:v:v)，室温搅拌反应3小时，抽滤。向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清后，以冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。
[0203]
c.液相中反应制备环肽
[0204]
称取干燥后的粗肽28.68mg(约0.03mmol)，加入2ml水溶解；用碳酸氢铵将ph值调至7～8；称取14.39mg(摩尔量)环化试剂1，3-二(溴甲基)苯于溶液中，加入四氢呋喃(thf)使溶液澄清，室温下反应0.5h。
[0205]
d.分离纯化
[0206]
用半制备型rp-hplc，对粗肽进行纯化。
[0207]
1.纯化
[0208]
色谱柱：ymc-pack ods-a-hg c18制备柱(10mm
×
250mm,10μm)
[0209]
流速：5ml/min
[0210]
检测波长：215nm、280nm
[0211]
流动相：a相：0.05％hac/水溶液
[0212]
b相：0.05％hac/乙腈
[0213]
梯度洗脱程序如表4：
[0214]
表4梯度洗脱表
[0215]
[0216]
2.分析
[0217]
用thermo u3000型hplc，对收集产物进行分析
[0218]
色谱柱：kromasil c18分析柱(4.6mm
×
250mm,5μm)
[0219]
流速：1ml/min
[0220]
检测波长：210nm
[0221]
流动相：a相：0.05％tfa/水
[0222]
b相：0.05％tfa/乙腈
[0223]
梯度洗脱程序如表5：
[0224]
表5梯度洗脱表
[0225][0226]
收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸除去乙腈，真空冷冻干燥。经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1154.31(m h)

与理论分子量相符。
[0227]
实施例二：lamp-16的制备与纯化
[0228]
结构式
[0229][0230]
(1)材料及试剂
[0231]
rink amide mbha树脂，取代值0.47mmol/g。
[0232]
氨基酸为：fmoc-cys(trt)-oh，fmoc-dab(boc)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-d-leu-oh，fmoc-thr(tbu)-oh。
[0233]
合成试剂：hobt，dic，dmf，dcm，哌啶，正辛酸。
[0234]
(2)仪器
[0235]
cs-bio型多肽合成仪、waters600半制备型高效液相色谱仪、beckman离心机、buchi旋蒸仪。
[0236]
(3)操作步骤(以0.4mmol为例)
[0237]
a.固相化学合成多肽
[0238]
称取rink amide mbha树脂0.85g，置于多肽合成仪反应器中，加入10ml dcm，浸泡1h，加入20％pip/dmf溶液15ml，混合20min脱除氨基保护基，dmf洗涤树脂6次；称取三倍量的fmoc-cys(trt)-oh，dic，hobt加入10ml dmf溶解后，投入反应器中进行反应，反应温度为
室温，反应时间为1h，以茚三酮反应监测反应进程，监测为蓝紫色则表示缩合反应不完全，无色则为反应完成，然后用dmf洗涤树脂6次；随后加入20％pip/dmf溶液15ml，混合20min脱除氨基保护基，dmf洗涤树脂6次，此时茚三酮检测为蓝紫色。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成；最后量取3倍量的正辛酸、hobt及dic，加入10ml dmf/dcm(1:1)混合溶剂并投入反应器中进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，最后用dcm洗涤树脂6次。
[0239]
b.裂解及沉淀
[0240]
肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照10ml裂解试剂/1g树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为tfa:三异丙基硅烷:水＝95:2.5:2.5(v:v:v)，室温搅拌反应3小时，抽滤。向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清后，以冰乙醚反复洗涤沉淀4-5次，真空干燥，称重粗肽。
[0241]
c.液相中反应制备环肽
[0242]
称取干燥后的粗肽56.04mg(约0.05mmol)，加入3ml水溶解；称取25.09mg(摩尔量)环化试剂1，3-二(溴甲基)苯于溶液中，加入四氢呋喃(thf)使溶液澄清，室温下反应0.5h。
[0243]
d.分离纯化
[0244]
用半制备型rp-hplc，对粗肽进行纯化。
[0245]
1.纯化
[0246]
色谱柱：ymc-pack ods-a-hg c18制备柱(10mm
×
250mm,10μm)
[0247]
流速：5ml/min
[0248]
检测波长：215nm、280nm
[0249]
流动相：a相：0.05％hac/水溶液
[0250]
b相：0.05％hac/乙腈
[0251]
梯度洗脱程序如表6:
[0252]
表6梯度洗脱表
[0253][0254]
2.分析
[0255]
用thermo u3000型hplc，对收集产物进行分析
[0256]
色谱柱：kromasil c18分析柱(4.6mm
×
250mm,5μm)
[0257]
流速：1ml/min
[0258]
检测波长：210nm
[0259]
流动相：a相：0.05％tfa/水
[0260]
b相：0.05％tfa/乙腈
[0261]
梯度洗脱程序如表7:
[0262]
表7梯度洗脱表
[0263][0264][0265]
收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸除去乙腈，真空冷冻干燥。经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1279.59(m h)

与理论分子量相符。
[0266]
实施例三：lamp-10的制备及纯化
[0267]
结构式
[0268][0269]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1195.47(m h)

与理论分子量为相符。
[0270]
实施例四：lamp-11的制备及纯化
[0271]
结构式
[0272][0273]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1209.37(m h)

与理论分子量为相符。
[0274]
实施例五：lamp-12的制备及纯化
[0275]
结构式
[0276][0277]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1223.63(m
h)

与理论分子量为相符。
[0278]
实施例六：lamp-13的制备及纯化
[0279]
结构式
[0280][0281]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1238.55(m h)

与理论分子量为相符。
[0282]
实施例七：lamp-14的制备及纯化
[0283]
结构式
[0284][0285]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1251.76(m h)

与理论分子量为相符。
[0286]
实施例八：lamp-15的制备及纯化
[0287]
结构式
[0288][0289]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1266.58(m h)

与理论分子量为相符。
[0290]
实施例九：lamp-17的制备及纯化
[0291]
结构式
[0292][0293]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1279.61(m h)

与理论分子量为相符。
[0294]
实施例十：lamp-18的制备及纯化
[0295]
结构式
[0296][0297]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1293.75(m h)

与理论分子量为相符。
[0298]
实施例十一：lamp-19的制备及纯化
[0299]
结构式
[0300][0301]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1307.49(m h)

与理论分子量为相符。
[0302]
实施例十二：lamp-20的制备及纯化
[0303]
结构式
[0304][0305]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1335.43(m h)

与理论分子量为相符。
[0306]
实施例十三：lamp-21的制备及纯化
[0307]
结构式
[0308][0309]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1363.55(m h)

与理论分子量为相符。
[0310]
实施例十四：lamp-22的制备及纯化
[0311]
结构式
[0312]
[0313]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝11391.30(m h)

与理论分子量为相符。
[0314]
实施例十五：lamp-24的制备及纯化
[0315]
结构式
[0316][0317]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1404.91(m h)

与理论分子量为相符。
[0318]
实施例十六：lamp-25的制备及纯化
[0319]
结构式
[0320][0321]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1381.21(m h)

与理论分子量为相符。
[0322]
实施例十七：lamp-26的制备及纯化
[0323]
结构式
[0324][0325]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1403.71(m h)

与理论分子量为相符。
[0326]
实施例十八：lamp-27的制备及纯化
[0327]
结构式
[0328][0329]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1347.18(m h)

与理论分子量为相符。
[0330]
实施例十九：lamp-28的制备及纯化
[0331]
结构式
[0332][0333]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1375.73(m h)

与理论分子量为相符。
[0334]
实施例二十：lamp-29的制备及纯化
[0335]
结构式
[0336][0337]
制备过程如实施例2中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1410.07(m h)

与理论分子量为相符。
[0338]
实施例二十一：lamp-32的制备与纯化
[0339]
结构式
[0340][0341]
(1)材料及试剂
[0342]
rink amide mbha树脂，取代值0.47mmol/g。
[0343]
氨基酸为：fmoc-cys(trt)-oh，fmoc-dab(boc)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-d-leu-oh，fmoc-thr(tbu)-oh。
[0344]
合成试剂：hobt，dic，dmf，dcm，哌啶，正辛酸。
[0345]
(2)仪器
[0346]
cs-bio型多肽合成仪、waters600半制备型高效液相色谱仪、beckman离心机、buchi旋蒸仪。
[0347]
(3)操作步骤(以0.4mmol为例)
[0348]
a.固相化学合成多肽
[0349]
称取rink amide mbha树脂0.85g，置于多肽合成仪反应器中，加入10ml dcm，浸泡1h，加入20％pip/dmf溶液15ml，混合20min脱除氨基保护基，dmf洗涤树脂6次；称取三倍量的fmoc-cys(trt)-oh，dic，hobt加入10ml dmf溶解后，投入反应器中进行反应，反应温度为室温，反应时间为1h，以茚三酮反应监测反应进程，监测为蓝紫色则表示缩合反应不完全，无色则为反应完成，然后用dmf洗涤树脂6次；随后加入20％pip/dmf溶液15ml，混合20min脱除氨基保护基，dmf洗涤树脂6次，此时茚三酮检测为蓝紫色。当第一个氨基酸偶联到树脂上后，即可按照上述方法继续进行下一个氨基酸的偶联反应，如此循环，直至全部氨基酸偶联完成；最后量取3倍量的正辛酸、hobt及dic，加入10ml dmf/dcm(1:1)混合溶剂并投入反应器中进行反应，反应温度为室温，以茚三酮反应监测反应进程，监测无色则为反应完成，最后用dcm洗涤树脂6次。
[0350]
b.裂解及沉淀
[0351]
肽合成结束后，真空干燥树脂，称重。按照10ml裂解试剂/1g树脂的比例加入裂解试剂，试剂配比为tfa:三异丙基硅烷:水＝95：2.5：2.5(v:v:v)，室温搅拌反应3小时，抽滤。向裂解抽滤液中加入10倍体积的冰乙醚沉淀多肽，离心，弃上清后，以冰乙醚反复洗涤沉淀4～5次，真空干燥，称重粗肽。
[0352]
c.分离纯化
[0353]
用半制备型rp-hplc，对粗肽进行纯化。
[0354]
1.纯化
[0355]
色谱柱：ymc-pack ods-a-hg c18制备柱(10mm
×
250mm,10μm)
[0356]
流速：5ml/min
[0357]
检测波长：215nm、280nm
[0358]
流动相：a相：0.05％hac/水溶液
[0359]
b相：0.05％hac/乙腈
[0360]
梯度洗脱程序如表8:
[0361]
表8梯度洗脱表
[0362][0363]
2.分析
[0364]
用thermo u3000型hplc，对收集产物进行分析
[0365]
色谱柱：kromasil c18分析柱(4.6mm
×
250mm,5μm)
[0366]
流速：1ml/min
[0367]
检测波长：210nm
[0368]
流动相：a相：0.05％tfa/水
[0369]
b相：0.05％tfa/乙腈
[0370]
梯度洗脱程序如表9:
[0371]
表9梯度洗脱表
[0372][0373]
收集纯度大于90％的目标组分，旋蒸除去乙腈，真空冷冻干燥。经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1178.61(m h)

与理论分子量相符。
[0374]
实施例二十二：lamp-30的制备及纯化
[0375]
结构式
[0376][0377]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1164.60(m h)

与理论分子量为相符。
[0378]
实施例二十三：lamp-31的制备及纯化
[0379]
结构式
[0380][0381]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1164.60(m h)

与理论分子量为相符。
[0382]
实施例二十四：lamp-33的制备及纯化
[0383]
结构式
[0384][0385]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1178.63(m h)

与理论分子量为相符。
[0386]
实施例二十五：lamp-34的制备及纯化
[0387]
结构式
[0388][0389]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1192.24(m h)

与理论分子量为相符。
[0390]
实施例二十六：lamp-35的制备及纯化
[0391]
结构式
[0392][0393]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1205.83(m h)

与理论分子量为相符。
[0394]
实施例二十七：lamp-36的制备及纯化
[0395]
结构式
[0396][0397]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1233.57(m h)

与理论分子量为相符。
[0398]
实施例二十八：lamp-37的制备及纯化
[0399]
结构式
[0400][0401]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1261.93(m h)

与理论分子量为相符。
[0402]
实施例二十九：lamp-38的制备及纯化
[0403]
结构式
[0404][0405]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1289.95(m h)

与理论分子量为相符。
[0406]
实施例三十：lamp-40的制备及纯化
[0407]
结构式
[0408][0409]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1302.77(m h)

与理论分子量为相符。
[0410]
实施例三十一：lamp-41的制备及纯化
[0411]
结构式
[0412][0413]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1281.10(m h)

与理论分子量为相符。
[0414]
实施例三十二：lamp-42的制备及纯化
[0415]
结构式
[0416][0417]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1302.77(m h)

与理论分子量为相符。
[0418]
实施例三十三：lamp-43的制备及纯化
[0419]
结构式
[0420][0421]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1246.66(m h)

与理论分子量为相符。
[0422]
实施例三十四：lamp-44的制备及纯化
[0423]
结构式
[0424][0425]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1274.71(m h)

与理论分子量为相符。
[0426]
实施例三十五：lamp-45的制备及纯化
[0427]
结构式
[0428][0429]
制备过程如实施例21中所述的方法，经esi-ms进行分子量确证，m/z＝1309.78(m h)

与理论分子量为相符。
[0430]
实施例三十六：表9中其余lamp系列抗菌肽的制备及纯化
[0431]
(1)材料及试剂
[0432]
rink amide mbha树脂，取代值0.47mmol/g。
[0433]
氨基酸为:fmoc-cys(trt)-oh，fmoc-dab(boc)-oh，fmoc-leu-oh，fmoc-d-leu-oh，fmoc-thr(tbu)-oh，fmoc-aib-oh。
[0434]
试剂：hobt，dic，dmf，哌啶，正己酸，癸酸，月桂酸，棕榈酸，十八烷酸。
[0435]
(2)仪器
[0436]
cs-bio型多肽合成仪、waters600半制备型高效液相色谱仪、beckman离心机、buchi旋蒸仪。
[0437]
(3)操作步骤(以0.4mmol为例)
[0438]
以类似实施例1中操作步骤a-c的方法制备及纯化表7中的多肽，若为带脂肪链多肽则按照实施例2中的操作步骤a-c进行制备，收集纯度大于90％的部分，旋蒸，冷冻干燥。esi-ms测定值如表10所示。
[0439]
表10多黏菌素类似物及其分子量
[0440][0441]
实施例三十七：体外抗菌活性测定
[0442]
根据美国临床实验室标准化委员会(nccls)推荐的微量肉汤稀释法测定各抗菌肽的最低抑菌浓度(mic)，细菌培养基采用mueller-hinton(mh)肉汤培养基。
[0443]
具体步骤为：
[0444]
(1)抗菌药物贮存液制备：
[0445]
精确配制浓度为640μg/ml的上述抗菌肽和80μg/ml阳性对照品硫酸多黏菌素e及盐酸万古霉素。配制好的各贮存液置于－20℃环境中保存备用。
[0446]
(2)培养基的配制：
[0447]
称取mh肉汤培养基24g，溶于蒸馏水中并定容至1l，121℃高温灭菌30min。
[0448]
(3)接种物的制备：
[0449]
用接种环挑取形态相似待检菌落3～5个，接种于4～5ml的mh肉汤中，35℃孵育12
～16h。处于对数生长期得到菌液用mh肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，约含1～2
×
108cfu/ml。用mh肉汤将上述菌悬液进行1：1000稀释后备用。
[0450]
(4)稀释抗菌药物的制备及菌液接种：
[0451]
取一块96孔板，在第1孔中加入160μl mh肉汤，第2-12孔中各加入100μl mh肉汤，然后向第1孔加入抗菌药物原液(640μg/ml)40μl，混匀，接着吸取100μl至第2孔，混匀后再从第2孔中吸取100μl至第3孔，如此连续倍比稀释至第10孔，并从第10孔中吸取100μl弃去，然后向第1-10孔及第12孔中加入上述制备好的接种物各100μl，使每孔最终菌液浓度约为0.5
×
105cfu/ml。第1-10孔药物浓度分别为64μg/ml、32μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml，第11孔为不含抗菌药物及接种物的空白对照，第12孔为不含抗菌药物的阴性对照。
[0452]
(5)孵育
[0453]
接种细菌的96孔板置于37℃普通空气孵箱中孵育16～20h。
[0454]
(6)结果
[0455]
以肉眼观察，无细菌生长的最低药物浓度即为该样品的最低抑菌浓度(mic)。各抗菌肽的mic测定结果如表11所示。
[0456]
表11化合物抗菌活性mic测定结果
[0457]
[0458][0459]
根据本发明所公开的内容，在此所公开并要求保护的所有组合物和/或方法均无需进行过多实验即可进行制备和实施。虽然根据优选实施方案对本发明的组合物和方法进行了描述，但对本领域技术人员而言，在不背离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对在此所述的组合物和/或方法以及所述方法的步骤或步骤的顺序进行改变。
[0460]
本文所引用的所有文献的公开内容通过引用结合于此，引用程度为，他们提供示例性的、程序上和其他的细节补充本文所述内容。