产生苄基异喹啉生物碱的微生物及其制备和使用方法与流程

产生苄基异喹啉生物碱的微生物及其制备和使用方法
1.本技术是申请号为201480027961.x、申请日为2014年3月14日、发明名称为“产生苄基异喹啉生物碱(bia)的微生物及其制备和使用方法”的中国发明专利申请的分案申请，原申请为国际申请号为pct/us2014/027833的国家阶段申请，该国际申请要求2013 年3月15日提交的美国临时专利申请第61/788,560号的优先权。
2.政府权利
3.本发明按照由美国国家科学基金会授予的编号为1066100的合同以及由美国国立卫生研究院授予的编号为at007886的合同在政府支持下进行。政府对本发明具有某些权利。
4.相关申请的交叉引用
5.根据35u.s.c.
§
119(e)，本技术要求2013年3月15日提交的、序列号为61/788,560的美国临时专利申请的申请日的优先权；该申请的公开内容通过引用并入本文。


背景技术：

6.苄基异喹啉生物碱(bia)是一大组来自植物和其他生物的次级代谢物。这些分子在人体中具有治疗功能，其范围从吗啡和可待因的已确定的镇痛及止咳性质到对于诸如小檗碱和血根碱等分子观察到的对抗癌症和感染的新活性。供应所有这些bia分子以使得它们可被研究人员和医生获得是有意义的。合成反应的数目和对选择性立体化学的需求意味着bia的化学合成是低产的，并且不是用于大规模生产的可行手段。相反，对于广泛使用的药物可待因和吗啡，鸦片罂粟(罂粟(papaver somniferum))已被培育并发展为生产作物。由于植物代谢演变为使得通往最终的阿片样物质的途径通量最大化，因此吗啡生物合成中的可用作药物和药物前体的中间体并不累积。即使对于终产物代谢物如吗啡，累积也仅在芽和维管组织的特化细胞内发生，并且需要在提取过程中对收获的植物材料进行严苛的化学处理，这通常产生按干重计少于2％的吗啡。


技术实现要素：

7.本发明的方面包括被工程为产生苄基异喹啉生物碱(bia)的宿主细胞。该宿主细胞包含参与宿主细胞从起始化合物到bia的合成途径的多种酶的异源编码序列。该异源编码序列可来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物，且该异源编码序列的多个拷贝可存在于宿主细胞中。在一些实施方案中，该宿主细胞选自产生牛心果碱的宿主细胞、产生血根碱前体的宿主细胞、产生原小檗碱的宿主细胞、产生蒂巴因的宿主细胞和产生阿片的宿主细胞。还提供了通过在促进由宿主细胞的异源编码序列所编码的酶的活性的培养条件下培养宿主细胞来产生感兴趣的bia的方法。本发明的方面进一步包括可在本发明的方法中使用的组合物，例如，宿主细胞、起始化合物和试剂盒等。
附图说明
8.当与附图一起阅读时，能够从下文的具体实施方式部分最佳地理解本发明。需要
强调，根据惯例，附图的各种特征不是按比例的。相反，为清楚起见，各特征的尺寸是任意扩大或减小的。附图中包括以下的图。
9.图1描绘了来自罂粟和黄唐松草(thalictrum flavum)的甲基转移酶对全去甲劳丹碱的体内甲基化，以及通过液相色谱法-质谱法(lcms)对甲基化产物的检测。
10.图2描绘了从全去甲劳丹碱至牛心果碱的替代甲基化路径。
11.图3描绘了从去甲基乌药碱至牛心果碱的替代甲基化路径。
12.图4描绘了用于从牛心果碱产生血根碱的生物合成步骤。
13.图5描绘了从牛心果碱至小檗碱的感兴趣的生物合成途径。
14.图6描绘了附加型基因拷贝数和各种细胞色素p450-nadph还原酶的表达对酵母培养物中的原小檗碱产生的影响。
15.图7描绘了微生物从全去甲劳丹碱产生小檗碱。
16.图8描绘了从牛心果碱至蒂巴因的生物合成途径或其产物。
17.图9描绘了沙罗泰里啶还原酶(salr)和沙罗泰里啶醇(salutaridinol)7-o-乙酰基转移酶(salat)变体的组合在产生蒂巴因的菌株中的结果。
18.图10描绘了遗传构建体的设计，该遗传构建体提高启动子活性并防止共有序列相似性的两种基因(即，t6odm和codm)的不稳定性。
19.图11描绘了工程设计在酿酒酵母中由前体分子全去甲劳丹碱经由分支点中间体牛心果碱而生物合成原小檗碱和前托品生物碱的路径。最终的工程化前托品生产菌株含有11个异源表达盒(7种整合的酶和4种由酵母人工染色体表达的酶)，包括细胞色素450 (ecsts、psmsh、eccfs)、细胞色素p450还原酶(atr1)和其他酶类别(ps6omt、 pscnmt、ps4’omt、psbbe、pstnmt)。
20.图12描绘了(s)-碎叶紫堇碱的微生物产生。(a)描述全去甲劳丹碱至(s)-碎叶紫堇碱的转化的示意图。(b)供以全去甲劳丹碱的酵母菌株的生长培养基的lc-ms分析，显示载体对照菌株(左图)产生金黄紫堇碱(峰3，m/z＝328)。当表达eccfs酶(右图)时，检测到代谢物碎叶紫堇碱(m/z＝326，峰4)，通过ms-ms裂解(fragmentation)得到证实(下图)。(c)利用各种酶变体和细胞色素p450 nadph还原酶配偶体配对的(s)
‑ꢀ
碎叶紫堇碱产生。(d)p450表达水平导致截然不同的er形态。在高拷贝(上图)或低拷贝(中间图)质粒上在c-末端用gfp标记的eccfs定位于内质网，但显示截然不同的er增生的形态。为了比较显示了野生型er(没有异源p450表达)(下图)。(e)cfs 的稳定表达改善了碎叶紫堇碱的产生和金黄紫堇碱的转化效率。(f)启动子选择影响cfs 活性。在5种不同启动子的控制下利用ura选择从低拷贝质粒表达eccfs。
21.图13描绘了(s)-刺罂粟碱的产生的优化。(a)描绘全去甲劳丹碱至(s)-刺罂粟碱的转化的示意图。(b)供以2mm全去甲劳丹碱的酵母菌株的生长培养基的lc-ms分析，显示载体对照菌株产生碎叶紫堇碱(峰4，m/z＝326)。当表达ecsts酶时，通过与标准比较检测到刺罂粟碱(峰5，m/z＝324)。(c)刺罂粟碱的产生随着由单独的低拷贝质粒表达的cfs和sts的物种变体的组合而变化。(d)工程酵母菌株在25℃下的生长提高了 sts活性。(e)cfs和sts的基因拷贝数影响刺罂粟碱产生。
22.图14描绘了异源前托品生物合成途径的工程化。(a)描绘全去甲劳丹碱至前托品的转化的示意图。(b)供以2mm全去甲劳丹碱的酵母菌株的生长培养基的lc-ms分析，显示载
putida) m10的mora吗啡脱氢酶和morb吗啡还原酶引入异源途径，酵母中蒂巴因的延伸转化。
29.图21描绘了用于产生多种阿片样物质的优化酵母菌株。(a)在封闭分批发酵后在培养基中的总阿片样物质分子浓度。酵母菌株csy950、csy951和csy952(表4)分别针对吗啡、氢吗啡酮和氢可酮/羟考酮的产生进行优化。指出的菌株在补充有1mm蒂巴因(等同于311mg/l)的培养基中在封闭分批发酵下培养。在发酵结束时通过lc-ms分析培养基的一组阿片样物质。(b)对于酵母菌株csy952的发酵，作为时间的函数的关键阿片样物质(氢可酮、二氢可待因和羟考酮)的细胞密度和浓度。在指定的时间点，取样、稀释并通过光谱法分析细胞密度及通过lc-ms分析阿片样物质产量。
30.图22描绘了由工程酵母菌株分泌到培养基中的代谢物的液相色谱法串联质谱法(lcms) 分析。该菌株表达罂粟t6odm、cor1.3和codm并在蒂巴因的存在下培养96小时。 lcms峰1-5对应于可待因酮、可待因、尼奥品、吗啡和neomorphine的ms2裂解图案。
31.图23描绘了由表达来自罂粟和恶臭假单胞菌m10的酶的工程酵母菌株分泌到培养基中的代谢物的lcms分析。菌株csy946(表达t6odm和morb)和csy945(表达t6odm、 codm、mora和morb)在蒂巴因的存在下培养96小时。lcms峰6-11对应于氢可酮、羟考酮、氢吗啡酮、二氢可待因、14-羟基可待因和二氢吗啡。
32.详述
33.如上面总结的，本发明的方面包括工程化为产生苄基异喹啉类生物碱(bia)的宿主细胞。该宿主细胞包括参与从起始化合物至宿主细胞的bia的合成途径的多种酶的异源编码序列。在一些实施方案中，该宿主细胞选自产生牛心果碱的宿主细胞、产生血根碱前体的宿主细胞、产生原小檗碱的宿主细胞、产生蒂巴因的宿主细胞和产生阿片的宿主细胞。还提供了通过在促进由宿主细胞的异源编码序列编码的酶的表达的培养条件下培养宿主细胞产生感兴趣的bia的方法。
34.在更详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于描述的特定实施方案，因为这当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定的实施方案的目的，并非旨在限制，因为本发明的范围将仅由所附的权利要求来限制。
35.当提供值的范围时，应理解，本发明内包括在该范围的上限和下限之间的各居间值，精确至下限的单位的十分之一(除非上下文清楚地另外指出)，以及在该指定范围内的任何其他指定或居间值。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在所述较小范围内并且还包括在本发明内，服从在所指定的范围内任何特定地排除限值。当指定的范围包括限值的一个或两个时，排除那些包括的限值的一个或两个的范围也包括在本发明中。
36.一些范围在本文中以数值前加上术语“约”来呈现。术语“约”在本文中用于对其之后的确切数字以及接近或近似于该术语之后的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似于特定列举的数字中，接近或近似的未列举的数字可以是在其所提出的上下文中提供特定列举的数字的基本等效值的数字。
37.除非另外限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但现在描述代表性的说明性方法和材料。
38.本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同特定地且单独地
指出每个单独的出版物或专利均通过引入而并入，并通过引入而并入本文以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用都是为了其先于申请日的公开内容且不应解释为承认本发明由于先前发明而没有资格先于此出版物。此外，所提供的出版日期可能不同于实际的出版日期，实际的出版日期可能需要独立地加以确认。
39.应当指出，如在本文中和在所附权利要求中所用的，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数的指示物，除非上下文另外清楚地指出。应进一步指出，可以撰写权利要求以排除任何可选的元素。这样，此声明旨在用作与权利要求元素的列举相关的排他性术语如“单独”、“仅”等的使用或“否定”限定的使用的在先基础。
40.本领域技术人员在阅读本公开内容后将会明白，在不偏离本发明的范围或精神的情况下，本文描述和说明的各单独实施方案具有分立的组成成分和特征，其可以容易地与任意其他几个实施方案的特征分离或组合。任何描述的方法可以以描述的事件的顺序或在逻辑上可能的任意其他顺序进行。
41.苄基异喹啉类生物碱(bia)
42.本发明的方面包括产生被表征为苄基异喹啉类生物碱(bia)及其生物合成前体、中间体和代谢物的化合物的宿主细胞。多种bia、其生物合成前体、中间体和代谢物可以由本发明的宿主细胞产生，包括但不限于牛心果碱、血根碱、原小檗碱、小檗碱、苯菲啶生物碱、蒂巴因、阿片化合物、碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、顺式-n-甲基刺罂粟碱、沙罗泰里啶醇、沙罗泰里啶醇-7-o-乙酸酯、前托品和二氢血根碱、(s)-氢化小檗碱、东罂粟碱、可待因酮、尼奥品、neomorphine、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮、羟吗啡酮、二氢可待因、14-羟基可待因和二氢吗啡。
43.在宿主细胞中生成的合成途径可以起始于任何合适的化合物。感兴趣的起始化合物包括但不限于劳丹碱(laudanosoline)、甲基劳丹碱、全去甲劳丹碱、甲基全去甲劳丹碱、去甲基乌药碱、沙罗泰里啶、牛心果碱、酪胺、多巴胺、4-hpa、4-hppa、乌药碱、n
‑ꢀ
甲基乌药碱、3'-羟基-n-甲基乌药碱、金黄紫堇碱、四氢非洲防己碱、氢化小檗碱、劳丹碱、血根碱、蒂巴因、吗啡、可待因、可待因酮和二甲基四氢异喹啉，例如，6,7-二甲基
ꢀ‑
1-2-3-4-四氢异喹啉或可以正常存在或可以不正常存在于内源bia途径中的另外的化合物。在某些实施方案中，起始化合物是牛心果碱、全去甲劳丹碱或去甲基乌药碱。因此，起始物质可以是非天然存在的或者起始物质可以是天然存在的。基于宿主细胞中存在的合成途径，其他化合物也可以用作所需合成途径中的起始物质。起始物质的来源可以来自宿主细胞本身，例如酪氨酸，或者起始物质可以从外部来源添加或补充至宿主细胞。例如，如果宿主细胞在液体培养物(体内环境)中生长，细胞培养基可以补充有起始物质，例如酪氨酸或全去甲劳丹碱，该起始物质被转运至细胞内并转化为所需产物。
44.宿主细胞
45.如上总结的，本发明的一个方面是产生一种或多种bia的宿主细胞。任何合适的类型的宿主细胞可以用于产生本发明的产生bia的细胞，参见，例如us2008/0176754，其公开内容通过引用而全文并入。在一些情况下，该宿主细胞是酵母。在一些情况下，该宿主细胞来源于被工程化成产生感兴趣的bia的酵母菌株。在一些实施方案中，该宿主细胞选自产生牛心果碱的宿主细胞、产生血根碱前体的宿主细胞、产生原小檗碱的宿主细胞、产生蒂巴因的宿主细胞和产生阿片的宿主细胞。
46.任何合适的细胞可以在本宿主细胞和方法中使用。在一些情况下，该宿主细胞是非植物细胞。在一些情况下，该宿主细胞是昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞或酵母细胞。感兴趣的宿主细胞包括但不限于细菌细胞，例如枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、大肠杆菌(escherichia coli)、链霉菌属(streptomyces)和鼠伤寒沙门氏菌(salmonellatyphimuium)，和昆虫细胞，如黑腹果蝇(drosophila melanogaster)s2和草地贪夜蛾 (spodoptera furgperda)sf9细胞。在一些实施方案中，该宿主细胞是酵母细胞或大肠杆菌细胞。在某些实施方案中，该酵母细胞可以是酿酒酵母(s.cerevisiae)种的酵母细胞。酵母作为宿主细胞是令人感兴趣的，因为参与一些感兴趣的生物合成途径的细胞色素p450蛋白质能够适当地折叠到内质网膜中，使得它们的活性得以保持。可用于本发明的感兴趣的酵母菌株包括但不限于由smolke等人在us2008/0176754(其公开内容通过引用全文并入)中描述的那些，例如cen.pk(基因型：mata/αura3-52/ura3-52 trp1-289/trp1-289 leu2-3_112/leu2-3_112his3δ1/his3δ1mal2-8c/mal2-8csuc2/suc2)、s288c、w303、d273-10b、x2180、a364a、σ1278b、ab972、sk1和 fl100。在某些情况下，该酵母菌株是s288c(matα；suc2 mal mel gal2 cup1 flol flo8-1 hapl)、by4741(matα；his3δ1；leu2δ0；met15δ0；ura3δ0)、by4742(matα；his3δ1； leu2δ0；lys2δ0；ura3δ0)、by4743(mata/ματα；his3δ1/his3δ1；leu2δ0/leu2δ0； met15δ0/met15；lys2/lys2δ0；ura3δ0/ura3δ0)和wat11或w(r)中的任一个，wat11 和w(r)是w303-b菌株(mata；ade2-1；his3-11,-15；leu2-3,-112；ura3-1；canr；cyr ) 的衍生物，分别表达拟南芥(arabidopsis thaliana)nadph-p450还原酶atr1和酵母 nadph-p450还原酶cpr1。在另一个实施方案中，酵母细胞是w303α(matα；his3-11,15 trp1-1 leu2-3 ura3-1 ade2-1)。其他感兴趣的酵母菌株的身份和基因型可见于 euroscarf(web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/col_index.html)。
47.如本文所用的术语“宿主细胞”是携带一种或多种异源编码序列的细胞，该异源编码序列编码使得宿主细胞能够产生例如如本文所述的所需bia的活性。该异源编码序列可以稳定地整合入宿主细胞的基因组中，或者该异源编码序列可以瞬时地插入宿主细胞中。如本文所用，术语“异源编码序列”用于指编码或最终编码并非正常存在于宿主生物中并且能够在合适的条件下在宿主细胞中表达的肽或蛋白质或其等同氨基酸序列例如酶的任意多核苷酸。同样，“异源编码序列”包括正常存在于宿主细胞中的编码序列的多个拷贝，使得该细胞表达并非正常存在于该细胞中的编码序列的额外拷贝。该异源编码序列可以是rna或其任意类型，例如，mrna、dna或其任意类型，例如cdna，或rna/dna 的杂合体。编码序列的实例包括但不限于包含诸如编码序列、内含子、启动子区、3'-utr 和增强子区之类的特征的全长转录单元。
48.如本文所用，术语“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分，即肽或酶的cdna或mrna 序列，以及全长转录单元的编码部分，即包含内含子和外显子的基因，以及“密码子优化的”序列、截短的序列或编码酶或编码其等同氨基酸序列的改变序列的其他形式，条件是该等同的氨基酸序列产生功能蛋白质。这样的等同的氨基酸序列可以具有一个或多个氨基酸的缺失，该缺失是n-末端、c-末端或内部的。预想到截短形式，只要它们具有本文所指出的催化能力。也预想到两种或更多种酶的融合，以促进代谢物在该途径中的转移，条件是催化活性得到保持。
49.可操作的片段、突变体或截短形式可以通过模拟和/或筛选来鉴定。这通过以下方式而成为可能：例如以逐步方式删除蛋白质的n-末端、c-末端或内部区域，接着就其与原始序列相比的针对所需反应的活性对所得衍生物进行分析。如果讨论中的衍生物以此能力操作，则考虑其构成合适的酶的等同衍生物。
50.本发明的方面还涉及异源编码序列，其编码等同于各种酶的天然氨基酸序列的氨基酸序列。“等同”的氨基酸序列被定义为当用于所需目的时，不同于特定的氨基酸序列，而是包含至少一些与特定氨基酸序列的类似活性相比基本不影响蛋白质的生物活性的氨基酸变化(缺失、置换、倒位、插入等)的氨基酸序列。生物活性是指，在脱羧酶的实例中，其催化活性。等同的序列还意在包括已经工程化和/或演变为具有不同于原始氨基酸序列的性质的那些序列。感兴趣的可变的性质包括催化活性、底物特异性、选择性、稳定性、溶解性、定位等。在某些实施方案中，“等同”的氨基酸序列包含在氨基酸水平上与特定氨基酸序列的至少80％-99％的同一性，在一些情况下，至少约85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％和更大的同一性，在一些情况下，在氨基酸水平上至少95％、96％、97％、98％和99％的同一性。在一些情况下，氨基酸序列可以是相同的但dna序列是改变的，例如以优化例如宿主生物的密码子使用。
51.宿主细胞还可以被修饰为具有一个或多个遗传改变以适应异源编码序列。天然宿主基因组的改变包括但不限于修饰该基因组以减少或消除可以干扰所需途径的特定蛋白质的表达。这样的天然蛋白质的存在可以快速地将该途径的中间体或终产物中的一个转化为代谢物或不可用于所需途径中的其他化合物。因此，如果天然酶的活性减低或完全缺乏，所产生的中间体将更易于获得以供引入所需产物中。在一些情况下，如果宿主细胞是酵母细胞并且所需途径需要共底物2-酮戊二酸，则天然内源谷氨酸和/或2-酮戊二酸脱氢酶的表达可以减少或消除，这能将所需共底物(2-酮戊二酸)分别转化为谷氨酸或琥珀酰
ꢀ‑
coa。在一些情况下，当蛋白质的表达消除可能是感兴趣的时，是参与多向药物响应的蛋白质，包括但不限于atp-结合盒(abc)转运蛋白、多药抗药性(mdr)泵和相关的转录因子。这些蛋白质参与bia分子向培养基中的输出，因此缺失控制化合物向培养基中的输出，使得它们更可用于并入所需产物中。在一些实施方案中，感兴趣的宿主细胞基因缺失包括与未折叠蛋白质响应和内质网(er)增生相关的基因。这样的基因缺失可以导致改善的bia产生。细胞色素p450的表达可以诱导未折叠蛋白质响应并可以导致er增生。与这些应激响应相关的基因的缺失可以控制或减少在宿主细胞上的总负担并改善途径的性能。基因改变还可以包括修饰内源基因的启动子以提高内源基因的表达和/或引入其额外的拷贝。其实例包括构建/使用过表达内源酵母nadph-p450还原酶 cpr1的菌株来提高异源p450酶的活性。此外，直接参与中间代谢物的合成的内源酶，如aro8、9和10，也可以过表达。
52.感兴趣的异源编码序列包括但不限于编码酶的序列(野生型或等同的序列)，这些酶通常负责植物中bia的产生。在一些情况下，异源序列编码的酶可以是bia途径中的任何酶，并可以来自任何合适的来源。在一些情况下，碎叶紫堇碱合酶(cfs；ec 1.14.21.2)至少在罂粟、花菱草(eschscholzia californica)和蓟罂粟(argemone mexicana)中发现，并已知由(s)-金黄紫堇碱合成(s)-碎叶紫堇碱。针对特定合成途径选择由异源编码序列编码的酶及其数目可以基于所需产物来选择。在某些实施方案中，本发明的宿主细胞可以包含1种或多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多
种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、 12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种或者甚至15种或更多种异源编码序列，如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15种异源编码序列。
53.除非另外指出，否则异源编码序列如同在genbank中报告的那样。感兴趣的酶的列表在表2和3中显示。本发明的宿主细胞可以包含来自任意来源的所列酶的任意组合。除非另外指出，否则表3中的登录号是指genbank。一些登录号是指酵母基因组数据库 (sgd)，sgd可在万维网上在www.yeastgenome.org获得。
54.在一些实施方案中，将宿主细胞(例如，酵母菌株)工程化为通过将一种或多种酶定位于细胞内的区室来选择性产生感兴趣的bia。在图18中说明的本发明的一个实施方案中，可以通过将er2靶向序列与蛋白质的c-末端融合而将酶定位至酵母内质网。
55.在一些情况下，酶可以位于宿主细胞中，使得由该酶产生的化合物自发地重排，或在到达可以将化合物转化为不需要的代谢物的定位酶之前被另外的酶转化为所需的代谢物。可以选择两种酶之间的空间距离以防止其中一种酶直接作用于化合物以生成不需要的代谢物，并限制不需要的终产物(例如，不需要的阿片样物质副产物)的产生。在某些实施方案中，本文描述的任何酶，无论是单独地还是与第二种酶一起，均可以定位至宿主细胞中的任何合适的区室，包括但不限于细胞器、内质网、高尔基体、液泡、细胞核、质膜或周质(参见，例如，图18)。
56.在一些实施方案中，宿主细胞包括包含定位标签的一种或多种酶。可以利用任何合适的标签。在一些情况下，定位标签是在酶的n-末端和或c-末端连接的肽序列。可以利用任何合适的方法将标签连接至酶上。
57.在一些情况下，定位标签来源于内源酵母蛋白质。这类标签可以提供通往多种酵母细胞器的路径：内质网(er)、线粒体(mt)、质膜(pm)和液泡(v)。
58.在某些实施方案中，该标签是er路径选择标签(例如，er1)。在某些实施方案中，该标签是液泡标签(例如，v1)。在一些实施方案中，该标签是质膜标签(例如，p1)。
59.在某些情况下，该标签包括或来源于来自尾锚定的一类蛋白质中的跨膜域。
60.在一些实施方案中，定位标签将酶定位于细胞器的外部上。在某些实施方案中，定位标签将酶定位于细胞器的内部上。
61.在一些情况下，各类型的酶的表达通过额外的基因拷贝(即，多个拷贝)来增加，该额外的基因拷贝增加中间体的积累和最终bia和/或bia前体的产生。本发明的实施方案包括通过单种或多种酶的多个物种变体的同时表达而增加宿主细胞中的bia产生。在一些情况下，单种或多种酶的额外的基因拷贝包括在宿主细胞中。任何合适的方法均可以用于在宿主细胞中包括酶的异源编码序列的多个拷贝。
62.在一些实施方案中，宿主细胞包括酶的异源编码序列的多个拷贝，例如2个或更多个、 3个或更多个、4个或更多个、5个或更多个或者甚至10个或更多个拷贝。在某些实施方案中，宿主细胞包括一种或多种酶的异源编码序列的多个拷贝，例如2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个等的多个拷贝。在一些情况下，酶的异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与宿主细胞相比不同的来源生物。例如，宿主细胞可以包括一个异源编码序列的多个拷贝，其中每个拷贝来源于不同的来源生物。这样，基于由异源编码序列编码的感兴趣的酶的种间差异，每个拷贝可以包括明确序列中的一些变异。
63.可以对工程宿主细胞的培养基进行取样并监测其中感兴趣的bia化合物的产生。可以使用任何合适的方法来观测和测量bia化合物。感兴趣的方法包括但不限于 lc-ms法(例如，如本文所述)，其中感兴趣的样品通过与已知量的标准化合物进行比较来分析。例如可以通过m/z和ms/ms裂解图案来证实身份，并且可以通过参考已知量的化合物标准的相应lc-ms分析，经由已知保留时间的lc迹线峰和/或eic ms峰分析来实现化合物的量化或测量。
64.产生牛心果碱的宿主细胞
65.牛心果碱是bia的合成中主要的分支点中间体，且该中间体的高产率在用于产生终产物如吗啡、血根碱或小檗碱的工程化努力中是感兴趣的。在一些情况下，为从全去甲劳丹碱产生牛心果碱，在宿主细胞中表达三种酶：去甲基乌药碱6-o-甲基转移酶(6omt；ec 2.1.1.128),乌药碱n-甲基转移酶(cnmt；ec 2.1.1.140)和3'羟基
ꢀ‑
n-甲基乌药碱4'-o-甲基酶(4'omt；ec 2.1.1.116)。通常，该酶来源于与宿主细胞相比不同的来源生物。为从去甲基乌药碱产生牛心果碱，附加的细胞色素p450酶，例如cyp80b3或cyp80b1(ec 1.14.13.71)，可以与三种甲基转移酶一起表达。对酿酒酵母进行工程化以产生牛心果碱可以利用任何合适的优化方法。在一些情况下，来自两种或更多种物种(例如，罂粟和黄唐松草)的三种甲基转移酶的所有组合一起表达以寻找最佳的牛心果碱生产物。在另一种情况下，可以将甲基转移酶的最佳组合 (来自罂粟的所有3种)整合到酵母染色体中，并且在不影响牛心果碱的产率的情况下滴定各种的表达。可以向上或向下滴定甲基转移酶的表达，并且甲基转移酶可以顺序地、同时地或两两组合地作用于底物。
66.本发明的方面包括通过来自几种不同物种的6omt、cnmt和/或4'omt基因的过表达而具有改善的牛心果碱产量的酿酒酵母的菌株。所谓改善的或增加的产量是指在对照不产生牛心果碱的情况下其产生一定量的牛心果碱，以及在对照产生一些牛心果碱的情况下约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约 50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，例如2倍或更多，例如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。来自不同物种的甲基转移酶具有略微不同的底物特异性[choi等人(2002).j biol chem 277,830-835；liscombe等人(2009). plant j 60,729-74；morishige等人(2000)j biol chem 275,23398-23405；ounaroon 等人(2003)plant j 36,808-819；sato等人(1994)eur j biochem 225,125-131]。当不同物种起源的甲基转移酶在单个菌株中一起表达时，可以利用不同的底物特异性并增大通过多个甲基化途径的通量以增大牛心果碱的产率。在一些情况下，甲基转移酶的物种变体包括但不限于罂粟、黄唐松草和日本黄连(copits japonica)(表2)。在某些情况下，甲基转移酶的物种变体来源于罂粟。在某些情况下，甲基转移酶的物种变体来源于黄唐松草。在一些实施方案中，甲基转移酶的物种变体来源于日本黄连。
[0067]
在一些实施方案中，宿主细胞包含选自6omt、cnmt和4’omt的两种或更多种甲基转移酶的两种或更多种异源编码序列。在某些情况下，所述两种或更多种甲基转移酶来源于两种或更多种与宿主细胞相比不同的来源生物。
[0068]
在一些情况下，宿主细胞包含甲基转移酶6omt和cnmt的异源编码序列。在某些情况下，宿主细胞包含甲基转移酶cnmt和4’omt的异源编码序列。
[0069]
在一些情况下，宿主细胞包含甲基转移酶6omt和4’omt的异源编码序列。
3，其由cnmt初始甲基化，然后由6omt 或4’omt甲基化；bia 4，其由4’omt初始甲基化，然后由6omt或cnmt甲基化；bia 5，其预先由6omt和4’omt甲基化，由cnmt甲基化以产生牛心果碱； bia 6，其预先由6omt和cnmt甲基化，由4’omt甲基化以产生牛心果碱；以及 bia 7，其预先由cnmt和4’omt甲基化，由6omt甲基化以产生牛心果碱。在一些情况下，当该途径的起始物质是去甲基乌药碱时，6omt或cnmt可以作用于该化合物，以产生两种不同甲基化的产物(图3)：bia 10，其由6omt初始甲基化，然后由cnmt甲基化；bia 11，其由cnmt初始甲基化，然后由6omt甲基化。bia12，也称为n-甲基乌药碱，其预先由6omt和cnmt甲基化，然后由cyp80b1 或cyp80b3和4’omt顺序地作用以产生牛心果碱。
[0079]
在某些情况下，所述宿主细胞是酵母菌株。在一些情况下，该酵母菌株是酿酒酵母。
[0080]
产生血根碱和血根碱前体的宿主细胞
[0081]
本发明的方面包括产生原小檗碱和包括但不限于碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、顺式-n-甲基刺罂粟碱、金黄紫堇碱、前托品、二氢血根碱和血根碱的苯菲啶生物碱的宿主细胞。图4描绘了根据本发明的实施方案在宿主细胞的实施方案中存在的合成途径。尽管该途径可以更长，从全去甲劳丹碱、去甲基乌药碱或任何其他合适的bia(例如，如在其他图中所示)起始，但该特定路径的描绘开始于牛心果碱并结束于血根碱。如果所需最终结果是在全去甲劳丹碱至血根碱途径中的中间体之一，则该途径可以包括比显示的那些更少的酶。本发明包括多个酶步骤的生物合成途径，例如，在工程酵母菌株内由酶bbe(ec 1.21.3.3)、cfs(ec 1.14.21.2)、cpr(ec 1.6.2.4)、sts(ec1.14.21.1)、tnmt(ec 2.1.1.122),msh(ec 1.14.13.37)、p6h(ec 1.14.13.55) 和dbox(ec 1.5.3.12)催化的那些步骤，以产生多种原小檗碱和苯菲啶化合物。此外，本发明包括用来在工程酵母菌株的背景内优化原小檗碱和苯菲啶化合物的产生的工具和方法。
[0082]
在一些实施方案中，所述宿主细胞能够产生血根碱或血根碱前体，其中该宿主细胞包含选自bbe、cfs、cpr、sts、tnmt、msh、p6h和dbox的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。在某些实施方案中，该血根碱前体是原小檗碱或苯菲啶生物碱。
[0083]
在某些情况下，来源生物是罂粟、花菱草、拟南芥、大红罂粟(papaver bracteatum) 或蓟罂粟。在一些情况下，来源生物是罂粟。在一些情况下，来源生物是花菱草。在一些情况下，来源生物是拟南芥。在一些情况下，来源生物是大红罂粟。在一些情况下，来源生物是蓟罂粟。
[0084]
在一些情况下，所述一种或多种酶是来源于两种或更多种与宿主细胞相比不同的来源生物的两种或更多种酶。
[0085]
在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个异源编码序列的多个拷贝。在某些实施方案中，所述一个或多个异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与宿主细胞相比不同的来源生物。例如，宿主细胞可以包含一个异源编码序列的多个拷贝，其中每个拷贝来源于不同的来源生物。这样，基于由异源编码序列编码的感兴趣的酶的种间差异，每个拷贝可以包括明确序列中的一些变异。
[0086]
在一些情况下，宿主细胞包含选自bbe、cfs、cpr、sts、tnmt、msh、p6h和 dbox的两种或更多种酶的两种或更多种，例如三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种或者甚至
更多种异源编码序列。
[0087]
在某些情况下，宿主细胞还包含与天然宿主细胞相比的一个或多个基因缺失，其中一个或多个缺失的基因选自ire1、hac1、ορi1、ino1、ino2、ino3、pdr1、stb5、 pdr3、pdr5、snq2、yor1、tpo1、tpo2、tpo3、tpo4、pdr10、pdr11、 pdr15、pdr16、pdr17、qdr1、qdr2、qdr3、flr1、aqr1、aqr2和cin5。
[0088]
在一些情况下，宿主细胞是酵母菌株(例如，如本文描述的)。
[0089]
在某些实施方案中，宿主细胞能够经由图4的生物合成途径由全去甲劳丹碱产生血根碱或血根碱前体。在一些情况下，宿主细胞能够经由图11的生物合成途径由全去甲劳丹碱产生血根碱或血根碱前体。
[0090]
在一些情况下，宿主细胞包含bbe酶的异源编码序列。可以将bbe酶的异源编码序列整合到宿主细胞染色体中。在一些情况下，宿主细胞包含cfs酶的异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含cpr酶的异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含sts酶的异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含tnmt酶的异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含msh酶的异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含p6h酶的异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含dbox酶的异源编码序列。
[0091]
在一些情况下，宿主细胞是产生金黄紫堇碱的酵母菌株，其中小檗碱桥酶(bbe；ec 1.21.3.3)(例如，来自罂粟或花菱草)在具有例如染色体整合的ps6omt、pscnmt 和/或ps4'omt的酵母菌株中在低拷贝构建体(例如，低拷贝质粒、yac或染色体整合的)上表达。可以利用酶的任何合适的变体，例如，表2中描绘的酶变体中的一种或多种。
[0092]
在一些情况下，所述血根碱前体是碎叶紫堇碱。在某些情况下，宿主细胞包含碎叶紫堇碱合酶(cfs；ec 1.14.21.2)和细胞色素p450 nadph还原酶(cpr；ec 1.6.2.4) 的异源编码序列。在一些情况下，该cpr酶是atr酶，例如atr1。在一些情况下，宿主细胞是产生碎叶紫堇碱的酵母菌株，其中碎叶紫堇碱合酶(cfs)(例如，来自花菱草(eccfs)、罂粟(pscfs)和/或蓟罂粟(amcfs))在具有例如染色体整合的ps6omt、pscnmt、ps4'omt、psbbe和/或atr1的酵母菌株中在低拷贝构建体(例如，低拷贝质粒、yac或染色体整合的)上表达。可以利用酶的任何合适的变体，例如，表2中描绘的酶变体中的一种或多种。
[0093]
在一些实施方案中，宿主细胞产生刺罂粟碱，其中刺罂粟碱合酶(sts；ec 1.14.21.1) (例如，来自花菱草(ecsts)、罂粟(pssts)和/或蓟罂粟(amsts))在产生碎叶紫堇碱的菌株中的低拷贝构建体(例如，低拷贝质粒、yac或染色体整合的)上在宿主细胞中表达。可以利用酶的任何合适的变体，例如，表2中描绘的酶变体中的一种或多种。
[0094]
在某些情况下，宿主细胞产生顺式-n-甲基刺罂粟碱，其中四氢原小檗碱n-甲基转移酶(tnmt；ec 2.1.1.122)(例如，来自罂粟(pstnmt)或花菱草(ectnmt)) 在产生刺罂粟碱的菌株中由低拷贝构建体(例如，低拷贝质粒、yac或染色体整合的)在宿主细胞中表达。可以利用酶的任何合适的变体，例如，表2中描绘的酶变体中的一种或多种。
[0095]
在一些情况下，宿主细胞产生前托品。在某些情况下，顺式-n-甲基刺罂粟碱14羟化酶(msh，ec 1.14.13.37)(例如，来自罂粟(psmsh))在产生顺式-n-甲基刺罂粟碱的菌株中由低拷贝构建体(例如，低拷贝质粒、yac或染色体整合的)在宿主细胞中表达。在某些情况下，宿主细胞包含tnmt和msh酶的异源编码序列。可以利用酶的任何合适的变体，例如，表2中描绘的酶变体中的一种或多种。
[0096]
在一些情况下，宿主细胞产生二氢血根碱，其中前托品6-羟化酶(p6h；ec 1.14.13.55) (例如，来自花菱草(ecp6h)或罂粟(psp6h))在产生前托品的菌株中由低拷贝构建体(例如，低拷贝质粒、yac或染色体整合的)在宿主细胞中表达。可以利用酶的任何合适的变体，例如，表2中描绘的酶变体中的一种或多种。
[0097]
在一些情况下，宿主细胞产生血根碱，其中二氢苯菲啶氧化酶(dbox；ec 1.5.3.12) (例如，来自罂粟(psdbox))在产生二氢血根碱的菌株中由低拷贝构建体(例如，低拷贝质粒、yac或染色体整合的)在宿主细胞中表达。可以利用酶的任何合适的变体，例如，表2中描绘的酶变体中的一种或多种。
[0098]
在一些实施方案中，宿主细胞是比对照菌株产生更多碎叶紫堇碱的工程菌株，其中 cfs的附加拷贝在该工程菌株中表达。所谓更多是指在对照不产生碎叶紫堇碱的情况下其产生一定量的碎叶紫堇碱，以及在对照产生一些碎叶紫堇碱的情况下约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，例如2倍或更多，例如5倍或更多，包括 10倍或更多的增加。通过基因拷贝数、启动子强度或启动子调节改变感兴趣的细胞色素p450的表达水平可以提高目标化合物的产量。在某些情况下，由高拷贝质粒的表达并不导致可测量的碎叶紫堇碱产量。在某些情况下，当cfs基因的一个或多个拷贝由低拷贝构建体在宿主细胞中表达时，碎叶紫堇碱产量更高。在一些实施方案中，当cfs基因的更多拷贝包括在宿主细胞中时，碎叶紫堇碱的水平更高。
[0099]
在某些情况下，为产生更多的刺罂粟碱，来自不同物种的酶cfs和sts的变体在宿主细胞中组合表达。通过将工程宿主细胞与并不包括感兴趣的酶的所需表达的对照细胞进行比较，可以观察到水平提高的刺罂粟碱。所谓提高的是指在对照不产生刺罂粟碱的情况下其产生一定量的刺罂粟碱，以及在对照产生一些刺罂粟碱的情况下约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，例如2倍或更多，例如5倍或更多，包括 10倍或更多的增加。例如，由与sts的不同变体一起表达的不同cfs变体产生刺罂粟碱的测量显示在图13(c)中。可以利用酶的任何合适的组合来产生水平提高的刺罂粟碱。
[0100]
在一些情况下，为产生更多的碎叶紫堇碱，将宿主细胞(例如，酵母菌株)工程化成包括来自多个物种的染色体整合的nadph细胞色素p450还原酶，以优化细胞色素 p450的活性。例如，可以对由与细胞色素p450 nadph还原酶的变体一起表达的多种碎叶紫堇碱合酶产生碎叶紫堇碱进行测量。可以利用这些酶的任何合适的组合来产生相对于对照提高的水平的碎叶紫堇碱。
[0101]
在一些情况下，为产生更多的碎叶紫堇碱或刺罂粟碱，利用过表达细胞色素b5的宿主细胞(例如，酵母菌株)优化细胞色素p450的活性。例如，可以在具有和不具有过表达的细胞色素b5的情况下，对宿主细胞的碎叶紫堇碱或刺罂粟碱产量进行测量。在一些情况下，宿主细胞过表达细胞色素b5并产生相对于对照细胞提高的水平的碎叶紫堇碱或刺罂粟碱。
[0102]
在某些实施方案中，为产生更多的原小檗碱生物碱，在提供改善的细胞色素p450活性的条件下培养宿主细胞。感兴趣的条件包括但不限于在提供高通风的容器(例如，烧瓶，如具有挡板的烧瓶)中在降低的温度(例如，约10℃、约15℃、约20℃、约 22℃、约25℃、约28℃、约30℃、约33℃或约35℃)下生长。例如，可以测量来自在不同培养条件下生长的宿
主细胞的多种原小檗碱生物碱。在某些实施方案中，在降低的温度(例如，约25℃)下在较高的通风条件下(例如，在烧瓶中)温育宿主细胞。在这样的条件下，酶水平和/或酶活性(例如，碎叶紫堇碱和刺罂粟碱的产量) 可以相对于对照提高。
[0103]
在一些实施方案中，宿主细胞产生更多原小檗碱生物碱，其中该宿主细胞通过与未折叠蛋白质响应和内质网(er)增生相关的基因的缺失来优化以提高bia产量。感兴趣的基因缺失包括包括但不限于ire1、hac1、opi1、ino1、ino2和ino3(例如，表3)。在一些情况下，细胞色素p450的表达诱导未折叠蛋白质响应并导致er增生。与这些应激响应相关的基因的缺失可以控制或减少宿主细胞上的总负担并改善途径性能。所谓更多是指在对照不产生原小檗碱生物碱的情况下其产生一定量的原小檗碱生物碱，以及在对照产生一些原小檗碱生物碱的情况下约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，例如2倍或更多，例如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。
[0104]
在某些情况下，宿主细胞包含参与化合物的跨细胞膜转运的一种或多种蛋白质的一种或多种异源或内源编码序列。在某些情况下，该参与化合物的跨细胞膜转运的一种或多种蛋白质选自pdr1、pdr5、snq2、yor1、pdr3、cin5和pdr3。
[0105]
在某些实施方案中，参与多向药物响应的基因，包括但不限于atp-结合盒(abc) 转运蛋白、多药抗药性(mdr)泵和相关的转录因子，在宿主细胞中删除以减少bia 分子向培养基中的输出。基因的实例包括但不限于pdr1、stb5、pdr3、pdr5、 snq2、yor1、tpo1、tpo2、tpo3、tpo4、pdr10、pdr11、pdr15、pdr16、 pdr17、qdr1、qdr2、qdr3、flr1、aqr1、aqr2和cin5。基因缺失包括单个缺失或任意组合的多个缺失。在一些情况下，宿主细胞包括一个或多个感兴趣的基因缺失，并且与不包括该一个或多个感兴趣的基因缺失的对照细胞相比，产生较低水平的牛心果碱、金黄紫堇碱、碎叶紫堇碱或刺罂粟碱。
[0106]
在另一个实施方案中，在本发明的宿主细胞中，参与多向药物响应的基因，包括但不限于atp-结合盒(abc)转运蛋白、多药抗药性(mdr)泵和相关的转录因子，被置于调节的(例如，诱导型或生长阶段依赖性的)启动子的控制下以实现bia转运的时序控制。在某些情况下，将转运蛋白基因置于稳定期启动子的控制下，该稳定期启动子导致感兴趣的bia保持在细胞内直至稳定期。在这样的宿主细胞中，可以提高起始物质向所需终产物的转化。
[0107]
产生原小檗碱的宿主细胞
[0108]
本发明的方面包括产生原小檗碱生物碱的工程宿主细胞。在一些情况下，该原小檗碱生物碱具有下列结构之一：
[0109][0110]
其中r
1-r
14
各自独立地选自-h、烷基(例如，低级烷基如甲基(ch3)或乙基)、羟基或烷氧基(or)(例如，低级烷氧基如甲氧基或乙氧基)。
[0111]
在某些情况下，原小檗碱生物碱由例如存在于培养基(例如，产生牛心果碱的细胞的培养基，例如如本文所述)中的牛心果碱或其其他类似物或其衍生物产生，或引入至细胞裂解物或裂解物级分中。在某些情况下，宿主细胞可以包括一种或多种异源编码序列以表达下列酶中的一种或多种或任意组合：小檗碱桥酶(bbe)、金黄紫堇碱9'-o
‑ꢀ
甲基转移酶(s9omt)、氢化小檗碱合酶(cas)和(s)-四氢原小檗碱氧化酶(stox)，其中所述一种或多种酶来源于与宿主细胞相比不同的来源生物。
[0112]
在一些情况下，来源生物是罂粟、花菱草、日本黄连、黄唐松草、匍枝小檗(berberisstolonifer)、黄唐松草灰叶亚种(thalictrum flavum subsp.glaucum)、黄连(coptischinensis)、唐松草属的种、黄连属的种、罂粟属的种、金花小檗(berberis wilsonae)、蓟罂粟或小檗属的种。
[0113]
在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个异源编码序列的多个拷贝。在一些情况下，所述一个或多个异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与宿主细胞相比不同的来源生物。例如，宿主细胞可以包括一个异源编码序列的多个拷贝，其中每个拷贝来源于不同的来源生物。这样，基于由异源编码序列编码的感兴趣的酶的种间差异，每个拷贝可以包括明确序列中的一些变异。
[0114]
在一些情况下，宿主细胞包含选自bbe、s9omt、cas和stox的两种或更多种酶的两种或更多种异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含选自bbe、s9omt、 cas和stox的三种或更多种酶的三种或更多种异源编码序列。在一些情况下，宿主细胞包含酶bbe、s9omt、cas和stox中的每一种的异源编码序列。
[0115]
在一些实施方案中，宿主细胞包含cas的异源编码序列和atr1的异源编码序列。
[0116]
在一些实施方案中，宿主细胞包含stox的异源编码序列。
[0117]
在一些实施方案中，宿主细胞(例如，工程酵母菌株)支持如图5所示的生物合成途径。
[0118]
在一些情况下，宿主细胞包括与天然存在的基因金花小檗(s)-四氢原小檗碱氧化酶(表 3)共有75％或更高(例如，78％)的核酸序列同一性的基因stox。该基因可以是针对酵母表达进行了密码子优化的非天然核苷酸序列。
[0119]
本发明的方面要求stox或其同源物在活酵母培养物中的功能性表达。在某些实施方案中，将宿主细胞工程化为由其前体(s)-氢化小檗碱产生小檗碱。
[0120]
在本发明的一个实施方案中，酶的表达水平对于bbe、cas和stox是相对较低的 (例如，cen/ars载体或基因组表达)(参见，例如图6a)且对于s9omt是相对较高的(例如，2μm载体或多个基因组拷贝)(参见，例如图6b)。可以使用任何合适的方法改变表达水平。感兴趣的方法包括但不限于改变组成型启动子的浓度、使用诱导型启动子、附加型地或基因组地改变各基因的拷贝数(参见，例如图6c)、改变选择标记和/或与启动子活性或选择相对应的培养条件。
[0121]
在一些实施方案中，所述一种或多种酶由酵母人工染色体重组地表达(例如，图10)。
[0122]
本发明的方面包括cas或其同源物在活酵母培养物中作为较大的生物合成途径的一部分的功能性表达。在某些实施方案中，将宿主菌株工程化成由全去甲劳丹碱或其前体产生小檗碱(例如，根据图5、7或表2)。在一些情况下，宿主细胞能够经由图5 的生物合成途
径由牛心果碱产生小檗碱。在本发明的另一个实施方案中，宿主细胞包括是atr1的cas的细胞色素p450还原酶配偶体，其共表达可以导致比花菱草cpr、拟南芥atr2、罂粟cpr或内源酵母cpr更高的cas活性(例如，图6d)。
[0123]
本发明的方面要求stox或其同源物在活酵母培养物中的功能性表达。在某些实施方案中，将宿主细胞工程化成由全去甲劳丹碱产生(s)-氢化小檗碱——小檗碱的前体。在一些实施方案中，宿主细胞能够由全去甲劳丹碱产生(s)-氢化小檗碱。
[0124]
为增强bia在酵母细胞内的积累，异源转运蛋白，包括但不限于来自产生bia的植物的植物atp-结合盒蛋白质，可以在工程菌株中表达。在一些实施方案中，可以包括选自cjabcb1、cjabcb2和/或cjabcb2的一种或多种转运蛋白的一种或多种异源编码序列以在宿主细胞内积累小檗碱。
[0125]
在一些情况下，该宿主细胞是酵母菌株。
[0126]
产生蒂巴因的宿主细胞
[0127]
本发明的方面包括由牛心果碱或其前体产生中间体或终产物形式的蒂巴因的工程宿主细胞。牛心果碱或其前体可以由现有的菌株产生，存在于培养基中，或者引入至细胞裂解物或裂解物级分。在一些情况下，宿主细胞可以包括一种或多种异源编码序列以表达选自沙罗泰里啶合酶(salsyn)、细胞色素p450 2d6(cyp2d6)、细胞色素p4502d2(cyp2d2)、沙罗泰里啶还原酶(salr)和/或沙罗泰里啶醇7-o-乙酰基转移酶 (salat)的一种或多种酶。所述一种或多种酶可以来源于与宿主细胞相比不同的来源生物。
[0128]
在一些情况下，来源生物是罂粟、大红罂粟、东方罂粟(papaver orientale)、罂粟属的种、智人(homo sapiens)或褐家鼠(rattus norvegicus)。
[0129]
在一些情况下，宿主细胞是支持如图8所示在宿主中的生物合成途径的工程酵母菌株。
[0130]
在一些实施方案中，宿主细胞包含一个或多个异源编码序列的多个拷贝。在一些情况下，所述一个或多个异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与宿主细胞相比不同的来源生物。
[0131]
在一些情况下，宿主细胞包含两种异源编码序列。在一些情况下，所述两种异源编码序列是酶salr和salat的异源编码序列。
[0132]
在一些情况下，宿主细胞包括基因cyp2d6、cyp2d2和/或salsyn和/或另外的可以由牛心果碱产生沙罗泰里啶的天然或工程化的p450。基因可以是针对酵母表达进行了密码子优化的天然或非天然核苷酸序列。
[0133]
在一些实施方案中，宿主细胞包括是哺乳动物cpr和/或atr1的cyp2d6、cyp2d2 和/或salsyn的细胞色素p450还原酶配偶体，其共表达可以导致比花菱草cpr、拟南芥atr2、罂粟cpr或内源酵母cpr更高的cyp2d6、cyp2d2和/或salsyn活性。
[0134]
在一些实施方案中，宿主细胞可以包括一种或多种异源编码序列以表达在表2中所列的任何salr变体中的一种或多种。在一些情况下，宿主细胞可以表达在表2中所列的任何salat变体中的一种或多种。另外，salr变体可以包括f104a和/或i275a突变和/或任何其他合适的突变(例如，图9)。本发明的方面包括salr和salat两者的功能性表达，这导致由沙罗泰里啶产生蒂巴因。
[0135]
在本发明的一个实施方案中，宿主细胞包括酶的组合：具有f104a或i275a突变的
密码子优化的大红罂粟salr和salat的任何密码子优化的变体(例如，图9)。salat 基因可以与其天然存在的对应物共有小于或等于80％的核酸序列同一性(表3)。这些基因可以是针对酵母表达进行了密码子优化的非天然核苷酸序列。
[0136]
在本发明的另一个实施方案中，由salr和salat催化的沙罗泰里啶至蒂巴因的转化在本宿主细胞的粗裂解物中发生，该宿主细胞表达由辅因子nadph补充的两种酶。在本发明的另一个实施方案中，salat和salr可以在表达任意合适的附加酶的工程宿主细胞中表达，使得该菌株产生蒂巴因是其前体的产物。在一些情况下，该菌株可以由蒂巴因产生东罂粟碱、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮和/或羟吗啡酮。
[0137]
在一些情况下，宿主细胞进一步包含t6odm和morb(例如，morb或morb-e160g) 的异源编码序列。在某些情况下，该菌株可以产生一种或多种阿片化合物，如氢可酮。在本发明的又一个实施方案中，由salr和salat催化的牛心果碱至蒂巴因的转化在宿主细胞(例如，工程酵母菌株)中发生，该宿主细胞经修饰以产生与对照宿主细胞 (例如，天然酵母菌株)相比增加的量的nadph(参见，例如表2)。
[0138]
在本发明的一个实施方案中，催化牛心果碱至沙罗泰里啶的转化的salr和/或salat 和cyp2d2或cyp2d6或salsyn或工程化的细胞色素p450酶从酵母人工染色体表达。
[0139]
在一些情况下，所述宿主细胞是酵母菌株。在某些情况下，所述宿主细胞可以被工程化为通过将salr和/或salat定位至酵母细胞中的细胞器而增加由牛心果碱或其前体产生沙罗泰里啶醇或蒂巴因或蒂巴因是其前体的产物的产量。salr和/或salat可以定位至酵母内质网，以便减小催化牛心果碱至沙罗泰里啶的转化的salr和/或salat 和cyp2d2或cyp2d6或salsyn或工程化的细胞色素p450酶之间的空间距离。所谓增加的产量是指在对照不产生感兴趣的化合物的情况下其产生一定量的感兴趣的化合物，以及在对照产生一些感兴趣的化合物的情况下10％或更多，例如50％或更多，包括2倍或更多，例如5倍或更多，例如10倍或更多的增加。
[0140]
产生阿片的宿主细胞
[0141]
本发明的方面包括表达下列酶中的一种或多种的工程宿主细胞：蒂巴因6-o-脱甲基酶(t6odm：ec 1.14.11.31)、可待因酮还原酶(cor；ec 1.1.1.247)、可待因o
‑ꢀ
脱甲基酶(codm：ec 1.14.11.32)、吗啡脱氢酶(mora：ec 1.1.1.218和ec 1.1.1.247) 和吗啡酮还原酶(morb：ec 1.3.1.-)(参见，例如，表2)。该宿主细胞可以产生选自包括可待因、吗啡、氢可酮和氢吗啡酮、羟考酮、二氢可待因、14-羟基可待因和二氢吗啡的阿片化合物。所谓更多是指在对照不产生感兴趣的化合物的情况下其产生一定量的感兴趣的化合物，以及在对照产生一些感兴趣的化合物的情况下约10％或更多，例如约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约80％或更多、约100％或更多，例如2倍或更多，例如5倍或更多，包括10倍或更多的增加。宿主细胞可以由蒂巴因合成这些产物，该蒂巴因在培养基中提供，或由宿主细胞本身产生，或由与产生阿片的宿主细胞共培养的一种或多种菌株产生。在一些实施方案中，构成这些宿主细胞的遗传修饰可以与产生蒂巴因的宿主细胞的那些遗传修饰组合起来，以产生能够由上游中间体、酪氨酸或可发酵的碳源生物合成阿片的主菌株。
[0142]
可以使用任何合适的方法观察和测量阿片化合物。感兴趣的方法包括lc-ms法(例如，如本文描述)，其中感兴趣的样品通过与已知量的标准阿片化合物进行比较来分析。可
以例如通过m/z和ms/ms裂解图案证实同一性，并且可以通过参考相应的量的化合物标准，经由lc和/或eic ms分析实现化合物的量化或测量。
[0143]
在一些实施方案中，宿主细胞能够经由图15的生物合成途径由蒂巴因产生阿片化合物。
[0144]
在一些情况下，宿主细胞不由蒂巴因产生东罂粟碱或吗啡酮。在某些情况下，宿主细胞产生尼奥品和neomorphine中的一种或多种。
[0145]
在一些情况下，宿主细胞产生其产率为总阿片的10％或更多，例如宿主细胞中总阿片的20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、50％或更多、50％或更多、 50％或更多或甚至90％或更多的阿片化合物。在某些情况下，宿主细胞产生其产率为总阿片的30％或更多，例如50％或更多的阿片化合物。
[0146]
在一些实施方案中，宿主细胞产生阿片化合物，其中该宿主细胞包含：选自t6odm、 cor和codm的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物；和选自mora和morb的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。在某些实施方案中，mora是恶臭假单胞菌mora且morb是恶臭假单胞菌 morb。在某些实施方案中，该宿主细胞包含四种或更多种异源编码序列。
[0147]
在一些情况下，宿主细胞是产生阿片化合物的细胞，其中该宿主细胞包含选自蒂巴因 6-o-脱甲基酶(t6odm)、可待因酮还原酶(cor)、可待因o-脱甲基酶(codm)、吗啉脱氢酶(mora)和吗啉酮还原酶(morb)的四种或更多种酶的四种或更多种异源编码序列，其中所述四种或更多种酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0148]
在一些实施方案中，来源生物是罂粟、罂粟属的种或恶臭假单胞菌。
[0149]
在一些情况下，宿主细胞包含t6odm、cor、codm和mora的异源编码序列。
[0150]
在某些情况下，宿主细胞包含t6odm、cor、codm和morb的异源编码序列。
[0151]
在一些情况下，宿主细胞包含t6odm、codm、mora和morb的异源编码序列。
[0152]
在一些实施方案中，宿主细胞包含酶t6odm、cor和codm的异源编码序列。
[0153]
在一些情况下，宿主细胞包含一个或多个异源编码序列的多个拷贝。所述异源编码序列的多个拷贝可以来源于一种或两种或更多种与该宿主细胞相比不同的来源生物。例如，宿主细胞可以包括一个异源编码序列的多个拷贝，其中每个拷贝来源于不同的来源生物。这样，基于由异源编码序列编码的感兴趣的酶的种间差异，每个拷贝可以包括明确序列中的一些变异。
[0154]
在一些情况下，宿主细胞表达基因蒂巴因6-o-脱甲基酶(t6odm)、可待因酮还原酶(cor)和可待因o-脱甲基酶(codm)中的一种或多种。在某些情况下，这些基因(t6odm、cor和codm)分别与来自罂粟的天然存在的基因共有76.2％、 76.8-77.7％和75.2％的核苷酸序列相似性(参见，表3)。在某些情况下，在工程宿主细胞中表达的基因代表非天然核苷酸序列，其针对宿主细胞(酿酒酵母)的密码子使用而优化。
[0155]
在一些情况下，宿主细胞支持如图15中所示的代谢途径。在某些情况下，在第一步中，t6odm作用于蒂巴因以制备尼奥品酮。然而，随后cor作用于酵母细胞中尼奥品酮池中的一些以制备尼奥品，而尼奥品酮的一些其他分子自发地重排以形成可待因酮。cor还作用于可待因酮以制备可待因。尼奥品和可待因随后被codm代谢以分别制备neomorphine和吗啡。
该途径可导致产生非目标产物尼奥品和neomorphine 以及预期的目标可待因和吗啡。在一些实施方案中，宿主细胞提供了利用t6odm、 cor和codm这三种酶通往吗啡的路径(图15)，在该路径中工程菌株不产生或几乎不产生东罂粟碱或吗啡酮。
[0156]
在本发明的一个实施方案中，该途径的cor酶是来自罂粟的同工型1.3。该cor同工型可产生与其他测试的变体相似水平的可待因，但使非目标尼奥品的量减至最小。在另一实施方案中，宿主细胞(例如，酵母菌株)被工程化用于通过将cor定位于酵母细胞中的区室来相对于尼奥品和neomorphine选择性产生可待因和吗啡。在图 18所示的本发明的一个实施方案中，通过将er2导向序列融合至蛋白质的c-末端将 cor定位于酵母内质网。t6odm可位于这样的宿主细胞的细胞质内，以使得由该酶产生的尼奥品酮在到达定位于线粒体的cor酶之前自发地重排成可待因酮。可选择两种酶之间的空间距离以阻止cor直接作用于尼奥品酮以制备尼奥品，并限制非目标尼奥品和下游neomorphine的产生。在本发明的另一实施方案中，codm与cor 共同定位以将由cor产生的可待因转化为吗啡。在又一实施方案中，cor单独地或与codm一起定位于宿主细胞(例如，酵母细胞)中任何合适的区室，包括但不限于内质网、高尔基体、液泡、细胞核、质膜和周质(参见图18)。
[0157]
在某些实施方案中，宿主细胞(例如，酵母菌株)具有存在于细胞中、在染色体中或在附加型dna内整合的各种异源编码序列的若干拷贝。可在本发明的宿主细胞中使用任何合适比例的异源编码序列。在针对吗啡的产生进行优化的一些情况下， t6odm：cor：codm的异源编码序列的总拷贝数之比为1:1:3、2:1:2或2:1:3(参见，例如图17)。
[0158]
可优化培养基使得可获得过量的2-酮戊二酸来支持2-酮戊二酸依赖性酶t6odm和 codm的活性。该培养基可包含以下单独或组合使用的任何添加剂：2-酮戊二酸、谷氨酸和谷氨酰胺(图16)。在某些实施方案中，该宿主细胞是一种能够产生与对照酵母菌株相比增加的量的2-酮戊二酸的工程酵母菌株。在其他实施方案中，将2-酮戊二酸直接添加至培养基中。
[0159]
在一些实施方案中，宿主细胞进一步包含与对照宿主细胞(例如，酵母菌株)相比增加的量的2-酮戊二酸，其中增加的量的2-酮戊二酸通过直接添加至宿主细胞的培养基中而引入。在一些情况下，宿主细胞进一步包含与对照酵母菌株相比增加的量的谷氨酰胺、2-酮戊二酸和谷氨酸中的一种或两种或三种。
[0160]
在一些情况下，宿主细胞支持2-酮戊二酸依赖性酶t6odm和codm的活性，以使得另外的共底物2-酮戊二酸对来自宿主细胞代谢的异源酶而言是可用的(参见，例如，图16)。对宿主细胞基因型的感兴趣的此类修饰在表3中进行了详细说明，并可包括以下的任意一种或多种：(1)天然的或异源的谷氨酸脱氢酶(gdh)的过表达，以由谷氨酸产生2-酮戊二酸，(2)谷氨酰胺合酶(gln1)的缺失以阻止在谷氨酰胺产生过程中谷氨酸的损失，和/或谷氨酸合酶(glt1)的缺失以阻止在谷氨酸产生过程中2-酮戊二酸的损失，(3)一个或若干谷氨酸脱氢酶基因(gdh1、gdh2、gdh3) 的缺失以阻止谷氨酸向2-酮戊二酸和氨的可逆转化，(4)一个或若干2-酮戊二酸脱氢酶基因(kgd1、kgd2、lpd1)的缺失以阻断2-酮戊二酸到琥珀酰-coa的损失， (5)以及此外，一个或若干线粒体2-酮戊二酸转运蛋白(包括但不限于odc1和 odc2)可在宿主细胞中过表达或被敲除。
[0161]
在一些情况下，宿主细胞包含选自gln1、glt1、gdh1、gdh2、gdh3、odc1、 odc2、kgd1、kgd2和lpd1的一种或多种蛋白质的一种或多种编码序列。
[0162]
在某些情况下，在生产菌株中，调节途径基因的表达的启动子位于彼此相邻的位置并在相反的方向起作用，以使得位于并排位置的两个基因由有义和反义链表达(例如，如图10中所示的)。包含启动子、基因和终止子的基因盒可采用这样的背靠背(back-to-back)启动子设计成对布置，以增加表达并提供相对于单向定位的相同盒的吗啡产量的相应增加。具有这样的设置的感兴趣的dna构建体可引入附加型dna 或染色体dna或两者中。在一些情况下，当存在奇数个基因盒时，没有成对的基因的启动子位于与载体或染色体dna相邻的位置。
[0163]
在一些实施方案中，宿主细胞包含含有定位标签的酶中的一种或多种。在某些实施方案中，宿主细胞中的一种或多种酶在空间上定位于宿主细胞的区室中。在某种情况下，宿主细胞是酵母细胞。宿主细胞中任何合适的位置可用于定位一种或多种酶。在某些情况下，宿主细胞区室选自线粒体、内质网(er)、高尔基体、液泡、细胞核、质膜和周质。
[0164]
在一些情况下，所述一种或多种酶在空间上定位于酵母细胞中的区室的外部。在某些情况下，所述一种或多种酶在空间上定位于酵母细胞中的区室的内部。在一些情况下，所述一种或多种酶是cor。在一些情况下，该cor酶定位于酵母细胞中的线粒体。在一些实施方案中，宿主细胞包含在细胞中在空间上彼此隔开的cor和t6odm酶。在某些情况下，如果彼此具有最小约80％或更高(例如，80.1％)相似性的t6odm 和codm在宿主细胞中由相同的dna构建体表达，则将基因背靠背安置以使得一个由有义链表达而另一个由反义链表达。该设计可增强具有同源性的两种序列的稳定性。
[0165]
在一些情况下，可改变细胞与培养基之间代谢物的移动以改善吸收或保留。对于单一的转化如蒂巴因的摄取和由t6odm进行的到尼奥品酮的转化(以及到可待因酮的自发重排)，高达2％的二甲基亚砜(dmso)可包含在培养基中以增强代谢物与培养基的交换，使得更多的底物被细胞摄取并且更多的产物被释放。对于两种或更多种转化，结合atp的盒类别中的质膜转运蛋白可缺失，以使得异源途径中的中间体保留在本发明的宿主细胞中。这支持通过该途径的通量并导致终产物的产量提高。或者，在一些情况下，可暂时地调节转运蛋白以使得表达在指数生长期是关闭的(off)以便保留中间体，并且随后在稳定期进行强化以向培养基释放终产物代谢物。
[0166]
在某些实施方案中，吗啡酮还原酶(morb)(例如，来自恶臭假单胞菌)m10与t6odm 一起在宿主细胞中表达以生成产生氢可酮的宿主细胞菌株(参见，例如图20)。酶 morb可包含突变e160g。
[0167]
在本发明的另一实施方案中，吗啡脱氢酶(mora)(例如，来自恶臭假单胞菌m10) 与morb一起在宿主细胞中表达。这样的宿主细胞在体外(例如，在粗裂解物中)和体内(例如，如活细胞)由吗啡制备氢吗啡酮。在某些情况下，mora包含突变c81s。在一些实施方案中，mora变体和morb与t6odm、cor和codm中的一种或多种在宿主细胞中一起表达以由蒂巴因制备氢吗啡酮。在某些实施方案中，t6odm、 cor、codm、mora和morb中的一种或多种变体在产生蒂巴因的菌株中表达以形成氢吗啡酮的总的生物合成途径(图20)。
[0168]
在本发明的另一实施方案中，mora具有辅因子nadp /nadph的增强的供应以支持该酶的活性。在某些实施方案中，改变宿主细胞中的氮代谢以使得nadph依赖性氨同化降低并置换为nadh依赖性同化。这样的宿主细胞可包含以下基因修饰中的任意一种或多种：nadph依赖性gdh1的缺失、nadph依赖性gdh3的缺失、 nadh依赖性gdh2的过表达或异源谷氨
酸脱氢酶的过表达(表3)。
[0169]
表1：感兴趣的宿主细胞菌株
[0170][0171][0172]
在一些实施方案中，所述宿主细胞选自表1中描述的酵母菌株1-7中的一种。在某
些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株1，其包含异源编码序列并能够产生如表1的条目中描述的化合物。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株2，其包含异源编码序列并能够产生如表1的条目中描述的化合物。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株3，其包含异源编码序列并能够产生如表1的条目中描述的化合物。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株4，其包含异源编码序列并能够产生如表1的条目中描述的化合物。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株5，其包含异源编码序列并能够产生如表1的条目中描述的化合物。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株 6，其包含异源编码序列并能够产生如表1的条目中描述的化合物。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株7，其包含异源编码序列并能够产生如表1的条目中描述的化合物。在一些实施方案中，所述宿主细胞选自表4中描述的酵母菌株中的一种。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株csy905(例如，如本文所述的)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株csy906(例如，如本文所述的)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株csy950(例如，如本文所述的)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株csy951(例如，如本文所述的)。在某些实施方案中，所述宿主细胞是酵母菌株csy952(例如，如本文所述的)。
[0173]
表2.用作酵母中的工程化代谢途径的组分的基因
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178][0179][0180]
[0181]
表3对宿主细胞代谢过程的修饰
[0182]
[0183][0184]
表4：使用的工程酿酒酵母菌株
[0185]
缩写：p启动子，t终止子。*csy907在该表中重复以显示其作为对照菌株的应用。
[0186]
[0187][0188][0189]
方法
[0190]
如上所概述的，本发明的方面包括制备感兴趣的苄基异喹啉生物碱(bia)的方法。这样，本发明的方面包括在适于蛋白质产生的条件下培养宿主细胞，以使得异源编码序列被功能性地表达并将感兴趣的起始化合物转化成感兴趣的产物bia。
[0191]
在一些情况下，所述方法是制备苄基异喹啉生物碱(bia)的方法，其包括：在适于蛋白质产生的条件下培养宿主细胞(例如，如本文所述)；向细胞培养物中添加起始化合物；以及从细胞培养物中回收bia。
[0192]
在所述方法的一些实施方案中，起始化合物、bia产物和宿主细胞由表1的一个条目来描述。在某些实施方案中，宿主细胞由表4中的一种菌株来描述。在某些实施方案中，宿主细胞包含表2中所述的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列。
[0193]
培养宿主细胞的任何合适的方法可用于产生感兴趣的bia。所采用的具体方案可以，例如，根据宿主细胞、异源编码序列、期望的bia等而变化。所述细胞可以存在于任何合适的环境中，诸如细胞在其中能够表达一种或多种功能性异源酶的环境中。如本文所用的，在体外仅意指活细胞的外部，而不论细胞的位置如何。如本文所用的，术语在体内指示在细胞的内部，而不论细胞的位置如何。在一些实施方案中，所述细胞在有利于酶表达的条件下并使用可允许在体内产生bia的合适的底物进行培养。在一些实施方案中，功能酶可从产生bia的宿主中在体外条件下提取。在一些情况下，可将宿主细胞放回至多细胞宿主生物内。该宿主细胞可以处于任何生长期，包括但不限于，稳定期和对数生长期等。此外，培养本身可以是连续培养，或者其可以是分批培养。
[0194]
可以使用针对特定细胞类型的任何合适的细胞培养条件。在某些实施方案中，包含各种异源编码序列的宿主细胞可以在标准的或易于优化的条件下用标准细胞培养基和补充剂进行培养。作为一个实例，在不需要选择性压力来进行质粒维持时的标准生长培养基可包含20g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨和20g/l右旋糖(ypd)。含有质粒的宿主细胞可以在含有1.7g/l酵母氮碱基、5g/l硫酸铵以及20g/l右旋糖并补充有对于生长和选择性所必需的合适的氨基酸的合成完全(sc)培养基中生长。对于诱导酶表达可能有用的替代碳源包括但不限于蔗糖、棉子糖和半乳糖。细胞可以在实验室中在容器中(例如，在体积为1-1000ml或更大的试管或烧瓶中)在任何合适的温度(例如，30℃)下在任何合适速率(例如，200rpm)的振荡下生长。培养体积也可以按比例扩大以便在更大的发酵容器中生长，例如，作为工业过程的一部分。
[0195]
用于优化宿主细胞中异源多核苷酸的表达的任何合适的密码子优化技术可适于在本发明的宿主细胞和方法中使用，参见例如，gustafsson,c.等人(2004)trends biotechnol,22, 346-353，该文献通过引用全文并入本文。
[0196]
本发明方法还可以包括将起始化合物添加到细胞培养物中。任何合适的添加方法可适于在本发明方法中使用。所述细胞培养物可补充有足够量的感兴趣的起始物质(例如，如本文所述的)，例如，mm至μm量如约1-5mm的起始化合物。可以理解，添加的起始物质的量、添加时机和速率、添加的物质的形式等可根据多种因素而变化。起始物质可以以纯物质或预先溶解在合适的溶剂(例如，细胞培养基、水或有机溶剂)中添加。起始物质可以以浓缩的形式(例如，超过所需浓度的10倍)添加，以使添加时对细胞培养基的稀释减至最小。起始物质可以分一批或多批或通过经延长的时间段(例如，数小时或数天)的连续加入而添加。
[0197]
本发明方法还可以包括从细胞培养物中回收bia。任何合适的分开和分离方法(例如，色谱法或沉淀法)可适于在本发明方法中使用以从细胞培养物中回收感兴趣的bia。可使用过滤方法来分离细胞培养物中的可溶性部分与不溶性部分。在一些情况下，使用液相色谱法(例如，反相hplc、大小排阻色谱法、正相色谱法)来从细胞培养物的其他可溶性组分
中分离bia。
[0198]
还包括将宿主细胞工程化用于实现产生感兴趣的bia的目的的方法。将dna插入到宿主细胞可以使用任何合适的方法来实现。所述方法用于将异源编码序列插入到宿主细胞中，以使得宿主细胞功能性地表达酶并将感兴趣的起始化合物转化为感兴趣的产物bia。
[0199]
任何合适的启动子可在本发明的宿主细胞和方法中使用。驱动异源编码序列的表达的启动子可以是组成型启动子或诱导型启动子，条件是该启动子在宿主细胞中可以具有活性。异源编码序列可以由它们的天然启动子来表达，或者可以使用非天然启动子。这样的启动子在使用它们的宿主中可以为低到高的强度。启动子可以是调节型或组成型的。在某些实施方案中，使用没有受到葡萄糖抑制或仅被培养基中葡萄糖的存在轻度抑制的启动子。感兴趣的启动子包括但不限于，糖酵解基因的启动子如枯草芽孢杆菌tsr基因的启动子(编码果糖二磷酸醛缩酶)或来自酿酒酵母的gapdh启动子(编码甘油醛磷酸脱氢酶)，面包酵母的adh1启动子，磷酸盐饥饿诱导的启动子如酵母的pho5启动子，来自地衣芽孢杆菌(b.licheniformis)的碱性磷酸酶启动子，酵母诱导型启动子如 gal1-10、gal1、gall、gals，阻抑型启动子met25、teto，以及组成型启动子如甘油醛 3-磷酸脱氢酶启动子(gpd)、醇脱氢酶启动子(adh)、翻译-延长因子-1-α启动子(tef)、细胞色素c-氧化酶启动子(cyc1)、mrp7启动子等。还可使用含有可由激素如糖皮质激素、类固醇和甲状腺激素诱导的启动子的自主复制酵母表达载体，并且该自主复制酵母表达载体包括但不限于糖皮质激素应答元件(gre)和甲状腺激素应答元件(tre)。这些和其他实例描述于美国专利号7,045,290，其通过引用而并入，包括其中引用的参考文献。可以使用含有组成型或诱导型启动子如因子、醇氧化酶以及pgh的另外的载体。此外，任何启动子/增强子组合(根据真核生物启动子数据库(eukaryotic promoter database)epdb)也可用于驱动基因的表达。可选择任何方便合适的启动子用于宿主细胞，例如大肠杆菌。也可以使用启动子选择来优化转录物并因此优化酶水平，以在使能源资源达到最小的同时使产量最大化。
[0200]
任何合适的载体可在本发明的宿主细胞和方法中使用。感兴趣的载体包括在酵母和其他细胞中使用的载体。酵母载体可分为4个总类别：整合载体(yip)、自主复制高拷贝数载体(yep)、自主复制低拷贝数载体(ycp)以及用于克隆大片段的载体(yac)。载体dna可以通过任何合适的转化或转染技术引入到原核或真核细胞中。
[0201]
实用性
[0202]
本发明的宿主细胞和方法，例如，如上所述，可用于多种应用。感兴趣的应用包括但不限于：研究应用和治疗应用。本发明的方法用于多种不同的应用中，包括其中对bia的产生感兴趣的任何适当的应用。
[0203]
本发明的宿主细胞和方法用于多种治疗应用。感兴趣的治疗应用包括其中对包含bia的药物产品的制备感兴趣的那些应用。这样，本发明的宿主细胞用于在治疗上具有活性的 bia或其前体的供应。在一些情况下，所述宿主细胞和方法用于产生商业规模量的bia，其中这些化合物的化学合成是低产的且并非用于大规模生产的可行手段。在某些情况下，所述宿主细胞和方法在将包括例如5,000-200,000升容量的生物反应器(发酵罐)的发酵设备中使用，从而允许用于治疗产品的感兴趣的bia的快速产生。这样的应用可包括由可发酵的碳源如纤维素、淀粉和游离糖工业规模生产bia。
[0204]
本发明的宿主细胞和方法用于多种研究应用中。本发明的宿主细胞和方法可以用
于分析多种酶对多种感兴趣的bia的生物合成途径的影响。此外，可对宿主细胞可进行工程化以产生bia，其可用于测试还未经证实的治疗功能中的感兴趣的生物活性。在一些情况下，用于包含编码多种酶的多种异源编码序列的宿主细胞的工程化阐明了朝向感兴趣的 bia或其前体的高产生物合成途径。在某些情况下，研究应用包括感兴趣的治疗分子的前体的产生，该前体可随后进一步化学修饰或衍生为所需产物或用于针对增加的感兴趣的治疗活性的筛选。在一些情况下，宿主细胞菌株用于筛选在这样的途径中感兴趣的酶活性，这可能导致通过在这些菌株中产生的bia代谢物的转化而发现酶。
[0205]
本发明的宿主细胞和方法可用作专门产生植物代谢物的生产平台。
[0206]
本发明的宿主细胞和方法可用作药物文库开发以及植物酶发现的平台。例如，本发明的宿主细胞和方法可通过采用酵母菌株产生感兴趣的骨架分子如前托品，并进一步通过组合生物合成或通过化学手段将化合物结构功能化来应用于基于天然产物的药物文库的开发。通过以这种方式产生药物文库，任何潜在的药物命中(hit)已经与适合于大规模培养和生产的生产宿主相关联。作为另一实例，这些本发明的宿主细胞和方法可应用于植物酶发现。本发明的宿主细胞提供了用于表达植物est文库以鉴定新的酶活性的限定代谢物的干净背景(clean bacground)。本发明的宿主细胞和方法提供了用于酵母中植物酶的功能性表达和增加的活性的表达方法和培养条件。
[0207]
试剂盒和系统
[0208]
本发明的方面还包括试剂盒和系统，其中该试剂盒和系统可包括在本发明的方法中使用的一种或多种组分，例如，如本文所述的宿主细胞、起始化合物、异源编码序列、载体、培养基等。在一些实施方案中，本发明的试剂盒包括宿主细胞(如本文所述的)，和选自起始化合物、异源编码序列和/或包含异源编码序列的载体的一种或多种组分，以及培养基。
[0209]
本文描述的任何组分可以在试剂盒中提供，例如，包含一种或多种异源编码序列的宿主细胞、起始化合物、适合于在表达系统(例如，细胞、克隆载体、多克隆位点(mcs)、双向启动子、内部核糖体进入位点(ires)等)中使用的组分、培养基等。适合在制备和使用异源编码序列、克隆载体和表达系统中使用的多种组分可应用于本发明的试剂盒中。试剂盒还可以包括管、缓冲液等以及使用说明。试剂盒的各种试剂组分可以存在于分开的容器中，或者它们中的一些或全部可根据需要在单个容器中预先合并成试剂混合物。
[0210]
在一些情况下，试剂盒包含宿主细胞，该宿主细胞选自产生牛心果碱的宿主细胞、产生血根碱前体的宿主细胞、产生原小檗碱的宿主细胞、产生蒂巴因的宿主细胞和产生阿片的宿主细胞。宿主细胞可以包含一种或多种异源编码序列(例如，如本文所述的)。在某些情况下，该细胞表达感兴趣的bia(例如，如本文所述的)。
[0211]
本发明的方面包括用于产生感兴趣的bia的系统，其中该系统可包含含有异源编码序列的工程宿主细胞(例如，如本文所述的)、起始化合物、培养基、发酵罐和发酵设备，例如，适合于维持宿主细胞的生长条件、采样以及监测设备和组分的装置等。适于在酵母细胞的大规模发酵中使用的多种组分可用于本发明的系统中。
[0212]
在一些情况下，所述系统包含用于工程宿主细胞的大规模发酵以及由发酵的宿主细胞产生的bia化合物的监测和纯化的组成部分。在某些实施方案中，在一定条件下，将一种或多种起始化合物(例如，如本文所述的)添加到系统中，通过该条件在发酵罐中的工程
宿主细胞产生一种或多种期望的bia产物。在某些情况下，感兴趣的bia产物是阿片样物质产物，如可待因、尼奥品、吗啡、neomorphine、氢可酮、羟考酮、氢吗啡酮、二氢可待因、14-羟基可待因或二氢吗啡。
[0213]
在一些情况下，所述系统包括用于监测和或分析由本发明的宿主细胞产生的一种或多种 bia化合物的装置。例如，如本文所述的lc-ms分析系统、色谱系统或其中可分析样品并将其与标准进行比较的任何合适的系统，例如，如本文所述的。所述发酵培养基可在发酵前和发酵期间的任何合适的时间通过采样和分析进行监测。当起始化合物向感兴趣的bia产物转化完成时，可停止发酵，并可进行bia产物的纯化。这样，在一些情况下，本发明的系统包括适合于从产物产生到的宿主细胞培养基中纯化感兴趣的bia产物的纯化组成部分。该纯化组成部分可以包括可用于纯化发酵的bia产物的任何合适的手段，包括但不限于硅胶色谱法、反相色谱法、离子交换色谱法、hic色谱法和大小排阻色谱法。在一些情况下，本发明系统提供了向系统输入一种或多种起始化合物后产生和分离感兴趣的bia发酵产物。
[0214]
提出以下实施例，以便为本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整的公开内容和描述，且以下实施例并非旨在限制发明人视为其发明的范围，也非旨在表示下面的实验是进行的全部或仅有的实验。已努力确保关于所用数字(例如，量、温度等) 的准确性，但一些实验误差和偏差应予以考虑。除非另外指出，份数(parts)是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，且压力为大气压或接近大气压。
[0215]
实验
[0216]
i.产生牛心果碱的酵母菌株
[0217]
开发了酿酒酵母菌株，其通过来自若干不同物种的6omt、cnmt或4’oμτ基因的过表达具有提高的牛心果碱产量。
[0218]
图1描绘了通过来自罂粟和黄唐松草的甲基转移酶进行的全去甲劳丹碱的体内甲基化。在每幅图中，单独表达各甲基转移酶的宿主细胞的培养物在全去甲劳丹碱的存在下生长并且使用lcms检测甲基化产物。数据表明甲基转移酶具有宽的底物特异性，该特异性为替代甲基化途径提供支持。(a)来自两个物种的6omt酶对全去甲劳丹碱显示出类似的甲基化活性。甲基化产物的裂解示于插图中。(b)pscnmt比 tfcnmt显示出更高的对作为底物的全去甲劳丹碱的甲基化活性。甲基化产物的裂解示于插图中。(c)来自两个物种的4’oμτ酶对全去甲劳丹碱显示出相似的甲基化活性。甲基化产物的裂解示于插图中。
[0219]
图2描绘了从全去甲劳丹碱到牛心果碱的替代甲基化路径。当该途径的起始物质是全去甲劳丹碱(1)时，6omt、cnmt或4’oμτ可以作用于该化合物，从而产生三种不同甲基化的中间体。最初被6omt甲基化的bia 2随后可被cnmt或4’oμτ甲基化。同样地，最初被cnmt甲基化的bia 3随后可被6omt或4’oμτ甲基化。相似地，最初被4’oμτ甲基化的bia 4随后可被6omt或cnmt甲基化。先前被 6omt和4’oμτ甲基化的bia 5可被cnmt甲基化，以产生牛心果碱。先前被6omt 和cnmt甲基化的bia 6可被4’omt甲基化，以产生牛心果碱。先前被cnmt和 4’omt甲基化的bia 7可被6omt甲基化，以产生牛心果碱。
[0220]
图3描绘了从去甲基乌药碱到牛心果碱的替代甲基化路径。当该途径的起始物质是去甲基乌药碱时，6omt或cnmt可以作用于该化合物，从而产生两种不同甲基化的产物。最初被6omt甲基化的bia 10随后可被cnmt甲基化。最初被cnmt甲基化的bia 11随后可被6omt
甲基化。先前被6omt和cnmt甲基化的bia 12(也被称为n-甲基乌药碱)随后顺序地受到cyp80b1和4’omt的作用以产生牛心果碱。
[0221]
n-甲基乌药碱的产生：pscnmt的表达滴定。对当pscnmt基因拷贝数随着供以甲基乌药碱的菌株中的tf6omt或ps6omt而变化时n-甲基乌药碱(bia 12)的产量进行测量。当pscnmt基因拷贝数随着供以去甲基乌药碱的菌株中的tf6omt或 ps6omt而变化时，显示了n-甲基乌药碱(bia 12)的产量。将表达ps6omt或 tf6omt以及pscnmt的一个或两个拷贝的宿主细胞的粗细胞裂解物与去甲基乌药碱一起温育。使用lcms测量双甲基化产物n-甲基乌药碱。使用ps6omt时，当使用2
×
pscnmt代替1
×
pscnmt时离子计数从2
×
107增加至5.5
×
107。使用tf6omt 时，当使用2
×
pscnmt代替1
×
pscnmt时离子计数从1.5
×
107增加到6
×
107。数据表明，甲基转移酶cnmt的较高的基因拷贝数可增加n-甲基乌药碱的产量。
[0222]
ii.产生血根碱前体的酵母菌株
[0223]
开发了产生原小檗碱和包括碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、顺式-n-甲基刺罂粟碱、前托品和二氢血根碱在内的苯菲啶生物碱的菌株。
[0224]
图4描绘了宿主细胞中存在的用于由牛心果碱制备血根碱的合成途径。尽管该途径可以更长，如其他图中所示从全去甲劳丹碱或去甲基乌药碱开始，但该特定途径的描绘开始于牛心果碱并且结束于血根碱。如果所需的最终结果是在从全去甲劳丹碱到血根碱的途径中的中间体之一，则该途径可包括比所显示的那些更少的酶。在工程酵母菌株内添加多个酶促步骤，特别是那些由酶cfs、sts、tnmt、msh、p6h和dbox 催化的步骤，产生了多种原小檗碱和苯菲啶化合物。
[0225]
1.简介
[0226]
微生物生产宿主已经针对bia生物合成途径的血根碱分支中的若干原小檗碱和前托品生物碱进行了工程化。具体而言，酵母菌株被工程化为由培养底物全去甲劳丹碱(1) 产生化合物碎叶紫堇碱(4)、刺罂粟碱(5)、(s)-顺式-n-甲基刺罂粟碱(6)和前托品(7)(图11)。基于异源酶的数目和酶的类型，这些途径显示了在微生物宿主中重建的复杂的植物天然产物途径。特别地，证实了包括八个酶促步骤的途径，其包括三个由细胞色素p450催化的步骤和11个总异源表达盒。针对这些复杂途径在酵母中的重建开发了若干途径优化策略，以用于专门的植物代谢物的生物合成的有效微生物平台。特别地，使用支持在大的多步骤途径的背景(context)下多种植物细胞色素p450 酶的功能性表达的策略，包括表达平衡、cpr匹配和培养条件优化。这些通用设计策略可以更广泛地用于支持酵母中多种不同植物天然产物途径的工程化。
[0227]
图11描绘了对酿酒酵母中原小檗碱和前托品生物碱生物合成进行的工程化。向优化的前托品生产菌株供应前体分子全去甲劳丹碱，前体分子全去甲劳丹碱通过三种染色体整合的甲基转移酶(ps6omt、pscnmt、ps4’omt)转化成关键分支点中间体牛心果碱。染色体整合的小檗碱桥酶(psbbe)将(s)-牛心果碱转化为(s)-金黄紫堇碱。细胞色素p450碎叶紫堇碱合酶(eccfs)和刺罂粟碱合酶(ecsts)的两个拷贝(一个是染色体整合的，一个由酵母人工染色体表达)用来自拟南芥的细胞色素 p450-nadph还原酶(atr1)的染色体整合的拷贝进行表达以分别产生化合物(s)
‑ꢀ
碎叶紫堇碱和(s)-刺罂粟碱。接着，四氢原小檗碱-n-甲基转移酶(pstnmt)将(s)
‑ꢀ
刺罂粟碱转化为(s)-顺式-n-甲基刺罂粟碱，随后细胞色素p450顺式-n-甲基刺罂粟碱 14-羟化酶(psmsh)由顺式-n-甲基刺罂粟碱产生前托品。
of the coupling of two distantly related arabidopsis thaliananadph-cytochrome p450 reductases with p450 cyp73a5.j.biol.chem.272, 19176-86(1997))。向携带cpr变体和cfs变体的所有组合的菌株供应2mm全去甲劳丹碱并使菌株生长96小时。使用lc-ms分析生长培养基的样品。通过观察到的裂解图案与报道的裂解图案的比较(图12b)来确认碎叶紫堇碱的产生。
[0236]
数据表明特异性cpr配对和p450表达水平可以显着地影响异源微生物宿主中植物 p450的功能活性。具体而言，所有cfs变体的atr1支持的活性比任何其他测试的 cpr变体好20-50倍，并产生了高达600μg/l的碎叶紫堇碱(图12c)。尽管天然酵母cpr和eccpr能够支持来自eccfs和amcfs的低水平的活性，但pscpr并没有与任何表达的p450偶联。当与合适的cpr配对时，所有的cfs变体导致碎叶紫堇碱产生；然而，eccfs和amcfs的活性显著高于pscfs。所报道的这些酶的km值的差异支持所观察到的酵母中的eccfs和amcfs变体之间活性的差异(eccfs， 900nm；amcfs，1.9μμ；pscfs，没有报道km)。数据还表明，cfs变体由低拷贝质粒表达时的碎叶紫堇碱产量水平显著高于由高拷贝质粒表达时的水平。
[0237]
p450自然地定位于内质网(er)，并且这些酶在酵母中的过表达可引起其中er膜增生的应激响应。活性数据表明，植物p450在酵母中的高水平表达可能压垮er并损害该酶的活性。为了考察作为活细胞中表达水平的函数的p450浓度和亚细胞定位，将cfs变体在高拷贝和低拷贝质粒中用egfp进行c-末端标记，并通过共聚焦显微术来分析包含这些构建体的细胞。标记的酶的er定位通过与er标记物 dsred-kar2-hdel共定位来确认(图12d)。
[0238]
在由高拷贝或低拷贝质粒表达标记的cfs变体的细胞之间观察到两个主要差异。首先，相比于仅有gfp的构建体，在含有p450-gfp融合构建体的细胞中观察到gfp 阳性细胞的数目显著降低，并且该差异在该融合体由高拷贝质粒表达时(27％)比由低拷贝质粒表达时(56％)更显著。该数据表明，相比于表达荧光报道基因的质粒，细胞保持表达细胞色素p450酶的质粒的能力降低，以及由低拷贝质粒表达植物p450 导致在细胞群体中更稳定的表达，并因此可导致更高的总活性。第二，在高拷贝和低拷贝质粒中携带p450-gfp表达盒的细胞之间er的形态不同。在携带高拷贝质粒的细胞中，通常在与细胞核或质膜相邻的高度浓缩的亮斑中观察到p450-gfp融合蛋白。相比之下，在携带低拷贝质粒的细胞中，er膜保持分布在整个细胞中并且gfp荧光水平微弱，表明p450的浓度较低。因此，在植物p450以较低水平表达的情况下，这些工程细胞中er膜的形态更类似于野生型细胞中er膜的形态。总之，共聚焦显微镜和功能活性数据表明，植物p450的高水平表达可引起极端的er增生，这对于酵母宿主而言是高度应激的，并且不利于酶的活性。因此，对于异源酵母宿主中植物 p450的最佳表达策略是由低拷贝质粒表达或稳定整合到染色体中(图12e)。
[0239]
最后，考察植物p450表达水平和调节对酵母宿主中碎叶紫堇碱产量的影响。由在其中cfs在以下五个不同的启动子的控制下在低拷贝质粒中表达的工程化途径变体来考察碎叶紫堇碱的产量：pgpd(水平：强，调节：早期)、ptef1(强，组成型)、 ppgk1(中等，早期)、ptpi1(中等，早期)和phxt7(强，晚期)。如前文所述，向携带指定构建体的菌株供应2mm全去甲劳丹碱并使该菌株在指定的条件下生长 96小时。用lc-ms分析生长培养基的样品。gpd启动子相比于其他测试的启动子提供了碎叶紫堇碱产量高达12倍的提高(图12f)。数据表明，表达水平和调节策略均在优化异源酵母宿主中植物p450的活性中发挥作用。例如，tef启动子表现出与 pgpd相似的强度，但具有不同的调节谱，而ppgk1表现出与pgpd相似的调节谱，
但具有不同的强度；然而，这些启动子中的每一个均导致不同的碎叶紫堇碱产量水平。这些结果表明，优化的产生碎叶紫堇碱的酵母菌株被工程化为以低水平表达植物 p450 eccfs(由低拷贝质粒表达或在gpd启动子的控制下进行染色体整合)并工程化为将该植物p450与atr1 cpr配对。该工程菌株产生了高达600μg/l的碎叶紫堇碱，并能够转化高达38％的金黄紫堇碱。
[0240]
图12描绘了(s)-碎叶紫堇碱的微生物生产。(a)描绘全去甲劳丹碱向(s)-碎叶紫堇碱的转化的示意图，着重强调了优化的酶促步骤。虚线箭头表示多个酶促步骤。方案标记遵循在图11中示出的标记。(b)对供以2mm全去甲劳丹碱并生长96小时的酵母菌株的生长培养基的lc-ms分析。lc-ms迹线显示，载体对照菌株(左图)产生了金黄紫堇碱(峰3)，但在326eic下无峰。当eccfs酶被表达时(右图)，在326eic 下检测到峰(峰4)，并且裂解(ms-ms，下图)确认了代谢物的身份为碎叶紫堇碱。 (c)(s)-碎叶紫堇碱产生依赖于酶变体和细胞色素p450 nadph还原酶配偶体配对。来自花菱草(eccfs)、蓟罂粟(amcfs)和罂粟(pscfs)的碎叶紫堇碱合酶(cfs) 的变体在来自天然酵母或各种植物来源(拟南芥、花菱草、罂粟)的细胞色素p450 还原酶(cpr)整合到trp基因座中的酵母菌株中由低拷贝质粒表达。(d)p450表达水平导致不同的er形态。在高拷贝(上图)或低拷贝(中图)质粒上用gfp在c 末端标记的eccfs定位于内质网，但显示出不同的er增生形态。示出了野生型er (没有异源p450表达)用于比较(下图)。百分比表示在指示的表达条件下占gfp 阳性的酵母群体的比例。(e)cfs的稳定表达(低拷贝质粒或染色体整合)提高了碎叶紫堇碱产量和金黄紫堇碱的转化效率。eccfs在高拷贝质粒(2微米，trp选择标记)、低拷贝质粒(cen/ars，trp选择标记)上表达或整合到酵母染色体的met15 基因座中。(f)启动子选择影响cfs活性。eccfs在5种不同的启动子(gpd、hxt7、 pgk1、tef、tpi1)的控制下由具有ura选择性的低拷贝质粒进行表达。(c、d) 中的数据是至少3个独立实验的代表，且(e、f)中的数据报告为至少3个独立实验的平均值
±
s.d.。
[0241]
c.针对刺罂粟碱对优化的微生物生产宿主进行工程化
[0242]
血根碱分支的下一个步骤是通过刺罂粟碱合酶(sts)—一种与cfs密切相关的植物细胞色素p450—将碎叶紫堇碱转化为刺罂粟碱(图13)。作为对产生刺罂粟碱的菌株进行工程化的起始点，使用了用cfs阐明的p450优化策略；具体而言，(i)由低拷贝质粒表达植物p450，(ii)控制由gpd启动子表达p450，以及(iii)将p450与 atr1 cpr配对。然而，由于通往刺罂粟碱的生物合成途径包括两种植物p450，因此考察另外的策略用于进一步优化这些酶在多步骤途径的背景中的活性。
[0243]
首先考察sts和cfs的植物变体的配对以探索特定配对之间的任何协同效应。对来自花菱草(ecsts)、蓟罂粟(amsts)和罂粟(pssts)的sts的变体进行酵母密码子优化和合成。向具有整合至染色体中的atr1 cpr表达盒以及在低拷贝质粒上携带cfs和sts变体的不同组合的酵母菌株供应2mm全去甲劳丹碱并使该菌株生长96小时。用lc-ms分析生长培养基的样品。通过将洗脱时间和裂解图案与标准 (chromodex)和所报道的裂解图案进行比较来确认刺罂粟碱的产生(图13b)。数据表明，ecsts和pssts两者的异源表达均导致工程酵母菌株中刺罂粟碱的产生，而amsts在这些条件下没有活性。还报道了amsts将金黄紫堇碱转化为南天竹碱 (nandinine)；然而，并未检测到该产物。最具生产力的p450酶配对是eccfs和 ecsts，其产生了14μg/l刺罂粟碱，相对于其他的酶组合提高了高达6倍(图13c)。所报道的
这些酶的km值的差异支持在酵母中的sts变体之间所观察到的活性的差异 (ecsts，400nm；amsts，5.2μμ；pssts，没有报道km)。然而，即使采用最具生产力的p450配对，碎叶紫堇碱向刺罂粟碱的转化效率也仅为25％。
[0244]
接着研究了用于改善碎叶紫堇碱向刺罂粟碱的转化效率的方法。考察了生长温度对我们的异源酵母宿主中植物p450活性的影响。携带具有与每个sts变体配对的eccfs 的生物合成途径的酵母菌株在30℃和25℃下生长。如前文所述，向携带指定的构建体的菌株供应2mm全去甲劳丹碱，并在指定的条件下生长96小时。使用lc-ms 分析生长培养基的样品。相比于在30℃下生长，表达eccfs和ecsts的菌株在25℃下生长时，该菌株的刺罂粟碱产量增加了3倍，至40μg/l的滴度(图13d)。数据表明，该菌株在od的基础上更具生产力，这意味着提高的刺罂粟碱产量是由于酶的总活性的提高，并非由于较高的细胞密度。很可能是，由于改变这些条件而对总酵母细胞过程的影响导致改善了p450的折叠及定位，并因此提高了活性。
[0245]
考察了改变cfs与sts的基因拷贝数比例。由质粒表达酶的实验表明，相比于1：1 的cfs与sts之比，2：2的cfs与sts之比导致刺罂粟碱产量增加了3倍(图13e)。总之，数据表明，优化的产生刺罂粟碱的酵母菌株被工程化为以2：2的最佳基因拷贝数比例表达eccfs和ecsts，并且在25℃下生长时产生了刺罂粟碱并提高了金黄紫堇碱向碎叶紫堇碱的转化效率以及碎叶紫堇碱向刺罂粟碱的转化。
[0246]
图13描绘了(s)-刺罂粟碱生产的优化。(a)描绘全去甲劳丹碱向(s)-刺罂粟碱的转化的示意图，着重强调了优化的酶促步骤。虚线箭头表示多个酶促步骤。方案标记遵循图11中示出的标记。(b)对供以2mm全去甲劳丹碱并生长96小时的酵母菌株的生长培养基进行lc-ms分析。lc-ms迹线显示，载体对照菌株产生碎叶紫堇碱(峰4， m/z＝326)，但在m/z＝324eic下没有峰。当ecsts酶表达时，在m/z＝324eic下检测到峰(峰5)，其与刺罂粟碱标准在同一时间洗脱出。刺罂粟碱标准(ms-ms)的裂解与峰5的裂解相匹配，从而确认了该代谢物的身份为刺罂粟碱。lc-ms迹线是至少三个独立实验的代表。(c)刺罂粟碱产量随着cfs和sts的物种变体的组合而变化。cfs和sts变体的全部配对由单独的低拷贝质粒表达。(d)该工程酵母菌株在25℃下的生长改善了sts的活性。sts的每个变体与eccfs(在单独的低拷贝质粒上)一起表达，并在25℃或30℃下生长。cfs和sts的基因拷贝数影响刺罂粟碱产量。(e)通过将eccfs表达盒的拷贝整合至染色体中的met15基因座处以及在低拷贝质粒上表达eccfs和ecsts的另外的拷贝来改变基因拷贝数。本实验中的菌株变体均携带三种质粒(不论p450拷贝数如何)，以确保质粒负荷与培养基组成是一致的。数据表明，增加两种植物p450的拷贝通常导致增加的刺罂粟碱产量。最高的刺罂粟碱产量由eccfs的两个拷贝和ecsts的两个拷贝产生，相比于原始表达系统 (每种酶一个拷贝)这将产量水平提高了约3倍。
[0247]
d.针对(s)-顺式-n-甲基刺罂粟碱和前托品对微生物生产宿主进行工程化
[0248]
该途径中的下一个步骤是通过四氢原小檗碱-n-甲基转移酶(tnmt)将刺罂粟碱转化为(s)-顺式-n-甲基刺罂粟碱(图14a)。将tnmt添加至含有eccfs和ecsts的 yac中，该yac在具有eccfs和ecsts的整合的拷贝的菌株中进行表达。向携带指定的构建体的菌株供应2mm全去甲劳丹碱并在25℃下生长96小时，并用lc-ms 分析生长培养基的样品。通过将裂解图案与所报道的裂解图案进行比较来确认顺式
ꢀ‑
n-甲基刺罂粟碱的产生(图14b)。当tnmt
在优化的产生刺罂粟碱的菌株中表达时，产生了顺式-n-甲基刺罂粟碱并且在培养基中无法检测到刺罂粟碱，表明tnmt是高效的并能够达到100％的转化效率。
[0249]
前托品合成的最终步骤是通过细胞色素p450(s)-顺式-n-甲基刺罂粟碱14-羟化酶 (msh)对(s)-顺式-n-甲基刺罂粟碱进行羟基化。将细胞色素p450的优化技术应用于msh表达，包括由稳定的构建体(在这种情况下为yac)表达以及与atr1还原酶配偶体配对。向携带指定的构建体的菌株供应2mm全去甲劳丹碱并在25℃下生长96小时。通过将洗脱时间和裂解图案与标准和所报道的裂解图案进行比较来确认前托品的产生(图14c)。数据表明，msh是一种高效的酶，使得优化的产生前托品的菌株产生前托品并且实现顺式-n-甲基刺罂粟碱向前托品的转化。
[0250]
图14描绘了异源前托品生物合成途径的工程化。(a)描绘全去甲劳丹碱向前托品的转化的示意图，着重强调了优化的酶促步骤。虚线箭头表示多个酶促步骤。方案标记遵循在图11中所示的标记。(b)对供以2mm全去甲劳丹碱并生长96小时的酵母菌株的生长培养基进行lc-ms分析。lc-ms迹线显示，载体对照菌株产生刺罂粟碱(峰 5，m/z＝324)，但在m/z＝338或354eic下没有峰。当tnmt酶表达时，在m/z＝338eic下检测到峰(峰6)并且裂解(ms-ms)确认了该代谢物的身份为顺式-n
‑ꢀ
甲基刺罂粟碱。(c)当加入msh时，在m/z＝354eic下检测到峰，其与前托品标准在同一时间洗脱出并且前托品标准的裂解(ms-ms)与峰7的裂解(m/z＝354)相匹配，从而确认了该代谢物的身份为前托品。lc-ms迹线是至少三个独立实验的代表。
[0251]
5.针对原小檗碱和前托品生物碱生产对培养条件的优化
[0252]
为了产生更多的碎叶紫堇碱或刺罂粟碱，将酵母菌株构建为过表达细胞色素b5以优化细胞色素p450的活性。具有cfs和sts的细胞色素b5。对由具有和不具有过表达的细胞色素b5的宿主细胞产生的碎叶紫堇碱和/或刺罂粟碱的产量进行测量。使培养物在全去甲劳丹碱的存在下生长并采用lcms在培养基中检测产物。数据表明，在一些情况下当细胞色素b5表达时，碎叶紫堇碱(例如，用amcfs)和/或刺罂粟碱(例如，用eccfs/amsts)的水平提高。
[0253]
为了产生更多的原小檗碱生物碱，通过与未折叠蛋白质响应和内质网(er)增生相关的基因的缺失对酵母菌株进行优化，以提高bia产量。基因缺失的实例包括ire1、 hac1、opi1、ino1、ino2和ino3(表3)。细胞色素p450的表达诱导未折叠蛋白质响应，并使er增生。与这些应激响应相关的基因的缺失可以控制或减少宿主细胞上的总负担，并提高途径性能。
[0254]
在宿主菌株中删除参与多向药物响应的基因，包括atp结合盒(abc)转运蛋白、多药抗药性(mdr)泵和相关的转录因子，以减少bia分子向培养基中的输出。基因的实例包括pdr1、stb5、pdr3、pdr5、snq2、yor1、tpo1、tpo2、tpo3、 tpo4、pdr10、pdr1 1、pdr15、pdr16、pdr17、qdr1、qdr2、qdr3、flr1、 aqr1、aqr2和cin5。基因缺失包括单个缺失或任意组合的多个缺失。
[0255]
转运蛋白敲除体中的bia产生。对从具有参与化合物跨细胞膜转运的各种蛋白质的修饰的宿主细胞产生的牛心果碱、金黄紫堇碱、碎叶紫堇碱和刺罂粟碱产量进行测量：将dpdr1、dpdr5、dsnq2、dyor1、dpdr3、dcin5和dpdr1dpdr3敲除体与野生型对照进行比较。使培养物在全去甲劳丹碱的存在下生长，并在生长96小时后用lcms在培养基中检测产物。数
据表明，一些修饰(例如，缺失)比其他修饰产生更高水平的牛心果碱、金黄紫堇碱、碎叶紫堇碱或刺罂粟碱。
[0256]
将参与多向药物响应的基因，包括atp结合盒(abc)转运蛋白、多药抗药性(mdr) 泵和相关的转录因子，置于调节的(诱导型或生长阶段依赖的)启动子的控制下以实现对bia转运的时序控制。一个实例是将重要的转运蛋白基因置于稳定期启动子的控制下，这将导致bia保留在细胞内直到稳定期，从而提高将起始物质转化为终产物的可能性。
[0257]
4.方法
[0258]
a.质粒和酵母菌株构建
[0259]
使用常规方法合成寡核苷酸。用化学感受态大肠杆菌(top10,lifetech,f-mcra δ(mrr-hsdrms-mcrbc)δlacx74 nupg reca1 arad139δ(ara-leu)7697 gale15 galk16 rpsl(strr)enda1λ-)进行克隆。在具有以下合适的抗生素的 luria-bertani培养基(emd chemicals)中培养大肠杆菌：100μg/ml氨苄青霉素 (emd chemicals)或50μg/ml卡那霉素(emd chemicals)。根据制造商的说明 (epoch life science)使用旋转柱(spin column)从大肠杆菌培养物中纯化质粒。由elim biopharmaceuticals(hayward,ca)进行测序。在本研究中描述的酿酒酵母菌株均来源于w303α(matαleu2-3,112trp1-1 can1-100 ura3-1 ade2-1 his3-11,15)。使用标准乙酸锂方案进行酵母转化。在ypd或用于质粒保持并补充有2％右旋糖 (w/v)的合适的合成缺陷型(drop out)培养基中培养酵母。
[0260]
eccfs(bag75113)、eccpr(aac05022)、ecsts(bad98250)和amsts(abr14721) 的基因序列进行酵母密码子优化，并由采用dnaworks(hoover,d.m.&lubkowski, j.dnaworks:an automated method for designing oligonucleotides for pcr-basedgene synthesis.nucleic acids res.30,e43(2002))设计的寡核苷酸进行组装。amcfs (abr14722)、pscfs(adb89213)、pssts(adb89214)和psmsh(agc92398) 进行酵母密码子优化并由geneart(life technologies)合成。
[0261]
用gateway克隆技术(life technologies)构建本研究中描述的大多数酵母表达载体。将酶使用pfuultrall fusion hs dna聚合酶(life technologies)或expand highfidelity聚合酶(roche)进行pcr扩增，使用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen) 进行纯化，并通过topo克隆或采用bp克隆酶ii和pdonr221载体(lifetechnologies)进行的bp重组反应而克隆到pentr载体中。随后使用lr克隆酶ii (life technologies)将所有基因重组至所选定的来自lindquist实验室的pag表达载体(通过addgene获得)(alberti,s.,gitler,a.d.&lindquist,s.a suite ofcloning vectors for high-throughput genetic analysis in saccharomycescerevisiae.913-919(2007).doi:10.1002/yea)。在本研究中使用了多种引物和质粒。对于采用eccfs测试各种启动子的试验，用sacl/spel消化pcs2238以去除gpd启动子，并使用标准连接技术将tef1、pgk1、tpi1或hxt7启动子连接到该位点。
[0262]
用geneart higher order genetic assembly system(life technologies)构建酵母人工染色体(yac)。使用采用dna designer针对higher order genetic assembly 设计的引物和expand high fidelity聚合酶(roche)，通过pcr反应来产生dna片段。用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen)纯化dna片段，并经由电穿孔将各100 ng的dna片段和线
性pyes1l载体转化到含有合适的上游酶的工程酵母菌株中。根据制造商的说明从酵母细胞中回收组装的yac。
[0263]
对于染色体整合，使用lr克隆酶ii(life technologies)将感兴趣的基因重组到 pcs2643或pcs2644中，并采用合适的整合引物和expand high fidelity聚合酶 (roche)对完整的整合盒(基因表达盒和选择标记)进行pcr扩增，以添加具有同源性的约80个核苷酸。来自两个100μl反应的pcr产物用乙醇沉淀，并使用标准乙酸锂程序转化到酵母中。通过跨越所针对的基因座与表达盒的连接处进行pcr筛选来验证整合。整合选择标记的侧翼为loxp位点以便于选择标记拯救，并用pcs277 (psh63)转化菌株，该pcs277编码cre重组酶的表达(g
ü
ldener等人.a newefficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.nucleic acids res. 24,2519-24(1996))。菌株在ypd中生长36小时，每12小时进行100x反向稀释 (back-dilution)，然后涂布成单个菌落。通过将菌落在合适的选择性培养基上重新划线来验证选择标记和质粒的丢失。
[0264]
b.用共聚焦显微术对活细胞中的p450定位进行成像
[0265]
将酵母细胞培养物接种到3ml选择性培养基中，并使其生长8-12小时，至od 600 约为0.1。将1ml培养物以6000rpm离心30秒，弃去上清液，并将细胞重悬浮于 25-50μl培养基中。将1-3μl培养物加载到用合适的缺陷型(drop-out)培养基制成的2％琼脂糖垫上，以向细胞提供营养物，以便于活细胞成像。用配备有63.0x甘油浸物镜的leica sp5多光子/共聚焦显微镜对活酵母细胞进行成像。
[0266]
c.用于试验的生长条件
[0267]
过夜酵母培养物以3ml试管培养物在含有2％右旋糖(w/v)的缺陷型(drop-out) 培养基中开始，并在30℃、260rpm下生长，或在覆盖有aeraseal膜的深孔96孔板中的500μl培养物中生长，并在30℃、480rpm、80％湿度下在kuhner lab-thermlx-t 96孔板摇床中生长。
[0268]
将过夜培养物以75-100x反向稀释至补充有2-4mm全去甲劳丹碱的合适的缺陷型培养基中。更具体地，一些试验采用在覆盖有aeraseal膜的深孔96孔板中并在30℃、 480rpm、80％湿度下在kuhner lab-therm lx-t 96孔板摇床中生长的500μl培养物进行。其他试验使用在new brunswick scientific i24振荡培养箱中在25℃、260rpm 下在125ml带挡板烧瓶中生长的5ml培养物进行。除非另有说明，在反向稀释后 96小时对培养物进行采样。
[0269]
e.对代谢物产生的分析
[0270]
将酵母培养物的等分试样以6000rpm离心10分钟，并取生长培养基样品进行lc-ms/ms分析。在采用0.1％乙酸作为溶剂a以及含有0.1％乙酸的甲醇作为溶剂b 的agilent zorbax sb-aq 4.6x50 mm,5μm柱上运行样品。在0.5ml/min的恒定流速下使用以下用于分离感兴趣的代谢物的方法：0-1min，0％至27.5％b；1-2min， 27.5％b；2-8min，27.5％至60％b；8-8.5，35％至100％b；8.5-14min，100％b；随后以0％溶剂b进行6分钟的平衡。在通过hplc分离后，将代谢物注入agilent6320离子阱质谱仪进行检测和鉴定。
[0271]
代谢物的定量基于使用针对6300系列离子阱lc/ms(6300series ion trap lc/ms) 的dataanalysis版本3.4(bruker daltonik gmbh)计算的提取离子色谱峰的积分峰面积，并报告为平均值
±
s.d.。我们生成了牛心果碱、刺罂粟碱和小檗碱的标准曲线，并使用
最相似的标准化学结构来估计没有标准物可用的中间体的浓度。
[0272]
iii.产生原小檗碱的酵母菌株
[0273]
开发了酿酒酵母菌株，其由存在于培养基中或引入至细胞裂解物或裂解物级分中的由现有的工程菌株产生的(s)-金黄紫堇碱或其前体产生原小檗碱生物碱；包括(s)-四氢非洲防己碱、(s)-氢化小檗碱和小檗碱；作为中间体或终产物。更具体而言，这些菌株表达(s)-金黄紫堇碱9-o-甲基转移酶(s9omt)、(s)-氢化小檗碱合酶(cas)、(s)
‑ꢀ
四氢原小檗碱氧化酶(stox)的任何组合。
[0274]
由工程酵母菌株产生的原小檗碱生物碱的结构在上文中进行了描述，其中-r可以是
ꢀ‑
h、-ch3、-oh或-or。这些原小檗碱生物碱由存在于培养基中或引入至细胞裂解物或裂解物级分中的由现有的工程菌株产生的牛心果碱或其他相似的化学物质产生。这些菌株可以表达以下酶的任意组合：小檗碱桥酶(bbe)、金黄紫堇碱9'-o-甲基转移酶(s9omt)、氢化小檗碱合酶(cas)和s-四氢原小檗碱氧化酶(stox)。
[0275]
图5描绘了由工程酵母菌株支持的异源生物合成途径。基因stox与天然存在的基因金花小檗(s)-四氢原小檗碱氧化酶具有78％的核酸序列同一性(表2)。该基因是针对酵母表达进行了密码子优化的非天然核苷酸序列。
[0276]
图6描绘了附加型基因拷贝数对酵母培养物中原小檗碱产生的影响。关于酶的有利表达水平，bbe、cas和stox相对较低(例如，cen/ars载体或基因组表达)(图 6a)，而s9omt相对较高(例如，2μm载体或多个基因组拷贝)(图6b)。可以通过改变组成型启动子的强度、使用诱导型启动子、附加型地或基因组地改变每个基因的拷贝数(图6c)、改变选择标记和/或与启动子活性或选择对应的培养条件来改变表达水平。
[0277]
通过在酵母培养物中进行的试验来确定附加型基因拷贝数对原小檗碱产生的影响(图 6)。(a)对于cas，将4mm全去甲劳丹碱添加至产生四氢非洲防己碱的菌株的培养基中，该菌株具有从多拷贝2μm质粒或单拷贝cen/ars质粒表达的cas。对于 stox，将250μμ氢化小檗碱添加至从多拷贝2μm质粒或单拷贝cen/ars质粒表达的菌株的培养基中。(b)将4mm全去甲劳丹碱添加至表达所列质粒的产生金黄紫堇碱的菌株的培养基中。对于这两个实验，在72h生长后，通过离心沉淀酵母，并通过lc-ms分析培养基。采用耦合到配备有agilent zorbax sb-aq柱(3.0
×
50mm11.8微米)和agilent zorbax sb-aq保护柱(2.1
×
12.5mm 5微米)的agilent 1200系列hplc的agilent 6320离子阱(电喷雾毛细管电压-3.5kv；加热的毛细管温度 350℃；鞘气：氮气)获得正离子电喷雾电离(esi)质谱。lc分离方法为用h2o等度洗脱1min，经3min梯度洗脱至h2o：ch3oh，经1min梯度洗脱至100％ch3oh，并最终用0.6ml min-1
的流速等度洗脱4min。两种溶剂均为0.1％乙酸。绘制针对分子离子的产物提取离子色谱图的提取离子色谱图(extracted ion chromatogram)，并对其手工积分。误差条为三个生物复制品的s.d.。(c)拷贝数是与表达水平相关的秩级(rank-order)。如kushnirov等人(2000).yeast 16,857-860(其通过引用全文并入)所述，用具有指示的质粒的酵母菌株的过夜培养物来制备样品。sds-page后，将蛋白质转移至硝化纤维膜，该硝化纤维膜在5％的bsa中封闭1小时，随后用hrp 偶联的抗ha抗体探测过夜。在与增强化学发光hrp底物一起温育后对膜进行成像。研究了细胞色素p450-nadph还原酶配偶体对cas活性的影响(图6d)。细胞色素 p450还原酶atr1与cas的共表达导致比花菱草cpr、拟南芥atr2、罂粟cpr 或内源性酵母cpr更高的cas活性。在从多拷贝质粒表达cas的酵母中用4mm 全去甲劳丹碱在体内进
行试验。如本文所述获得正离子电喷雾电离(esi)质谱。绘制产物标准分子离子的提取离子色谱图，并对其手工积分。对数据进行归一化，使得不存在cpr时的峰面积＝1。
[0278]
观察到酵母培养物中stox的功能性表达。在从cen/ars质粒表达stox的酵母中采用250μμ氢化小檗碱(m/z＝340)在体内进行试验。如针对图6所述获得正离子电喷雾电离(esi)质谱。绘制小檗碱产物(m/z＝336)和1μm小檗碱标准分子离子的提取离子色谱图，并在用于6300系列离子阱(6300series lon trap)lc/ms的dataanalysis v.3.4中以默认平滑宽度使用1个循环的gauss处理工具使其平滑化。
[0279]
为了增强酵母细胞内bia的积累，在工程菌株中表达异源转运蛋白，例如来自产生 bia的植物的结合植物atp的盒蛋白。这些转运蛋白是cjabcb1、cjabcb2和/或 cjabcb2，并用于使酵母细胞内积累小檗碱。
[0280]
图7描绘了在体内由全去甲劳丹碱产生小檗碱。由宿主细胞的培养物证实了牛心果碱、金黄紫堇碱、四氢非洲防己碱、氢化小檗碱和小檗碱的产生，这些宿主细胞从 yac表达somt、cas、bbe和stox；在高拷贝2μm质粒上具有somt的第二拷贝；整合有atr1；以及整合有用于将全去甲劳丹碱转化为牛心果碱的三种酶。试验在酵母培养物中用4mm全去甲劳丹碱进行96h。如针对图6所述，通过lc-ms 在培养基中鉴定产物：牛心果碱m/z 330、金黄紫堇碱m/z 328、四氢非洲防己碱m/z342、氢化小檗碱m/z 340以及小檗碱m/z 336。m/z 336的ms/ms波谱证实产物5 是小檗碱，因为该波谱与小檗碱标准品的波谱匹配。
[0281]
iv.产生蒂巴因的酵母菌株
[0282]
将酵母菌株工程化为由存在于培养基中或引入到细胞裂解物或裂解物级分中的、由现有的工程菌株产生的沙罗泰里啶或其前体产生蒂巴因作为中间体或终产物。更具体地，这些菌株表达沙罗泰里啶还原酶(salr)和沙罗泰里啶醇7-o-乙酰转移酶(salat) 的任意组合。
[0283]
图8描绘了由工程酵母菌株支持的异源生物合成途径。
[0284]
图9描绘了在工程酵母的粗裂解物中沙罗泰里啶向蒂巴因的转化。通过监测离子计数 (eic)m/z＝312峰面积观察到salr和salat的功能性表达，其导致由沙罗泰里啶产生蒂巴因。含有大红罂粟salr的菌株比含有罂粟salr的菌株产生更多的蒂巴因。含有具有f104a或i275a突变的salr的菌株比含有没有这些突变的salr的菌株产生更多的蒂巴因。酶的组合也可以包括表2所列的任何密码子优化的salat变体。用 100μμ沙罗泰里啶和50μμnadph在从基因组表达salr和salat的酵母的粗裂解物中进行试验。如针对图6所述获得正离子电喷雾电离(esi)质谱。绘制产物标准分子离子的提取离子色谱图，并对其手工积分。
[0285]
salat基因与其天然存在的对应物(表3)具有小于或等于80％的核酸序列同一性。
[0286]
这些基因是针对酵母表达进行密码子优化的非天然核苷酸序列。
[0287]
由salr和salat催化的沙罗泰里啶向蒂巴因的转化在由辅因子nadph补充的表达这两种酶的酵母菌株的粗裂解物中发生(图9)。
[0288]
salat和salr也在表达附加酶的工程菌株中表达，以使得该菌株产生蒂巴因是其前体的产物。例如，该菌株可以产生东罂粟碱、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮和/或羟吗啡酮。
[0289]
由salr和salat催化的沙罗泰里啶向蒂巴因的转化发生在被修饰为产生增加量的 nadph的工程酵母菌株中(表2)。
[0290]
通过将salr和/或salat定位于酵母细胞中的细胞器，将酵母菌株工程化为提高由牛心果碱或其前体产生沙罗泰里啶醇或蒂巴因或蒂巴因是其前体的产物的产量。例如， salr和/或salat可定位于酵母内质网，以减小salr和/或salat与cyp2d6或salsyn 或工程化细胞色素p450酶(其催化牛心果碱向沙罗泰里啶的转化)之间的空间距离。
[0291]
v.产生阿片的酵母菌株
[0292]
a.实施例1
[0293]
1.简介
[0294]
以下部分描述了酵母的产生和表征，以支持阿片生物合成的最后步骤，从而得到可产生天然存在的阿片和半合成阿片样物质的菌株。本文所描述的结果突出强调在将植物生物合成途径转移至微生物宿主时天然调节策略的丧失可能会导致引导通量朝向不期望的副产物的新的途径分支。为了恢复和控制途径特异性，创建将酶引导至特定的天然细胞区室的通用细胞器路径选择工具盒。在新的空间工程化方法中使用该工具盒来主动地使植物途径酶离开酵母内膜，从而将吗啡产生相对于副产物neomorphine 的特异性从44％升高至96％。通过增加共底物2-酮戊二酸的供应以及滴定基因拷贝数以平衡途径通量，进一步优化异源吗啡生物合成。通过在异源途径内引入细菌酶，我们证明了一组有价值的半合成阿片的生物合成，包括高达51mg/l的氢可酮、70 mg/l羟考酮和1mg/l氢吗啡酮，它们通常由天然阿片的化学修饰而产生。优化的工程酵母菌株产生了31-132mg/l总阿片样物质产物，显示了微生物生物生产平台向制药企业提供天然和半合成阿片样物质的发展。
[0295]
2.结果
[0296]
a.构建酵母中的吗啡生物合成途径
[0297]
从蒂巴因到吗啡的生物合成由在罂粟中的以下三种酶催化：2-酮戊二酸/fe
2
依赖性双加氧酶t6odm和codm，以及nadph依赖性醛-酮还原酶cor。这些酶形成了两条从蒂巴因到吗啡的生物合成路径。一条路径(i)包括非酶促重排，并产生中间体尼奥品酮、可待因酮(1)、可待因(2)和吗啡(4)(图15)。基于所报道的t6odm 和codm的底物亲和性，这是罂粟中的主要途径。次要路径(ii)产生作为中间体的东罂粟碱和吗啡酮以产生吗啡(图15)。
[0298]
图15描绘了对酵母中的异源吗啡生物合成途径的工程化。该示意图描绘了所观察到的由来自鸦片罂粟的吗啡生物合成酶——蒂巴因6-o-脱甲基酶(t6odm)、可待因 o-脱甲基酶(codm)和可待因酮还原酶(cor)进行的蒂巴因的转化。两条通过中间体可待因酮和可待因(路径i)以及东罂粟碱和吗啡酮(路径ii)生成吗啡的路径在鸦片罂粟中发生。路径(i)和新鉴定的生成neomorphine的路径(iii)在酵母细胞的异源环境中发生，显示了cor和codm的较宽的底物范围。
[0299]
为了重构酿酒酵母中的吗啡生物合成途径，我们表达了酵母密码子优化的t6odm、 cor1.3和codm，每一个的侧翼为独特的酵母启动子和终止子，并组装成单个酵母人工染色体(yac)载体(pyes1 l)。从四个表征的罂粟cor同工型中选择cor1.3，因为它对可待因酮具有最高的亲和力。在用蒂巴因培养该菌株96h后，我们在培养基中观察到可待因酮、可待因和吗啡，表明这些异源植物酶能够催化酵母中阿片的转化(图15)。然而，所检测到的阿片水平较低，吗啡产量低至0.2mg/l，表明将需要优化努力来提高转化效率。在该试验中未检测到尼奥品酮，很可能是因为在整个实验过程中该中间体不稳定，并重排成可待因酮。
[0300]
在培养基中检测到的附加阿片指示了在自然和异源系统中观察到的生物合成途
径之间的差异。在植物中观察到的来自生成吗啡的次要途径的中间体——东罂粟碱和吗啡酮——在工程酵母菌株中未检测到，表明这些酶中的每一种对其替代底物的低活性妨碍了可检测水平。然而，观察到与可待因和吗啡类似的量的两种其他产物。第一产物具有与可待因相同的质量/电荷(m/z)比，并通过ms/ms分析被确定为尼奥品(3)。尼奥品可在尼奥品酮重排成可待因酮之前通过cor对t6odm的直接产物——尼奥品酮的活性而产生(图15)。第二未知产物具有与吗啡相同的m/z比，并被确定为 neomorphine(5)，其通过尼奥品的codm催化的去甲基化产生。因此，该分析揭示了工程酵母菌株中新的但不期望的阿片途径(iii)(图15)。
[0301]
b.增加共底物2-酮戊二酸的供应用于吗啡的生物合成
[0302]
考察关键的共底物——2-酮戊二酸的供应在异源吗啡生物合成途径中是否是限制性的。双加氧酶t6odm和codm需要2-酮戊二酸来分别在蒂巴因和可待因的氧化去甲基化中接受一个氧原子。因此，考察增加2-酮戊二酸的供应是否将提高通过我们的工程化生物合成途径的通量。
[0303]
在内源性酵母氮代谢中，谷氨酸脱氢酶(gdh)催化谷氨酸与2-酮戊二酸的相互转化(图16)。因此，增加谷氨酸供应可以增大细胞内的2-酮戊二酸池。将谷氨酸一钠 (msg)，即常用的氮源，滴定到酵母培养基中。谷氨酰胺包含在培养基中作为氮源以确保培养物不受到氮的限制，并因此阻止由msg补充而引起的正增长效应。采用不同水平的msg时未观察到最终细胞密度的差异。在将msg浓度从0增加至2.5g/l 时，在96h的生长后观察到吗啡产量从0.24mg/l增加至0.45mg/l(图16b)。
[0304]
接着考察将共底物2-酮戊二酸直接添加至培养基中是否将进一步提高通过途径的通量。将2-酮戊二酸滴定到培养基中至高达100mm的浓度。除了2.5g/l msg外还直接供应该共底物将吗啡的滴度增加至2.5mg/l，相对于在标准培养基中观察到的滴度增加了超过10倍(图16b)。所有后续产生阿片的培养物均在补充有0.5g/l谷氨酰胺、2.5g/l msg和50mm 2-酮戊二酸的这种优化的培养基中生长。
[0305]
图16描绘了增加的共底物2-酮戊二酸供应增大了吗啡生物合成滴度。(a)在酵母代谢中，2-酮戊二酸参与三羧酸(tca)循环以及氮同化，在氮同化中其通过谷氨酸脱氢酶gdh1p、gdh2p和gdh3p的活性可逆地转化为谷氨酸。(b)含有作为氮碱基的 0.5g/l谷氨酰胺的合成完全培养基补充有高达2.5g/l的谷氨酸一钠(msg)，并随后补充高达100mm的2-酮戊二酸。将从pyes1l载体表达t6odm、cor1.3和 codm的酵母菌株(csy907)在深孔板中用1mm蒂巴因在所指示的培养基组成下培养96h。通过对培养基的lc-ms分析来确定吗啡产量水平。误差条显示三个生物复制品的
±
1sd。
[0306]
c.平衡酶表达水平以增大吗啡滴度
[0307]
接着考察优化相对酶表达水平是否会增加通往吗啡的途径通量。酶cor催化吗啡生物合成中可待因酮向可待因的可逆还原。cor还催化酵母中尼奥品酮向尼奥品的可逆还原(图15)。这些可逆反应的存在表明可通过滴定途径酶的表达水平进一步提高朝向产生可待因并因此产生吗啡的途径通量。
[0308]
为了考察关于t6odm、cor和codm表达水平的组合设计空间，针对各种酶构建具有不同的基因拷贝数的菌株。在所有菌株中，从yac载体表达t6odm、cor和 codm的单一拷贝。将一个或多个基因的附加拷贝与组成型gpd启动子整合至宿主细胞基因组中的营养缺陷型
基因座处。将菌株在96孔板中用在优化培养基(0.5g/l 谷氨酰胺、2.5g/l msg和50mm 2-酮戊二酸)中的1mm蒂巴因培养96h。将吗啡和neomorphine滴度与仅具有yac载体的对照菌株(t6odm：cor：codm基因比为1：1：1)的相应滴度进行比较。
[0309]
改变途径基因的拷贝数改变了总阿片滴度以及吗啡和neomorphine的相对水平。增加单独cor的拷贝数(例如，1：3：1)或连同t6odm(例如，2：2：1)一起降低了吗啡的产量，同时提高了neomorphine的产量，使得总阿片产量相似，但终产物的比例不同(图17)。例如，对照1：1：1菌株产生了2.5mg/l吗啡和3.7mg/lneomorphine，共6.2mg/l的终产物阿片。相比之下，1：3：1菌株产生了2.0mg/l 吗啡和4.1mg/l neomorphine；吗啡与neomorphine的比例不同，但总的终产物滴度相似。在设计空间内的其他基因拷贝数组合导致了吗啡和总终产物滴度的增加。例如，增加的codm拷贝数导致吗啡和neomorphine两者的更高的生产水平(图17)。这种效应被t6odm的附加基因拷贝增强，使得t6odm：cor：codm的一个感兴趣的比例为2：1：3，其在培养基中产生5.2mg/l吗啡和4.8mg/l neomorphine，共 10.0mg/l终产物阿片(图17)。
[0310]
所观察到的吗啡滴度与基因拷贝数比之间的关系表明了工程菌株中的两种改善机制。第一，提供最终酶codm的附加基因拷贝，例如通过分别提高可待因和尼奥品向吗啡和neomorphine的转化率，并因此提高了可逆cor反应的正向速率，增加了产生的终产物的总量。第二，改善总终产物滴度的表达水平变化也改善了目标产物吗啡相对于副产物neomorphine的特异性。具体而言，在较低产率的1：3：1菌株中，吗啡占总终产物阿片的33％，而在较高产率的2：1：3菌株中吗啡占52％。对途径转化效率的分析表明，codm偏好可待因作为底物，并因此偏向于在高拷贝数下的吗啡产生途径。在平衡的拷贝数菌株的一些情况下，非目标neomorphine仍占终产物的几乎一半。
[0311]
d.开发并实现定位工具盒以改善途径特异性
[0312]
早期工程化研究表明，几乎一半的潜在吗啡产率被分流到不需要的副产物 neomorphine中(图18)，使得途径特异性成为重要的工程化挑战。考察了整个工程化途径中的转化效率，并确定从吗啡分支到非目标neomorphine的一个原因是由 t6odm和cor催化的反应之间的中间自发步骤。其中t6odm和cor在细胞中在空间上隔开的工程策略可为尼奥品酮向可待因酮的中间自发重排提供额外的时间 (图18)。具体而言，通过将cor分离至酵母细胞器，可以将该酶的获得限制到由细胞质t6odm产生的尼奥品酮，从而为尼奥品酮提供额外的时间重排成可待因酮并最终转化成吗啡。
[0313]
为了解决这一特异性挑战并更广泛地在酵母中实现空间工程化方法，开发了模块化细胞器路径选择工具盒。该工具盒由来源于内源性酵母蛋白质的6个经验证的定位标签组成。这些标签导致通向多个酵母细胞器：内质网(er)、线粒体(mt)、质膜(pm) 和液泡(v)(图21a、b)。基于来自尾锚定类别蛋白质内的三种蛋白质的跨膜域开发了er路径选择标签er1、液泡标签v1和质膜标签p1。这些31-35个氨基酸的标签足以引导靶蛋白的转录后定位，使得c末端插入到所分配的细胞器的内膜中，并使蛋白质延伸到细胞质中。为了接近内部细胞器环境，基于整合膜蛋白钙联接蛋白的 28个氨基酸的跨膜域设计被称为er2的第二er路径选择标签。分别从已建立的er 和线粒体标记物kar2-dsred-hdel和cox4-mcherry中取出用于定位在er内腔 (er3)和线粒体基质(mt1)内的游离蛋白质的两个附加序列。为了确认目标定位，将细胞器路径选择工具盒的每个成员与gfp融合并通过共聚焦显微术进行检查
(图18b)。
[0314]
将细胞器路径选择工具盒应用于吗啡途径中的cor酶，以确定途径酶的物理离域是否可以增加通往所需产物(吗啡)的通量并降低通往不期望的产物(neomorphine) 的通量。其中cor1.3未标记并因此定位于具有t6odm和codm的细胞质(cyt) 的对照菌株在96h的生长后以44％的特异性产生了2.5mg/l吗啡(图19)。当采用细胞器路径选择工具盒将每个定位标签与cor融合以主动地使该酶通向不同的细胞区室时，观察到针对吗啡的增加的特异性(所需产物的相对产生)和滴度(所需产物的绝对产生水平)。将cor定位于er(er1标签)和面向细胞质的液泡(vi标签) 导致具有约3.5mg/l的高吗啡滴度的菌株。相比之下，具有定位于er内腔的、er3 标记的cor的菌株具有针对吗啡的几乎100％的特异性，但滴度降低至低于1mg/l。用er2标签将cor定位于er内腔提供了提高的产率和特异性的平衡，以86％的特异性产生了3.1mg/l的吗啡滴度，并在随后的实验中继续进行。
[0315]
表5(以下)描绘了细胞器路径选择工具盒。使用模块化导向序列将酶定位于工程酵母菌株中的细胞器。使用在n-末端的gly6serthr(seq id no:8)或在c-末端的 progly6(seq id no:9)的中间7个氨基酸的连接体将针对定位而选择的酶与导向序列融合。
[0316]
表5
[0317]
缩写：er，内质网；mt，线粒体；pm，质膜；tm，跨膜域；v，液泡。
[0318]
未命名的标签不提供向预测区室的模块化的、稳定的定位
[0319]
[0320][0321]
表5续
[0322]
er1(seq id no:1)
[0323]
er2(seq id no:2)
[0324]
er3(seq id no:3)
[0325]
v1(seq id no:5)
[0326]
pm1(seq id no:6)
[0327]
mt1(seq id no:7)
[0328]
*f1s1(seq id no:10)
[0329]
*prc1(seq id no:11)
[0330]
e.引入微生物酶以实现半合成阿片样物质的生物合成
[0331]
在来自加工鸦片罂粟的工厂的废物中鉴定的细菌菌株恶臭假单胞菌m10进行阿片样物质的酶转化。来自该菌株的两种表征的酶——nadp

依赖性吗啡脱氢酶(mora)和nadh 依赖性吗啡酮还原酶(morb)——催化这些反应中的许多反应。使mora(一种醛-酮还原酶)以及morb(一种α/β-桶黄素蛋白氧化还原酶)在大肠杆菌中异源性表达以将吗啡转化成氢吗啡酮。
[0332]
考察mora和morb是否扩展产生吗啡的酵母菌株产生有价值的终产物氢可酮、羟考酮和氢吗啡酮的生物合成能力(图20)。在单个yac中，包含罂粟基因t6odm、cor和 codm，以及恶臭假单胞菌基因mora和morb。采用该yac转化并用1mm蒂巴因培养的酵母菌株在96h的生长后仅产生了痕量的氢可酮，且没有可检测的氢吗啡酮。从pyes1l载体表达罂粟和恶臭假单胞菌m10酶的不同组合的工程酵母菌株产生了不同水平的目标阿片样物质。
[0333]
[0334][0335]
开发了半合成阿片样物质氢可酮和氢吗啡酮的替代生物合成途径。首先通过在编码吗啡生产的yac中用mora代替cor来确定mora是否可以在吗啡生物合成途径中代替 cor将可待因酮还原成可待因。mora活性代替cor产生了2.4mg/l吗啡，且具有69％的选择性，大于任何未标记的cor同工型菌株的选择性。morb被包含在内以产生具有 t6odm、codm、mora和morb的四基因yac。具有这种yac的菌株产生了1.3mg/l 氢可酮和0.10mg/l氢吗啡酮。由于mora和morb对氢可酮和氢吗啡酮的活性，还检测到阿片样物质二氢可待因和二氢吗啡(图20和23)。观察到14-羟基可待因，可能是由于mora对14-羟基可待因酮的活性而产生(图23)。已观察到可待因酮羟基化为14
‑ꢀ
羟基可待因酮在体外自发发生。观察到痕量的另一14-羟基化产物，即羟考酮，可能是由于morb对14-羟基可待因酮的活性。基于这些结果，仅表达t6odm和morb的菌株被工程化为提高通往morb产物氢可酮和羟考酮的途径通量。这种双酶菌株产生了6.5mg/l 氢可酮和2.1mg/l羟考酮，从而确认14-羟基化作为该途径的一部分而发生(图20)。接着，考察了mora和morb突变体增加通往氢吗啡酮的通量的能力。具体而言，测试 mora cys81ser，其阻止由在酶表面上的cys81的吗啡酮引起的不可逆产物抑制。此外，测试相对于原始报道的序列(uniprotkb：q51990)具有glu160gly突变的替代morb 氨基酸序列(rcsb pdb:1gwj_a)。在工程化途径中单独地和组合地考察mora
c81s
和 morb
e160g
变体。表达t6odm、codm、mora和morb的对照菌株产生了1.3mg/l氢可酮和0.10mg/l氢吗啡酮。用mora
c81s
变体取代mora分别将氢可酮和氢吗啡酮的滴度降低至0.9mg/l和0.09mg/l。用morb
e160g
取代morb导致培养基中氢吗啡酮的水平增加。例如，表达t6odm、codm、mora和morb
e160g
的菌株产生了0.9mg/l氢可酮和0.14mg/l氢吗啡酮。减少的氢可酮滴度表明morb
e160g
变体对可待因酮具有降低的活性，从而将通量转向至氢吗啡酮。
[0336]
f.组合菌株工程化方法来产生天然和半合成的阿片样物质
[0337]
使用本文中描述的基因设计元素来构建三种生产菌株用于目标阿片样物质的生物合成。吗啡生产菌株(csy950)引入了t6odm的基因组整合拷贝、codm的两个整合拷贝以及编码cor1.3-er2、t6odm和codm的yac。该菌株采用定位于er的cor1.3 将途径通量导向至吗啡，并提高了总的途径通量，t6odm：cor1.3：codm的最佳比例为2：1：3。氢吗啡酮生产菌株(csy951)引入了t6odm的基因组整合拷贝、codm 的两个整合拷贝以及编码t6odm、codm、mora和morb
e160g
的yac。这种氢吗啡酮生产菌株采用morb
e160g
变体将通量导向至氢吗啡酮，并提高了总产量，且具有最佳基因拷贝数比例。氢可酮/羟考酮生产菌株(csy952)引入了t6odm的两个整合拷贝以及编码t6odm和morb的yac。这些生产菌株在并行的0.25l封闭分批发酵罐中生长。在整个发酵过程中监测十种关键的阿片样物质终产物——可待因、尼奥品、吗啡、 neomorphine、氢可酮、羟考酮、氢吗啡酮、二氢可待因、14-羟基可待因和二氢吗啡。 24h后在培养基中检测到目标阿片样物质，随着细胞密度增加目标阿片样物质的浓度增加，
并继续在稳定期积累。在发酵过程中，菌株csy950、csy951和csy952在培养基中分别积累了31、68和132mg/l目标阿片样物质分子。
[0338]
在最终时间点对整个菌株的总代谢物谱的分析揭示了途径通量的重要差异。其中cor 定位于er的菌株csy950产生了相对于可待因和吗啡较低的尼奥品和 neomorphine的滴度(相对于7.7和4.7mg/l为2.6和0.76mg/l)，表明空间工程化方法在实验室规模发酵中在朝向非目标副产物的限制性途径通量下仍然有效。然而，由该菌株得到的总吗啡产率较低。对全部bia谱的考察揭示，副产物14-羟基可待因是所产生的总阿片样物质分子的大组分(15mg/l)。在该菌株中可待因酮可形成14-羟基可待因酮，其随后被cor还原成14-羟基可待因。此外，可待因相比于吗啡的较高滴度表明影响codm活性的因素可形成通往吗啡的途径通量的瓶颈。
[0339]
对csy951发酵培养基的分析提供了从可待因到吗啡的途径通量中的瓶颈的更多证据。 codm的下游产物——吗啡、氢吗啡酮、二氢吗啡——相对于其他bia产物以低水平积累(分别为0.54、1.0和1.5mg/l)，表明codm的活性可能受到限制。这可能是由于以下原因而发生：由于codm分子的中间体极性促进了被动扩散至细胞外而导致codm 对其底物可待因的可及性受到限制，或者这可能归因于来自在培养基中充足的蒂巴因的结合位点竞争。csy951还积累了低水平的氢可酮和羟考酮(分别为1.6和0.55mg/l)，与这些副产物的morb
e160g
限制性生产和使途径通量通向氢吗啡酮一致。在该菌株中， mora活性增加了副产物尼奥品和neomorphine的积累(分别为21和4.4mg/l)，从而可能影响目标终产物氢吗啡酮的产率。数据表明，对氢吗啡酮生产菌株的进一步优化可以通过时空双重调节策略来实现。例如，实施用于将mora定位于er的空间工程化方法可以支持增加的吗啡产量并限制通往如针对er-cor1.3观察到的neomorphine分支的通量。一旦已经积累合适水平的吗啡则可进一步将mora表达暂时调节到“开启(switchon)”，并随后将该中间体转化为吗啡酮，并最终转化为氢吗啡酮。应用于morb的相似的时序调节策略可以限制副产物如氢可酮和羟考酮的合成。
[0340]
csy952菌株被工程化为产生氢可酮和羟考酮，并具有简单的途径结构。该菌株没有引入mora/cor或codm，并因此既没有损失通往neomorphine分支的通量也没有遭遇可待因与吗啡之间的瓶颈。csy952将蒂巴因转化为滴度分别为51和70mg/l的氢可酮和羟考酮。在整个发酵过程中，氢可酮的积累受限于其向二氢可待因的转化，最终滴度为11mg/l。氢可酮还原为二氢可待因可以归因于由morb引起的第二还原反应，或者可能是内源性酵母酶活性的结果。二氢可待因的ms/ms波谱与公开的质谱相匹配。 csy952证实通往目标化合物的高通量可以通过在酵母中具有高活性的异源酶的最小分支的途径来实现。
[0341]
3.讨论
[0342]
已证实酿酒酵母作为许多有价值的bia靶分子的生物合成平台，包括作为将蒂巴因转化为包括可待因、吗啡、氢可酮、羟考酮和氢吗啡酮在内的阿片样物质的生产宿主。该工具和方法通过调节异源途径酶的定位以及将途径通量转向至目标终产物而支持酵母中的 bia生物合成。还应用基因拷贝数优化和共底物供应增强来提高酵母阿片生物合成。例如，在实验室规模的分批发酵中，三个示例性的工程菌株产生了7.7mg/l可待因和4.7 mg/l吗啡(csy950)、1mg/l氢吗啡酮(csy951)和51mg/l氢可酮、11mg/l二氢可待因和70mg/l羟考酮(csy952)。
[0343]
在鸦片罂粟中，蒂巴因经由两个生物合成路径转化为吗啡。最初的分歧发生在t6odm 或codm在不同的位置将蒂巴因去甲基化时。由于两种生物合成路径均在鸦片罂粟中产生吗啡，因此这种分歧不太可能影响在植物(planta)中的产率。然而，本工程酵母菌株显示了由于cor和codm分别对尼奥品酮和尼奥品的活性而引起的另外的分支，导致neomorphine的产生以及吗啡产量的降低。
[0344]
由于缺乏天然调节机制和改变的细胞因素如蛋白质加工、定位和微环境，因此植物酶在酵母中与在天然植物宿主中表达时可能起到不同的作用。在本工程酵母菌株中，没有观察到中间体东罂粟碱或吗啡酮的产生。在水溶液中，尼奥品酮迅速重排成可待因酮，但该分子可通过酵母细胞中的条件来稳定。因此体外条件有利于可待因产生，但酵母的体内条件可能会减缓尼奥品酮重排，从而使cor作用于该中间体以产生尼奥品。
[0345]
t6odm和codm表现出宽的底物特异性，从而催化非吗啡喃生物碱底物如金黄紫堇碱和别隐品碱的o-去甲基化。这些酶还催化破坏不同的bia(包括别隐品碱、隐品碱和前托品)中的亚甲二氧基桥的o-去亚甲基化反应。bia酶混杂性的其他实例包括o-和n
‑ꢀ
甲基转移酶，其对许多bia底物进行甲基化。在异源微生物宿主中，缺乏天然的时空调节机制可能进一步扩大bia生物合成酶可用的底物的范围，从而导致新观察到的途径分支和代谢物。此外，在单一宿主细胞中组合来自不同物种的酶进一步增加了任何给定酶可用的天然和非天然底物的数目以及多种bia分子的产量。可以实现重建靶向微生物 bia生物合成途径，以管理通过高度分支的途径的通量，以实现单个目标终产物的最佳产率。
[0346]
为促进酵母中生物合成途径的空间工程化，创建支持使酶通向选定细胞器和内膜位置的细胞器路径选择工具盒。应用这些空间工程化工具来将通量转向至目标产物吗啡，从而限制不期望的副产物的产生。尼奥品酮向可待因酮的自发转化是我们的途径中的关键分支点，其中cor对尼奥品酮的活性将通量导向至neomorphine，而其对可待因酮的活性将通量导向至吗啡。cor与t6odm的分离可以为自发反应的发生提供额外的时间并将通量转向至吗啡分支。结果表明，主动地使cor通向不同细胞器有可能通过途径酶的离域和cor活性的降低的组合效应以进一步平衡途径通量，来提高对于吗啡的途径特异性以及总吗啡滴度。
[0347]
结果显示了在酵母中的阿片生物合成中将蒂巴因转化为可待因和吗啡的最终步骤的构建以及该途径用于产生半合成药物(例如，氢可酮、羟考酮和氢吗啡酮)的延伸。通过与上游bia牛心果碱的总微生物生物合成相结合，本发明的方法和宿主细胞可用于或适合于对能够由简单的糖源产生目标阿片的酵母菌株进行工程化。此类菌株可以包含三种已知酶(包括一种将(r)-牛心果碱催化成沙罗泰里啶的细胞色素p450)的功能性表达。
[0348]
4.方法
[0349]
a.质粒和酵母菌株构建
[0350]
使用现代分子生物学技术来构建质粒和菌株。由其构建实施例中描述的菌株的亲本酿酒酵母菌株是单倍体w303α(matαleu2-3,112trp 1-1can1-100 ura3-1 ade2-1his3-11,15)。具有2％右旋糖的酵母合成完全(sc)氨基酸缺陷型培养基以及含有200 mg/l g418硫酸盐的复合酵母蛋白胨葡萄糖(yeast peptone dextrose，ypd)培养基用于菌株构建。化学感受态大肠杆菌菌株top10用于克隆目的，并且在具有指示的抗生素浓度的lb培养基中生长。使用标准方法合成定制的寡核苷酸。从genbank下载所有的异源基因序列，使用
geneart geneoptimizer程序针对在酿酒酵母中的表达进行密码子优化，并使用标准方法进行合成。从w303α基因组dna扩增所有的酵母内源性启动子、终止子和细胞器导向序列(表s3)。用于pcr的聚合酶是针对小于2kb的产物的pfuhotstart以及针对大于2kb的产物的expand high fidelity pcr system。使用qiaprep 柱和econospin柱由大肠杆菌制备质粒。使用标准方法进行测序。
[0351]
表s3显示了yac表达盒。独特的启动子和终止子与每个基因配对，以构建用于引入至 yes1载体中的表达盒。
[0352][0353][0354]
为了从w303α中的罂粟和恶臭假单胞菌表达异源基因，构建单独的表达盒，该表达盒包含侧翼为独特的启动子和终止子(表s3)并引入至pyes1l载体中的开放阅读框。在表达盒的初始构建中，通过重叠延伸剪接法(splicing by overlap extension， soeing)将单独的基因与启动子和终止子合并，并重组成用于序列验证和存储的 gateway载体pdonr221(bp克隆酶ii)。然后使用通过geneart high-order geneticassembly在线工具设计的寡核苷酸对表达盒进行pcr扩增，这添加了用于酵母中缺口修复的同源区。将100ng的各表达盒pcr与100ng线性化的pyes1l合并，并通过电穿孔转化到w303α中。pyes1l载体包含用于在色氨酸缺陷型培养基上选择的trp1以及ars4/cen5区，以使得每个新构建的载体在酵母中保持为单拷贝附加型质粒。通过pcr筛选和测序来验证pyes1l构建体。为了使该质粒繁殖以使得其可以转化到其他酵母背景的菌株中，将pyes1l载体从酵母中分离，并转化至top10 大肠杆菌中，在top10大肠杆菌中，其保持为单拷贝，并在具有50mg/l的二盐酸壮观霉素五水合物的lb培养基上进行选择。由100ml过夜大肠杆菌培养物制备足以转化多达10个酵母菌株的约2μg质粒。
[0355]
为了将附加基因拷贝整合到酵母基因组中，由pug载体的pcr扩增产生包含侧翼为启动子和终止子的基因的表达盒，该pug载体被修饰为能够实现gateway克隆(lifetechnologies)。对分别包含kanmx和乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)leu2 选择标记的载体pug6和pug73进行修饰以使之包含位于gateway盒 attr1-ccdb/cam
r-attr2侧
6320ion trap mass spectrometer)上进行鉴定。将针对每种感兴趣的代谢物的提取离子色谱图与掺入废酵母培养基中的市售标准进行比较。在ms/ms中鉴定样品和标准品的靶分子的片段离子，并将其与公开的波谱进行比较，以确认每种阿片的身份。为进行定量，对提取离子色谱图的峰面积进行积分并与每种分子的标准品曲线进行比较。该标准品是蒂巴因、硫酸可待因、硫酸吗啡五水合物、重酒石酸氢可酮、盐酸羟考酮、盐酸氢吗啡酮。
[0362]
为了分析生物反应器培养基，将样品稀释2倍与10倍之间，并在zorbax sb-aq柱 (3.0
×
250mm，5μμ粒径)上进行分离。将柱用水、0.1％乙酸和0.1％甲醇(溶剂 a)平衡，并将样品用甲醇和0.1％乙酸(溶剂b)的流动相以下列顺序进行洗脱：100％ a 0-10min，0-90％b 10-30min，随后进行用100％b清洗柱子然后在a中重新平衡的步骤。使流速保持恒定为0.8ml/min。
[0363]
d.共聚焦显微术
[0364]
使携带适当的质粒的酵母细胞在sc缺陷型培养基中生长过夜，然后将1.5ml离心，并以高细胞密度重悬浮(于《100μl培养基中)。通过以下方法制备载玻片：将与酵母培养基组合的2％低熔点琼脂糖垫放置在显微镜载玻片上，将1μl的酵母细胞点印在琼脂糖垫上，用1号盖玻片覆盖，并密封。使细胞在具有63.0x甘油浸物镜、1.30x 数值孔径以及高达8倍数字变焦的leica tcs sp5共聚焦显微镜上成像。根据样品的荧光强度将混合型检测器(hyd)智能增益从30％调节为200％。作为荧光设置的实例，对于gfp的单色成像，用激光线488nm激发样品，并且通过在500-550nm范围内的hyd通道(二向色镜＝dd 488/594)来记录发射的荧光。采用airy1针孔大小 (108.4μm)、至少2
×
线平均、30-100nm的像素大小和0.856μm的光学截面厚度来记录图像。
[0365]
本发明的实施方案
[0366]
实施方案1.一种产生牛心果碱的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自6omt、cnmt 和4’oμτ的一种或多种甲基转移酶的一种或多种异源编码序列的多个拷贝，其中所述一种或多种甲基转移酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0367]
实施方案2.根据实施方案1所述的宿主细胞，其中所述来源生物是罂粟、黄唐松草或日本黄连。
[0368]
实施方案3.根据实施方案1所述的宿主细胞，其中所述一种或多种甲基转移酶的多个拷贝来源于两种或更多种与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0369]
实施方案4.根据实施方案1所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含cnmt的异源编码序列的多个拷贝。
[0370]
实施方案5.根据实施方案4所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含cnmt的异源编码序列的两个拷贝。
[0371]
实施方案6.根据实施方案1所述的宿主细胞，其中相对于缺乏所述一种或多种甲基转移酶的一种或多种异源编码序列的多个拷贝的对照宿主细胞，该宿主细胞能够由去甲基乌药碱产生增加的量的牛心果碱。
[0372]
实施方案7.根据实施方案6所述的宿主细胞，其中牛心果碱的所述增加的量为相对于对照宿主细胞10％或更多。
[0373]
实施方案8.根据实施方案6所述的宿主细胞，其中该宿主细胞能够由去甲基乌药碱产生牛心果碱。
[0374]
实施方案9.根据实施方案1所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自6omt、 cnmt和4’omt的两种或更多种甲基转移酶的两种或更多种异源编码序列。
[0375]
实施方案10.根据实施方案9所述的宿主细胞，其中所述两种或更多种甲基转移酶来源于两种或更多种与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0376]
实施方案11.根据实施方案9所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含全部甲基转移酶 6omt、cnmt和4’omt的异源编码序列。
[0377]
实施方案12.根据实施方案1所述的宿主细胞，其中该宿主细胞能够经由图2的生物合成途径由全去甲劳丹碱产生牛心果碱。
[0378]
实施方案13.根据实施方案1所述的宿主细胞，其中该宿主细胞能够经由图3的生物合成途径由去甲基乌药碱产生牛心果碱。
[0379]
实施方案14.根据实施方案1所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母菌株。
[0380]
实施方案15.根据实施方案14所述的宿主细胞，其中所述酵母菌株是酿酒酵母。
[0381]
实施方案16.一种产生血根碱或血根碱前体的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自 bbe、cfs、cpr、sts、tnmt、msh、p6h和dbox的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0382]
实施方案17.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中所述血根碱前体是原小檗碱或苯菲啶生物碱。
[0383]
实施方案18.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中所述血根碱前体选自碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、顺式-n-甲基刺罂粟碱、金黄紫堇碱、前托品和二氢血根碱。
[0384]
实施方案19.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中所述来源生物是罂粟、花菱草、拟南芥、大红罂粟或蓟罂粟。
[0385]
实施方案20.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶是来源于两种或更多种与该宿主细胞相比不同的来源生物的两种或更多种酶。
[0386]
实施方案21.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含所述一种或多种异源编码序列的多个拷贝。
[0387]
实施方案22.根据实施方案21所述的宿主细胞，其中所述一种或多种异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0388]
实施方案23.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自bbe、cfs、cpr、sts、tnmt、msh、p6h和dbox的两种或更多种酶的两种或更多种异源编码序列。
[0389]
实施方案24.根据实施方案23所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自bbe、cfs、 cpr、sts、tnmt、msh、p6h和dbox的三种或更多种酶的三种或更多种异源编码序列。
[0390]
实施方案25.根据实施方案23所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自bbe、cfs、 cpr、sts、tnmt、msh、p6h和dbox的四种或更多种酶的四种或更多种异源编码序列。
[0391]
实施方案26.根据实施方案25所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自bbe、cfs、 cpr、sts、tnmt、msh、p6h和dbox的五种或更多种酶的五种或更多种异源编码序列。
[0392]
实施方案27.根据实施方案26所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含酶bbe、cfs、 cpr、sts、tnmt、msh、p6h和dbox中每一种的异源编码序列。
[0393]
实施方案28.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中宿主细胞进一步包含与天然宿主细胞相比的一个或多个基因缺失，其中所述一个或多个缺失的基因选自ire1、 hac1、
opi1、ino1、ino2、ino3、pdr1、stb5、pdr3、pdr5、snq2、yor1、 tpo1、tpo2、tpo3、tpo4、pdr10、pdr11、pdr15、pdr16、pdr17、qdr1、qdr2、qdr3、flr1、aqr1、aqr2和cin5。
[0394]
实施方案29.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母菌株。
[0395]
实施方案30.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞能够经由图4的生物合成途径由全去甲劳丹碱产生血根碱或血根碱前体。
[0396]
实施方案31.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞能够经由图11的生物合成途径由全去甲劳丹碱产生血根碱或血根碱前体。
[0397]
实施方案32.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含bbe酶的异源编码序列。
[0398]
实施方案33.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中bbe酶的异源编码序列整合到宿主细胞染色体内。
[0399]
实施方案34.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中所述血根碱前体是碎叶紫堇碱。
[0400]
实施方案35.根据实施方案34所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含cfs和cpr 酶的异源编码序列。
[0401]
实施方案36.根据实施方案35所述的宿主细胞，其中所述cpr酶是atr1。
[0402]
实施方案37.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中所述血根碱前体是金黄紫堇碱。
[0403]
实施方案38.根据实施方案37所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含sts酶的异源编码序列。
[0404]
实施方案39.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中所述血根碱前体是前托品。
[0405]
实施方案40.根据实施方案39所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含tnmt和msh 酶的异源编码序列。
[0406]
实施方案41.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含细胞色素b5 酶的异源或内源编码序列。
[0407]
实施方案42.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含参与跨细胞膜转运化合物的一种或多种蛋白质的一种或多种异源或内源编码序列。
[0408]
实施方案43.根据实施方案42所述的宿主细胞，其中所述蛋白质选自pdr1、pdr5、 snq2、yor1、pdr3、cin5和pdr3。
[0409]
实施方案44.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是根据实施方案1 至15中的一个所述的宿主细胞。
[0410]
实施方案45.根据实施方案16所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含选自6omt、cnmt和4’omt的一种或多种甲基转移酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种甲基转移酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0411]
实施方案46.一种产生原小檗碱生物碱的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自bbe、 s9omt、cas和stox的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0412]
实施方案47.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中所述原小檗碱生物碱由下列结构之一表示：
[0413][0414]
其中r
1-r
14
各自独立地选自h、烷基、羟基或烷氧基。
[0415]
实施方案48.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中所述来源生物是罂粟、花菱草、日本黄连、黄唐松草、匍枝小檗、黄唐松草灰叶亚种、黄连、唐松草属的种、黄连属的种、罂粟属的种、金花小檗、蓟罂粟或小檗属的种。
[0416]
实施方案49.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含所述一种或多种异源编码序列的多个拷贝。
[0417]
实施方案50.根据实施方案49所述的宿主细胞，其中所述一种或多种异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0418]
实施方案51.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自bbe、 s9omt、cas和stox的两种或更多种酶的两种或更多种异源编码序列。
[0419]
实施方案52.根据实施方案51所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自bbe、 s9omt、cas和stox的三种或更多种酶的三种或更多种异源编码序列。
[0420]
实施方案53.根据实施方案52所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含酶bbe、 s9omt、cas和stox中的每一种的异源编码序列。
[0421]
实施方案54.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中宿主细胞包含cas和cpr酶的异源编码序列。
[0422]
实施方案55.根据实施方案54所述的宿主细胞，其中所述cpr酶是atr1。
[0423]
实施方案56.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中宿主细胞包含stox的异源编码序列。
[0424]
实施方案57.根据实施方案56所述的宿主细胞，其中该宿主细胞能够由全去甲劳丹碱产生(s)-氢化小檗碱。
[0425]
实施方案58.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中宿主细胞进一步包含选自 cjabcb1、cjabcb2和cjabcb2的一种或多种异源转运蛋白的一种或多种异源编码序列。
[0426]
实施方案59.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母菌株。
[0427]
实施方案60.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中该宿主细胞能够经由图5的生物合成途径由牛心果碱产生小檗碱。
[0428]
实施方案61.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是根据实施方案1 至15中的一个所述的宿主细胞。
[0429]
实施方案62.根据实施方案46所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含选自 6omt、cnmt和4’oμτ的一种或多种甲基转移酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种甲基转移酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0430]
实施方案63.一种产生蒂巴因的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自salsyn、 cyp2d6、cyp2d2、salr和salat的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0431]
实施方案64.根据实施方案63所述的宿主细胞，其中所述来源生物是罂粟、大红罂粟、东方罂粟(papaver orientale)、罂粟属的种、智人(homo sapiens)或鼠属的种。
[0432]
实施方案65.根据实施方案63所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含所述一种或多种异源编码序列的多个拷贝。
[0433]
实施方案66.根据实施方案65所述的宿主细胞，其中所述一种或多种异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0434]
实施方案67.根据实施方案63所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含酶salr和 salat中的每一种的异源编码序列以及选自salsyn、cyp2d2和cyp2d6的一种或多种酶的异源编码序列。
[0435]
实施方案68.根据实施方案67所述的宿主细胞，其中宿主细胞包含具有f104a或 i275a突变的大红罂粟salr的异源编码序列。
[0436]
实施方案69.根据实施方案63所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含能够由蒂巴因产生选自东罂粟碱、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮和羟吗啡酮的一种或多种阿片化合物的酶。
[0437]
实施方案70.根据实施方案69所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含t6odm 和morb-e160g的异源编码序列，并且其中所述一种或多种阿片化合物是氢可酮。
[0438]
实施方案71.根据实施方案63所述的宿主细胞，其中宿主细胞是被修饰为与天然酵母菌株相比产生增加量的nadph的工程酵母菌株。
[0439]
实施方案72.根据实施方案63所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母菌株。
[0440]
实施方案73.根据实施方案72所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含定位于酵母细胞中的细胞器的salr和salat酶。
[0441]
实施方案74.根据实施方案63所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是根据实施方案1 至15中的一个所述的宿主细胞。
[0442]
实施方案75.根据实施方案63所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含选自 6omt、cnmt和4’omt的一种或多种甲基转移酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种甲基转移酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0443]
实施方案76.一种产生阿片化合物的宿主细胞，其中该宿主细胞包含：选自t6odm、 cor和codm的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物；以及选自恶臭假单胞菌mora和恶臭假单胞菌morb的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列。
[0444]
实施方案77.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含四种或更多种异源编码序列。
[0445]
实施方案78.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中所述来源生物选自罂粟、罂粟属的种和恶臭假单胞菌。
[0446]
实施方案79.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含一种或多种异源编码序列的多个拷贝。
[0447]
实施方案80.根据实施方案79所述的宿主细胞，其中所述异源编码序列的多个拷贝来源于两种或更多种与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0448]
实施方案81.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含t6odm、cor、 codm和morb的异源编码序列。
[0449]
实施方案82.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含酶t6odm、 cor和codm的异源编码序列。
[0450]
实施方案83.根据实施方案82所述的宿主细胞，其中所述酶t6odm、cor和codm 的异源编码序列以2：1：3的比例存在。
[0451]
实施方案84.根据实施方案82所述的宿主细胞，其中所述酶t6odm、cor和codm 的异源编码序列以1：1：3或2：1：2的比例存在。
[0452]
实施方案85.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中所述阿片化合物选自可待因、吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、羟考酮、二氢可待因、14-羟基可待因和二氢吗啡。
[0453]
实施方案86.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞能够经由图15的生物合成途径由蒂巴因产生阿片化合物。
[0454]
实施方案87.根据实施方案86所述的宿主细胞，其中该宿主细胞由蒂巴因产生很少或不产生东罂粟碱或吗啡酮。
[0455]
实施方案88.根据实施方案86所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生尼奥品和 neomorphine中的一种或多种。
[0456]
实施方案89.根据实施方案88所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生产率为总阿片的30％或更高的阿片化合物。
[0457]
实施方案90.根据实施方案89所述的宿主细胞，其中该宿主细胞产生产率为总阿片的50％或更高的阿片化合物。
[0458]
实施方案91.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是酵母菌株。
[0459]
实施方案92.根据实施方案91所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是与对照酵母菌株相比能够产生增加量的2-酮戊二酸的工程酵母菌株。
[0460]
实施方案93.根据实施方案92所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含选自gln1、 glt1、gdh1、gdh2、gdh3、odc1、odc2、kgd1、kgd2和lpd1的一种或多种蛋白质的一种或多种内源或异源编码序列。
[0461]
实施方案94.根据实施方案93所述的宿主细胞，其中该宿主细胞在选自gln1、 glt1、gdh1、gdh2、gdh3、odc1、odc2、kgd1、kgd2和lpd1的一种或多种蛋白质的一种或多种内源编码序列中包含缺失。
[0462]
实施方案95.根据实施方案91所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含与对照酵母菌株相比增加的量的2-酮戊二酸，其中所述增加的量的2-酮戊二酸通过直接添加至该宿主细胞的培养基中而引入。
[0463]
实施方案96.根据实施方案91所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含与对照酵母菌株相比增加的量的谷氨酰胺、2-酮戊二酸和谷氨酸。
[0464]
实施方案97.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中所述酶中的一种或多种包含定位标签。
[0465]
实施方案98.根据实施方案91所述的宿主细胞，其中所述酶中的一种或多种在空
间上定位于酵母细胞中的区室，其中该区室选自线粒体、内质网(er)、高尔基体、液泡、细胞核、质膜和周质。
[0466]
实施方案99.根据实施方案98所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶在空间上定位于酵母细胞中的区室的外部。
[0467]
实施方案100.根据实施方案98所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶在空间上定位于酵母细胞中的区室的内部。
[0468]
实施方案101.根据实施方案91所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶是cor。
[0469]
实施方案102.根据实施方案91所述的宿主细胞，其中所述一种或多种酶是t6odm。
[0470]
实施方案103.根据实施方案91所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含在细胞中在空间上彼此隔开的cor和t6odm酶。
[0471]
实施方案104.根据实施方案101所述的宿主细胞，其中所述cor酶定位于酵母细胞中的内质网。
[0472]
实施方案105.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含morb和 t6odm的异源编码序列，并且其中所述阿片化合物是氢可酮和羟考酮。
[0473]
实施方案106.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含含有e160g 突变的酶morb。
[0474]
实施方案107.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含mora、morb、 codm和t6odm的异源编码序列，并且其中所述阿片化合物选自氢可酮、羟考酮和氢吗啡酮。
[0475]
实施方案108.根据实施方案107所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含含有e160g 突变的酶morb。
[0476]
实施方案109.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞包含两个或更多个基因盒，其中每个盒包含启动子、基因和终止子，并且其中所述基因盒以背靠背启动子设计成对布置。
[0477]
实施方案110.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中宿主细胞进一步包含与天然宿主细胞相比的一个或多个基因缺失，其中所述一个或多个缺失的基因选自pdr1、stb5、pdr3、pdr5、snq2、yor1、tpo1、tpo2、tpo3、tpo4、pdr10、pdr11、pdr15、pdr16、pdr17、qdr1、qdr2、qdr3、flr1、aqr1、aqr2和cin5。
[0478]
实施方案111.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞是根据实施方案1 至15和62至75中的一个所述的宿主细胞。
[0479]
实施方案112.根据实施方案76所述的宿主细胞，其中该宿主细胞进一步包含选自 6omt、cnmt和4’oμτ的一种或多种甲基转移酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种甲基转移酶来源于与该宿主细胞相比不同的来源生物。
[0480]
实施方案113.一种制备苄基异喹啉生物碱(bia)的方法，其包括：
[0481]
在适于蛋白质产生的条件下培养宿主细胞，其中该宿主细胞选自产生牛心果碱的宿主细胞、产生血根碱或血根碱前体的宿主细胞、产生原小檗碱的宿主细胞、产生蒂巴因的宿主细胞和产生阿片的宿主细胞；
[0482]
向细胞培养物中添加起始化合物；以及
[0483]
从细胞培养物中回收bia。
[0484]
实施方案114.根据实施方案113所述的方法，其中：所述宿主细胞是根据实施方案
1 所述的细胞；所述起始化合物选自全去甲劳丹碱和去甲基乌药碱；并且所述bia是牛心果碱。
[0485]
实施方案115.根据实施方案113所述的方法，其中：所述宿主细胞是根据实施方案 16所述的细胞；所述起始化合物是牛心果碱、全去甲劳丹碱或去甲基乌药碱；并且所述bia是血根碱或血根碱前体。
[0486]
实施方案116.根据实施方案115所述的方法，其中所述血根碱前体选自碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、顺式-n-甲基刺罂粟碱、金黄紫堇碱、前托品和二氢血根碱。
[0487]
实施方案117.根据实施方案115所述的方法，其中所述宿主细胞的培养在降低的温度下并在高通气容器中进行。
[0488]
实施方案118.根据实施方案113所述的方法，其中：所述宿主细胞是根据实施方案 46所述的细胞；所述起始化合物是牛心果碱、全去甲劳丹碱或去甲基乌药碱；并且所述bia是原小檗碱生物碱。
[0489]
实施方案119.根据实施方案118所述的方法，其中所述bia是(s)-氢化小檗碱，并且所述起始化合物是全去甲劳丹碱。
[0490]
实施方案120.根据实施方案118所述的方法，其中所述bia是小檗碱，并且所述起始化合物是牛心果碱。
[0491]
实施方案121.根据实施方案118所述的方法，其中所述原小檗碱生物碱由下列结构之一表示：
[0492][0493]
其中r
1-r
14
各自独立地选自h、烷基、羟基或烷氧基。
[0494]
实施方案122.根据实施方案113所述的方法，其中：所述宿主细胞是根据实施方案63所述的细胞；所述起始化合物是牛心果碱、全去甲劳丹碱或去甲基乌药碱；并且所述bia是蒂巴因。
[0495]
实施方案123.根据实施方案122所述的方法，其进一步包括由蒂巴因产生选自东罂粟碱、吗啡、可待因、氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮和羟吗啡酮的一种或多种阿片化合物。
[0496]
实施方案124.根据实施方案113所述的方法，其中：所述宿主细胞是根据实施方案 76所述的细胞；所述起始化合物是牛心果碱、全去甲劳丹碱、去甲基乌药碱或蒂巴因；并且所述bia是阿片化合物。
[0497]
实施方案125.根据实施方案124所述的方法，其中所述阿片化合物选自可待因、吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、羟考酮、二氢可待因、14-羟基可待因和二氢吗啡。
[0498]
实施方案126.根据实施方案124所述的方法，其中所述宿主细胞不产生或几乎不产生东罂粟碱或吗啡酮。
[0499]
实施方案127.根据实施方案124所述的方法，其中所述宿主细胞在包含谷氨酰胺、 2-酮戊二酸和谷氨酸中的一种或多种的培养基中培养。
[0500]
实施方案128.根据实施方案124所述的方法，其中所述宿主细胞在包含约2％或更少的二甲基亚砜(dmso)的培养基中培养，以增强与培养基的代谢物交换。
[0501]
实施方案129.根据实施方案124所述的方法，其中相对于在不包含谷氨酰胺、2-酮戊二酸和谷氨酸中的一种或多种的对照培养基中培养的宿主细胞，回收的bia的量提高。
[0502]
实施方案130.根据实施方案113所述的方法，其中所述宿主细胞是根据实施方案75 所述的细胞；所述起始化合物选自可待因和吗啡；并且所述bia是选自氢吗啡酮、氢可酮、羟考酮、二氢可待因、14-羟基可待因和二氢吗啡的阿片样物质。
[0503]
实施方案131.一种产生bia化合物或其前体的宿主细胞，其中：
[0504]
所述宿主细胞包含一种或多种异源编码序列的多个拷贝，所述异源编码序列编码来源于与所述宿主细胞相比不同的来源生物的一种或多种酶。
[0505]
实施方案132.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含来源于两种或更多种与所述宿主细胞相比不同的来源生物的两种或更多种酶。
[0506]
实施方案133.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞能够经由图2、 3、4、11和15之一的生物合成途径由起始物质产生bia化合物或其前体，其中所述起始物质选自全去甲劳丹碱、去甲基乌药碱、牛心果碱和蒂巴因。
[0507]
实施方案134.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是酵母菌株。
[0508]
实施方案135.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含参与跨细胞膜转运化合物的一种或多种蛋白质的一种或多种异源或内源编码序列。
[0509]
实施方案136.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述酶中的一种或多种包含定位标签，并在空间上定位于酵母细胞中的区室，其中所述区室选自线粒体、内质网 (er)、高尔基体、液泡、细胞核、质膜和周质。
[0510]
实施方案137.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述bia化合物或其前体是牛心果碱，并且所述宿主细胞包含选自6omt、cnmt和4’oμτ的一种或多种甲基转移酶的一种或多种异源编码序列。
[0511]
实施方案138.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述bia化合物或其前体是血根碱或血根碱前体，并且所述宿主细胞包含选自bbe、cfs、cpr、sts、tnmt、 msh、p6h和dbox的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述血根碱前体选自碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、顺式-n-甲基刺罂粟碱、金黄紫堇碱、前托品和二氢血根碱。
[0512]
实施方案139.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述bia化合物或其前体是原小檗碱生物碱，并且所述宿主细胞包含选自bbe、s9omt、cas和stox的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述原小檗碱生物碱由下列结构之一表示：
[0513][0514]
其中r1-r14各自独立地选自h、烷基、羟基或烷氧基。
[0515]
实施方案140.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述bia化合物或其前体是蒂巴因，并且所述宿主细胞包含选自salsyn、cyp2d6、cyp2d2、salr和salat的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列。
[0516]
实施方案141.根据实施方案131所述的宿主细胞，其中所述bia化合物或其前体是阿片化合物，并且所述宿主细胞包含：
[0517]
选自t6odm、cor和codm的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与所述宿主细胞相比不同的来源生物；以及
[0518]
选自恶臭假单胞菌mora和恶臭假单胞菌morb的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列；
[0519]
其中所述阿片化合物选自可待因、吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、羟考酮、二氢可待因、 14-羟基可待因和二氢吗啡。
[0520]
实施方案142.根据实施方案141所述的宿主细胞，其中所述酶t6odm、cor和 codm的异源编码序列以2:1:3、1:1:3或2:1:2的比例存在。
[0521]
实施方案143.根据实施方案141所述的宿主细胞，其中：
[0522]
所述宿主细胞进一步包含与对照酵母菌株相比增加的量的谷氨酰胺、2-酮戊二酸和谷氨酸中的一种或多种；
[0523]
所述宿主细胞不由蒂巴因产生东罂粟碱或吗啡酮；并且
[0524]
所述宿主细胞能够产生产率为总阿片的30％以上的阿片化合物。
[0525]
实施方案144.一种产生牛心果碱的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含一种或多种异源编码序列的多个拷贝，所述异源编码序列编码来源于与所述宿主细胞相比不同的来源生物的一种或多种甲基转移酶，其中所述一种或多种甲基转移酶选自6omt、 cnmt和4’oμτ。
[0526]
实施方案145.一种产生血根碱或血根碱前体的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含来源于与所述宿主细胞相比不同的来源生物的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶选自bbe、cfs、cpr、sts、tnmt、msh、p6h和 dbox，并且所述血根碱前体选自碎叶紫堇碱、刺罂粟碱、顺式-n-甲基刺罂粟碱、金黄紫堇碱、前托品和二氢血根碱。
[0527]
实施方案146.一种产生原小檗碱生物碱的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含来源于与所述宿主细胞相比不同的来源生物的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶选自bbe、s9omt、cas和stox，并且所述原小檗碱生物碱由下列结构之一表示：
[0528][0529]
其中r1-r14各自独立地选自h、烷基、羟基或烷氧基。
[0530]
实施方案147.一种产生蒂巴因的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含来源于与所述宿主细胞相比不同的来源生物的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶选自salsyn、cyp2d6、cyp2d2、salr和salat。
[0531]
实施方案148.一种产生阿片化合物的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含：
[0532]
选自t6odm、cor和codm的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列，其中所述一种或多种酶来源于与所述宿主细胞相比不同的来源生物；以及
[0533]
选自恶臭假单胞菌mora和恶臭假单胞菌morb的一种或多种酶的一种或多种异源编码序列；并且所述阿片化合物选自可待因、吗啡、氢可酮、氢吗啡酮、羟考酮、二氢可待因、14-羟基可待因和二氢吗啡。
[0534]
实施方案149.一种制备苄基异喹啉生物碱(bia)的方法，其包括：
[0535]
在适于蛋白质产生的条件下培养如权利要求1所述的宿主细胞；
[0536]
向细胞培养物中添加起始化合物；以及
[0537]
从细胞培养物中回收bia；
[0538]
其中所述宿主细胞在包含谷氨酰胺、2-酮戊二酸、谷氨酸以及2％以下的二甲基亚砜 (dmso)中的一种或多种的培养基中培养。
[0539]
尽管为了清楚理解的目的已通过说明和实例的方式相当详细地描述了上述发明，但根据本发明的教导对本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离所附权利要求的精神或范围的情况下可对本发明进行某些改变和修改。
[0540]
因此，上文仅仅说明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够想到各种设置，尽管这些设置没有在本文中明确地描述或示出，但它们体现了本发明的原理并包括在本发明的精神和范围内。此外，本文中叙述的所有实例和条件语言均主要旨在帮助读者理解本发明的原理以及由本发明人为促进本领域而贡献的概念，并且应理解为不限于这些具体叙述的实例和条件。此外，本文中述及本发明的原理、方面和实施方案以及它们的具体实例的所用陈述均旨在涵盖其结构和功能等同物。另外，意图在于，这样的等同物包括当前已知的等同物和将来开发的等同物，即，所开发的执行相同功能的任何元件，而不论其结构如何。因此，本发明的范围并不旨在限于本文中示出和描述的示例性实施方案。而是，本发明的范围和精神由所附的权利要求书来体现。