一株成团泛菌及其在防治花椒病害方面的应用的制作方法

1.本发明属于微生物应用领域，具体而言，本发明涉及一株成团泛菌菌株及其用途。


背景技术：

2.花椒(zanthoxylum bungeanum)原产于中国，落叶小乔木或灌木，属于芸香科、花椒属。花椒耐干旱、瘠薄，适宜性强，分布广，是我国重要的经济树种。花椒是重要的食用调味品、中药材、香料及木本油料树种，同时花椒根系发达，防止水土流失，因此花椒种植具有重要经济价值和生态价值，在当地乡村振兴中发挥着重要作用。我国是花椒生产和贸易大国，种植面积约1728.4万亩，2020年产量45.6万吨。但由于气候的变化和栽培方式的改变、栽培面积的迅速扩大，花椒溃疡病、锈病、炭疽病、棉蚜、全爪螨等病虫害已呈现多发、频发、重发的态势，严重影响花椒产量，危害产业健康发展。最近，许多花椒园中出现一种新型溃疡病，危害花椒枝干，侵染部位组织坏死，凹陷，容易风折，严重时，整个枝条枯死。该病由间座壳属真菌侵染引起，病菌主要通过伤口、皮孔等侵入寄主组织，严重影响花椒树势及花椒产量，给农户们造成了极大的危害。
3.目前，花椒病害的防治措施以依赖化学农药为主，易造成病虫抗药性增强、防治效果下降，出现农药越打越多、病虫越防越难，农药残留超标等问题，严重影响果品质量安全和生态环境安全，制约花椒出口。因此利用生物防治技术控制花椒病虫害危害是必然趋势。利用拮抗微生物防治花椒溃疡病等病害有望成为代替化学药剂的一种安全、无毒及有效的新方法。拮抗微生物不仅可以防病，而且还能促进植物生长，对改善林地生态系统，保持林间生物多样性，以及维护林田生态平衡实现林业可持续发展将起到重要作用。与其他生物农药相比，微生物源生物农药生防因子繁殖速度快、防治效果持久、开发利用途径多、不易产生抗性、发酵工艺简单及生产成本低，成为生物农药领域的研究热点，依然是未来较长一段时间生物农药登记的主要选择。
4.成团泛菌在自然界分布广泛，是重要的生防微生物资源。目前利用成团泛菌防治花椒溃疡病还未见报道。


技术实现要素：

5.本发明的首要目的是提供一株新的成团泛菌菌株hjeb-01，它可以用作生物农药，用来防治花椒溃疡病等花椒病害，具有良好的应用前景。
6.本发明的另一个目的是提供一种采用新的成团泛菌制备的生物菌剂(发酵液)。
7.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
8.本发明提供的成团泛菌(pantoea agglomerans)hjeb-01，是从花椒枝条中采用组织分离法分离获得的，已于2022年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no：m 2022255。其具有以下微生物学特性：hjeb-01菌株表面粘稠，菌落黄色、圆形、光滑、边缘整齐，隆起，革兰氏染色阴性。上述菌株普通培养采用lb培养基保存，长期保存选用20％甘油保存。
9.该微生物菌剂可以用作生物农药，用于防治花椒溃疡病等花椒病害。因此，另一方面，本发明提供成团泛菌hjeb-01或者其发酵液用于防治花椒溃疡病等花椒病害中的用途。
10.本发明还提供一种用于防治花椒溃疡病的方法，所述方法包括向具有花椒溃疡病的花椒施用成团泛菌hjeb-01或者其生物菌剂(发酵液)。
11.上述生物菌剂(发酵液)制备采用的发酵培养基为：蛋白胨0.3-0.8％，酵母膏0.3-0.8％，蔗糖0.8-1.2％，黄豆粉2-3％，玉米粉0.8-1.2％，轻质碳酸钙0.2-0.3％，氯化钠0.03-0.08％，其余为水，ph 8。培养条件：培养温度28-32℃，初始ph7.5-8.5，接菌量1.0-2.0％，培养时间36-60h。采用此培养基发酵培养，菌数可达50-90亿/g。
12.实验表明，本发明的成团泛菌具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，其发酵液100倍防治花椒溃疡病效果显著，防治效果达到63.45％，无药害产生。同时其安全高效，无药残，无毒副作用，能减少化学农药的使用，因而在生物防治花椒溃疡病等花椒病害中具有重要应用前景。
附图说明
13.图1为成团泛菌hjeb-01单菌落形态图；
14.图2为成团泛菌hjeb-01对花椒溃疡病菌抑制效果图；其中a图为成团泛菌hjeb-01对花椒溃疡病菌抑菌效果；b图为只接种花椒溃疡病菌饼的对照。
具体实施方式
15.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
16.实施例1：成团泛菌(p.agglomerans)hjeb-01的分离与鉴定
17.1.分离：
18.本发明的成团泛菌是从山东省菏泽市花椒种植园中采用组织分离法分离获得的，分离方法为：
19.(1)组织采集：从花椒溃疡病发病较重花椒园采集健康无病的花椒枝条，置于密封袋中，带回实验室，备用；
20.(2)培养基平板制备：将马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)融化，分别倒入无菌培养皿，冷却，制成pda平板；
21.(3)将采回的健康花椒枝条依次进行以下处理：
①
流动自来水冲洗干净1min，晾干；
②
用75％乙醇表面消毒；
③
将处理好的花椒枝条，在无菌条件下，用无菌的剪刀将花椒枝条剪成5mm
×
5mm的组织块；
④
将组织块在75％乙醇中浸泡30s，然后再将组织块转入3％次氯酸钠溶液中浸泡1min，最后将组织块依次在无菌水中冲洗3次。
22.(4)取上述处理好的组织块，每个平皿放置5块，置于培养箱28℃恒温培养3-5d。
23.(5)将单个菌落在pda培养基上划线，得到单菌落，转移至pda试管斜面培养基中，至28℃恒温培养。
24.(6)以花椒溃疡病菌(diaporthe eres)为靶标菌，采用对峙培养法，筛选到1株对
花椒溃疡病菌具有较强抑制活性的菌株，编号hjeb-01。
25.上述pda培养基配方为：马铃薯(去皮切块)200g，葡萄糖20g，琼脂14g，蒸馏水1000ml。
26.2.菌株鉴定
27.(1)微生物学特性：hjeb-01菌株表面粘稠，菌落黄色、圆形、光滑、边缘整齐，隆起(如图1)，革兰氏染色阴性。产生黄色素。生理生化特性如表1所示，过氧化氢酶、硝酸盐还原阳性，氧化酶、吲哚产生试验阴性，能够利用柠檬酸盐、丙二酸盐产碱，甘露醇、水杨苷、肌醇、纤维二糖、蔗糖、鼠李糖、麦芽糖。明胶液化。
28.表1：hjeb-01菌株的生理生化特性
[0029][0030]
(2)分子生物学特性：
[0031]
16s rrna基因序列测定结果如seq no.1所示；gyrb基因序列测定结果如如seq no.2所示；fusa基因序列测定结果如seq no.3所示；leus基因序列测定结果如seq no.4所示；pyrg基因序列测定结果如seq no.5所示；rplb基因序列测定结果如seq no.6所示。
[0032]
将hjeb-01菌株的16s rrna扩增序列以及5个管家基因(gyrb,fusa,leus,pyrg,rplb)序列在ncbi数据库中比对，16s rrna序列与pantoea agglomerans pls15(mk602441)同源性为99％；fusa序列与p.agglomerans uaeu18(cp048033)同源性99.13％；gryb、leus序列与p.agglomerans zju23(cp068440)同源性分别为100％、99.87％；pyrg序列与p.agglomerans qyz2(mk348966)同源性为98.84％；rplb序列与p.agglomerans rsg17(mk125267)同源性为99.17％。结合hjeb-01菌株的形态特征，确定hjeb-01属于成团泛菌(p.agglomerans)。
[0033]
此菌株已于2022年3月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学，中国典型培养物保藏中心)，保藏号为cctcc no：m 2022255。
[0034]
实施例2成团泛菌hjeb-01对花椒溃疡病室内效果验证
[0035]
1.实验方法
[0036]
采用平板对峙培养法，将供试的花椒溃疡病(diaporthe eres)菌饼(9mm)移至平板中央，在距花椒溃疡病菌菌饼2cm处对称接种hjeb-01菌株，置28℃生化培养箱培养，每个处理重复3次。待对照组(在平板中央只接种9mm花椒溃疡病菌饼)菌丝长满平板时，采用十字交叉法测量菌落直径、抑菌带直径，计算平均值和相对抑制率。
[0037]
2.结果
[0038]
由图2和表2可以看出，hjeb-01对花椒溃疡病菌菌丝生长均具有较强的抑制作用，抑菌带直径分别为11.16mm，菌丝生长抑制率分别为81.8％。
[0039]
表2：hjeb-01对花椒溃疡病菌室内抑菌活性测定
[0040][0041]
实施例3成团泛菌(p.agglomerans)hjeb-01发酵液的制备
[0042]
种子液培养基：牛肉浸膏3g，蛋白胨5g，氯化钠5g，水1000ml，ph 7.3。
[0043]
发酵培养基配方(重量百分含量)：蛋白胨0.5％，酵母膏0.5％，蔗糖1％，黄豆粉2.5％，玉米粉1％，轻质碳酸钙0.25％，氯化钠0.05％，其余为水，ph 8。
[0044]
制备方法：
[0045]
1)种子液培养：将成团泛菌菌株hjeb-01从试管斜面中挑取少量菌落，移至种子液体培养基中，30℃摇床振荡培养24-36h，此为种子液；
[0046]
2)发酵培养条件：培养温度30℃，初始ph8，装液量70％，接菌量1.5％，培养时间48h，通气量25ml/250ml，转速200r/min，采用此培养基发酵培养，活菌数可达50-90亿/g。
[0047]
实施例4成团泛菌(p.agglomerans)hjeb-01发酵液的作用验证
[0048]
本实施例提供了成团泛菌(p.agglomerans)hjeb-01发酵液针对花椒溃疡病的相关实验。
[0049]
1.1供试药剂
[0050]
本发明实施例3制备的成团泛菌(p.agglomerans)hjeb-01发酵液，活菌数80亿/g。
[0051]
1.2供试作物与防治对象：
[0052]
供试作物为花椒；防治对象：溃疡病。
[0053]
1.3试验地情况
[0054]
试验地设在山东省枣庄市花椒种植园中，于2021年进行林间防治花椒溃疡病试验。花椒树为4年生，树势中等偏弱，病害发生严重。所有试验小区栽培条件及管理措施一致，3月5日用药1次，每隔15d施药1次，共3次。
[0055]
1.4试验设计及安排
[0056]
本试验设计了成团泛菌(p.agglomerans)hjeb-01发酵液25倍、50倍、100倍等3个浓度稀释梯度，以清水作对照，共4个处理，每处理重复4次，共16个小区，各小区随机排列，每个小区5棵花椒树。病斑清理后用药，采用刮治法进行花椒溃疡病的防治。用刮刀将溃疡病病部及周边0.5cm-1cm组织刮净，病疤切口要求立茬、梭形。药剂处理如下：首先用毛刷将成团泛菌菌液涂抹病部并超出切口2cm～3cm，然后用无菌的脱脂棉蘸取成团泛菌菌液，包裹在病部，最后用保鲜膜包裹保湿，7d后除去保鲜膜。以无菌水为对照。3月5日用药1次，每隔15d施药1次，共3次。
[0057]
1.5试验调查及计算方法
[0058]
1.5.1药效调查、调查时间和次数
[0059]
第一次施药时调查各处理病疤数，编号、记录。最后一次用药后30d，调查一次发病
情况。计算防治效果，整个试验调查1次。
[0060]
1.5.2药效计算方法
[0061]
药效按下述公式计算：
[0062]
(复)发病率(％)＝复发病疤数/调查总病疤数
×
100
[0063]
防治效果(％)＝(对照区复发病率－处理区复发病率)/对照区复发病率
×
100
[0064]
2.结果
[0065]
2.1供试药剂对花椒溃疡病的防治效果
[0066]
表3和表4结果显示，成团泛菌(p.agglomerans)hjeb-01发酵液对花椒溃疡病具有较好的防治效果，25倍、50倍、100倍防治效果分别达68.99％、68.17％、63.45％，在p《0.05水平上无显著性差异。
[0067]
表3：成团泛菌hjeb-01发酵液防治花椒溃疡病原始数据
[0068][0069][0070]
表4：成团泛菌hjeb-01发酵液防治花椒溃疡病林间药效试验2021年枣庄
[0071][0072]
注：表中数据后不同的小写字母表示经duncan多重比较后差异显著(p《0.05)。
[0073]
3.小结
[0074]
从花椒溃疡病病斑复发率和防治效果来看，成团泛菌(p.agglomerans)hjeb-01发酵液对花椒溃疡病具有较好的防治效果，稀释25倍、50倍、100倍处理后防治效果可达
68.99％、68.17％、63.45％，3种处理后防治效果差异不显著，成团泛菌hjeb-01可以在林间用于花椒溃疡病的防治。