N-糖基化HYOU1蛋白在子痫前期胎盘中的应用

n-糖基化hyou1蛋白在子痫前期胎盘中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及n-糖基化hyou1蛋白在子痫前期胎盘中的应用。


背景技术：

2.子痫前期(preeclampsia)指妇女妊娠20周后出现血压升高和蛋白尿，并可出现头痛、眼花、恶心、呕吐、上腹不适等症状，严重威胁母婴健康。
3.目前胎盘浅着床学说，免疫学说，遗传学说等假说都未能完全解释子痫前期的发病机制。糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰的一种重要类型，在细胞内蛋白质糖基化修饰几乎参与各个环节，可以影响许多细胞、组织、器官相关蛋白的表达水平、结构及功能。蛋白质的糖基化修饰是在内质网和(或)高尔基复合体上多种糖基转移酶和糖苷酶的催化下将糖基或糖链与多肽链相连，经过不同可变剪切或置换，形成不同糖结构或糖基化水平的糖蛋白过程。蛋白质糖基化修饰根据糖基或糖链与蛋白质的连接方式不同主要分为n-连接糖基化(n-linked glycosylation)、o-连接糖基化(o-linked glycosyl ation)、c-甘露糖基化及磷脂酰肌介导的糖基化(glycosyl-phosphati dyl inositol，gpi)等几种方式。真核生物中的蛋白质半数以上可由糖基化形成糖蛋白，其中90％是n-连接糖蛋白。糖基化修饰在蛋白质结构组成、细胞信号传导、免疫调节、肿瘤发生和转移等过程起到重要作用，目前在子痫前期胎盘中的表达水平和作用还有待于进一步研究。


技术实现要素：

4.针对现有技术所存在的上述缺点，本发明公开了n-糖基化hyou1蛋白在子痫前期胎盘中的应用，通过筛选出来的合适糖基化蛋白质(hyou1)，可能作为未来子痫前期的检测标志物或分子靶点。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
6.本发明提供了n-糖基化hyou1蛋白在子痫前期患者胎盘检测中的应用。
7.进一步的，所述的n-糖基化hyou1蛋白是选用正常孕妇胎盘和子痫前期孕妇胎盘对比，各组蛋白质经酶解后利用凝集素富集n-糖基化肽段，再用n-糖酰胺酶f在h
218o
中切除糖链，然后通对lc-ms/ms对糖基化位点进行分析，应用lable-free技术实现大规模n-糖基化蛋白质定性定量分析。
8.更进一步的，所述的痫前期患者胎盘n-糖基化hyou1蛋白表达减少。
9.有益效果
10.采用本发明提供的技术方案，与已知的公有技术相比，具有如下有益效果：
11.本发明子痫前期患者胎盘n-糖基化hyou1蛋白表达减少，对子痫前期胎盘和正常胎盘进行western blot显示，子痫前期胎盘糖基化的hyou1显著下调，hyou1在内质网的蛋白质折叠中发挥重要作用，通过筛选出来的合适糖基化蛋白质(hyou1)，可能作为未来子痫前期的检测标志物或分子靶点。
附图说明
12.图1为本发明n-糖基化hyou1蛋白表达水平的示意图。
具体实施方式
13.本发明通过筛选出来的合适糖基化蛋白质(hyou1)，可能作为未来子痫前期的检测标志物或分子靶点。
14.下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
15.实施例：
16.1.样本获取
17.取2020.9-2020.12期间，哈尔滨医科大学附属第一医院收治的正常患者和子痫前期患者，诊断标准参照妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)，年龄住院分娩患者胎盘分为正常对照组和子痫前期组，子痫前期组年龄24-40岁，平均(32.33
±
3.59)岁；选取同期孕晚期血压正常孕妇作为正常对照，年龄23-40岁，平均(31.06
±
3.94)岁；所有病例均无妊娠期糖尿病，其中重度子痫前期孕妇在采取解痉、镇静、降血压等治疗措施控制病情后48h内终止妊娠，患者均签署知情同意书。
18.胎盘在分娩后立即取样，留取1.0cm
×
1.0cm
×
1.0cm大小母体面胎盘组织，避免取钙化或其他异常部位，置pbs中反复漂洗3次，每次5min，其中正常组胎盘18例(分为a1、a2、a3三组，每组6例)和子痫前期组胎盘18例(分为b1、b2、b3三组，每组6例)，标本置于-80℃冰箱保存。
19.2.蛋白质抽提
20.取组织或微生物菌体沉淀加入适量sdt裂解液，转移至lysing matrix a管中，应用mp匀浆仪进行匀浆破碎(24
×
2，6.0m/s，60s，两次)。超声后，沸水浴10min。14000g离心15min，取上清采用0.22μm离心管过滤，收集滤液。采用bca法进行蛋白质定量。分装样品，-80℃保存。
21.3.sds-page电泳
22.各样品取蛋白质20μg分别加入6x上样缓冲液，沸水浴5min，进行12％sds-page电泳(恒压250v，40min)，考马斯亮蓝染色。
23.4.fasp酶解
24.各样品取5mg蛋白质溶液，分别加入dtt至终浓度为100mm，沸水浴5min，冷却至室温。加入2mlua buffer混匀，各样品等体积分装转入10个30kd超滤离心管中，离心12500g，15min，弃滤液(重复该步骤一次)。加入100μl iaa buffer(100mm iaa in ua)，600rpm振荡1min，室温避光反应30min，离心12500g，15min。加入100μl ua buffer离心12500g 15min，重复该步骤两次。加入100μl 40mm nh4hco3溶液，离心12500g，15min，重复该步骤两次。换新收集管，加入40μl trypsin buffer(5μg trypsin in 40μl 40mm nh4hco3溶液)，600rpm振荡1min，37℃放置16-18h。离心12500g 15min；再加入20μl 40mm nh4hco3溶液，离心12500g 15min，收集滤液。采用c18 cartridge对肽段进行脱盐。
25.5.n-糖基化肽段富集
26.将fasp酶切后获得的肽段溶液中加入36ul wcr凝集素混合溶液，旋转仪上室温孵育1h；孵育完毕后转移到30kd超滤管中，12000g离心25min；用200μl binding buffer清洗
四次，每次12000g离心25min；用40μl 40mm nh4hco3(用h2 18o配制)清洗两次，每次12000g离心15min；加入40μl pngase f buffer(50u pngase f in 40mm nh4hco3(用h
218o
配制))，600rpm振荡1min，37℃放置3h；12000g离心20min；用40μl nh4hco3清洗两次，每次12000g离心15min；将所得产物用stagetip c18柱脱盐冻干，10μl 0.1％甲酸水复溶(hyou1)。
27.6.质谱分析
28.1)easy nlc色谱
29.每份样品采用纳升流速easy nlc系统进行分离。缓冲液a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为80％)。色谱柱以100％的a液平衡，样品由自动进样器上样到分析柱(thermo fisher scientific，acclaim pepmap rslc 50um
×
15cm,nano viper,p/n164943)分离，流速为300nl/min。2小时液相梯度为：0min-5min，b液3％；5min-95min，b液线性梯度从3％-28％；95min-110min，b液线性梯度从28％-38％；110min-115min，b液线性梯度从38％-100％；115min-120min，b液维持在100％。
30.2)质谱鉴定
31.样品经色谱分离后用q exactive hf-x质谱仪进行质谱分析。分析时长为120，检测方式为正离子，母离子扫描范围350-1800m/z，一级质谱分辨率为6000，agc target为3e6，一级maximum it为50ms。多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后采集10个碎片图谱(ms2 scan)，ms2 activation type为hcd，isolation window为2m/z，二级质谱分辨率15000，microscans为1，二级maximum it为120ms，normalized collision energy为27ev。
32.7.数据分析
33.1)质谱raw文件处理
34.采用maxquant中的label-free算法对蛋白质组学数据进行非标记定量计算，在蛋白质组学研究中，高分辨率质谱仪采集原始数据的方式可以分为数据依赖性采集(data-dependent acquisition,dda)和数据非依赖性采集(data-independent acquisition,dia)两种。基于label-free技术的蛋白质定量分析一般采用dda方式进行原始数据的采集，也就是普通意义上的shotgun方式。在dda模式的采集方式中，质谱仪先采集一次ms1数据，然后采集若干次ms2数据。在本实验中，采用的是基于ms1数据积分的非标记定量方法。由于ms1的数据密度非常高，因此在数据积分计算之前，还需要使用maxquant软件对原始数据进行peptide feature的智能识别工作。
35.2)数据库选择
36.使用数据库为：uniprot_homosapiens_20394_20210127(下载链接：http://www.uniprot.org)。
37.3)蛋白质定性和定量分析参数
38.采用maxquant软件(版本号1.6.14.0)进行数据库搜索，采用lfq(label free quantitation)算法进行定量分析。
39.8.生信分析方法
40.1)go注释与kegg注释的富集分析
41.在对目标蛋白质集合进行go注释或kegg通路注释的富集分析时，通过fishe精确检验(fisher’s exact test)，比较各个go分类或kegg通路在目标蛋白质集合和总体蛋白
质集合中的分布情况，来评价某个go term或kegg通路蛋白质富集度的显著性水平。
42.2)亚细胞定位分析
43.蛋白质亚细胞定位常用的预测软件有wolf psort(https://wolfpsort.hgc.jp/)。该软件基于分选信号、氨基酸组成和功能性基序，将蛋白质序列转换为数字定位特征。随后使用k最近邻分类器预测蛋白质的亚细胞定位。基于此，采用软件wolf psort对蛋白质进行定位预测分析。
44.3)结构域注释及富集分析
45.interpro数据库集合了蛋白质序列的家族分类、结构域和特殊位点的预测等功能，采用此数据库对差异蛋白质进行功能结构域富集分析。通过fisher精确检验(fisher’s exact test)比较差异蛋白在总蛋白集合中的分布情况，来评价某个功能结构域富集度的显著性水平(如图1)。
46.4)聚类分析(clustering)
47.进行聚类分析时，首先对目标蛋白质集合的定量信息进行归一化处理。其次，使用matplotlib软件同时对样品和蛋白质的表达量两个维度进行分类(距离算法：欧几里得，连接方式：average linkage)。并生成层次聚类热图。
48.9.western blot检测。
49.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不会使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。