祛风活络喷雾剂成分检测方法与流程

1.本发明属中药成分检测技术领域，尤其涉及一种祛风活络喷雾剂的成分检测方法。


背景技术：

2.祛风活络喷雾剂处方由瑶药黄锁梅根、四方藤、铁包金、盐杜仲、大钻、续断、五指毛桃、鸡血藤、千斤拔、茜草组成，通过柳州市中医医院三十多年的临床应用证明，该制剂具有祛风湿、活血通络功效，治疗风湿痹痛、腰肌劳损、腰腿痛效果显著且副作用小，深受广大患者的欢迎。
3.祛风活络喷雾剂方中主要成分为川续断皂苷vi、岩白菜素。目前市面上并未有同时检测祛风活络喷雾剂中川续断皂苷vi、岩白菜素的公开报道。关于检测川续断皂苷vi、岩白菜素的文献、专利、及2020年版《中国药典》，都集中于报道其他产品或生药材的单一物质的含量测定，并不适用于祛风活络喷雾剂有效成分的检测。因此，建立一种快速、全面、针对性强的驱风活络喷雾制剂质量检测方法具有重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种祛风活络喷雾剂成分检测方法，该检测方法操作性强、重现性好、测定偏差小、稳定性好、精密度高，从而可以用来控制产品祛风活络喷雾剂的质量。
5.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：它包括所述祛风活络喷雾剂由黄锁梅根、黑老虎、四方藤、铁包金、杜仲、续断、五指毛桃、鸡血藤、千斤拔、茜草经浸泡提取制得，所述检测方法包括以下步骤：（1）混合对照品溶液的制备：将岩白菜素、川续断皂苷vi对照品用50%甲醇溶解并进行稀释，得到混合对照品溶液，备用；（2）供试品溶液的制备：将所述祛风活络喷雾剂用50%甲醇进行稀释，并用微孔滤膜过滤，得到供试品溶液，备用；（3）高效液相色谱条件为：色谱柱：diamonsil c
18
（250
×
4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（a）-0.2%磷酸水（b）；梯度洗脱：（0min-16min，10%a；16-22 min，10%-30%a；22-50 min，30%-34%a）；流速：1 ml
·
min-1
；柱温：30℃；检测波长：212 nm；进样量：10 μl；
（4）供试品溶液的质量检测：分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各10μl，按上述色谱条件进样测定，得到色谱图，并用外标两点法对数方程计算供试品溶液中的川续断皂苷vi、岩白菜素含量。
6.上述技术方案中，更具体的技术方案还可以是：所述混合对照品溶液的具体制备方法如下：精密称取岩白菜素、川续断皂苷vi对照品，加50%甲醇溶解并稀释，分别制成岩白菜素1021.4125μg
·
ml-1
、川续断皂苷1037.9855μg
·
ml-1
的对照品储备液；然后分别取上述对照品储备液，置于同一10ml容量瓶中，加入50%甲醇定容至10ml，配制成岩白菜素和川续断皂苷vi分别为51.07μg
·
ml-1
、 207.60μg
·
ml-1
的混合对照品溶液。
7.进一步，所述供试品溶液的具体制备方法如下：将10ml祛风活络喷雾剂进行离心，精密量取5.0ml上清液放入25 ml量瓶中，加入50%甲醇定容至25ml，超声处理20min以上，微孔滤膜滤过，得到供试品溶液。
8.进一步，所述微孔滤膜的孔径为0.22μm～0.45μm。
9.进一步，所述祛风活络喷雾剂中各制备原料的重量份数如下：黄锁梅根1份～6份、黑老虎2份～5份、四方藤1份～4份、铁包金1份～7份、杜仲2份～8份、续断1份～3份、五指毛桃1份～4份、鸡血藤2份～6份、千斤拔1份～5份、茜草1份～5份。
10.进一步所述祛风活络喷雾剂的制备方法包括以下步骤：
①
所有中草药原料粉碎制成药材粗粉；
②
将制得的药材粗粉用溶剂浸透，然后放置于渗漉筒中，压紧，接着继续加入溶剂，使其完全浸没，并浸泡24小时以上；其中，所述溶剂为50%~60%米酒、50%~60%酒精中的一种；
③
待药材粗粉浸泡结束后，继续加入8倍~12倍溶剂，并以2 ml
·
min-1
·
kg-1
~4 ml
·
min-1
·
kg-1
的流速进行渗漉，过滤；其中，渗漉过程中保持进出液速率一致。
11.进一步的，待药材粗粉浸泡结束后，继续加入10倍溶剂进行渗漉。
12.进一步，以3ml
•
min-1
•
kg-1
的体积流量进行渗漉。
13.其中，本发明所述黄锁梅根为蔷薇目蔷薇科悬钩子属植物黄锁梅的根，其味酸、涩，性温，别名钻地风、黄藨、大红黄泡叶、栽秧泡。
14.所述黑老虎为木兰科南五味子属植物黑老虎的根，其味辛、微苦，性温，别名冷饭团、过山风、风沙藤、透地连珠、三百两银、红钻、十八症。
15.所述四方藤为葡萄科白粉藤属植物四方藤的藤，其味微酸、涩，性平，别名红四方藤、翼枝白粉藤。
16.所述铁包金为鼠李科植物铁包金及同属植物光枝勾儿茶的茎藤或根，其味苦、微涩，性平，别名狗脚利、老鼠草、鼠乳头、乌金藤、小号铁包金、乌石米、老鼠耳。
17.所述杜仲为杜仲科植物杜仲的干燥树皮，其味甘、性温，别名丝楝树皮、丝棉皮、棉树皮、胶树。
18.所述续断为川续断科多年生草本植物川续断的干燥根，其味苦、辛，性微温。
19.所述五指毛桃为桑科榕属五指毛桃灌木或落叶小乔木的根，其味甘、性平，别名粗叶榕、三龙爪、亚桠、五爪龙、五指牛奶。
20.所述鸡血藤为豆科植物密花豆的干燥藤茎，其味苦、甘，温，别名血风、血藤、血风藤。
21.所述千斤拔为豆科千斤拔属植物，别名蔓性千斤拔、一条根、钻地风。
22.所述茜草为茜草科茜草属多年生草质攀援藤木的根和根茎，其味苦、寒，别名四轮草、拉拉蔓、小活血、过山藤。
23.由于采用上述技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明操作性强、重现性好、测定偏差小、稳定性好、精密度高，其用于检测祛风活络精喷雾剂中的药物有效成分川续断皂苷vi、岩白菜素的含量，并通过检测二者有效成分的含量了解祛风活络喷雾剂在生产过程中是否达到生产要求，从而起到控制产品质量的作用。
附图说明
24.图1是各因素对综合得分的等高线图和响应面图。
具体实施方式
25.以下结合附图及实施例，对本发明作进一步详述：以下实施例为祛风活络喷雾剂成分检测方法，以及由该检测方法化学计量学评价祛风活络喷雾剂的质量的方法：1 仪器与试药1.1仪器高效液相色谱仪（安捷伦1260）；sqp电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）；kq-800de超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；gwb-1超纯水机（北京普析）。
26.1.2试药岩白菜素对照品（成都曼斯特，批号：must-21060907，纯度99.65%）；川续断皂苷vi（成都曼斯特，批号：must-21012211，纯度98.95%）；乙腈为色谱纯（弗顿），其他试剂为分析纯。
27.祛风活络喷雾剂处方用的原料药材由广西仙茱中药有限公司提供，经柳州市中医医院梁学政主任药师鉴定，符合2020年《中国药典》一部与2014年《广西壮族自治区瑶药材质量标准》一卷相关标准。
28.2方法与结果2.1含量测定2.1.1色谱条件色谱柱为diamonsil c
18
（250
×
4.6 mm，5 μm）；流动相:乙腈（a）-0.2%磷酸水（b），梯度洗脱（0min-16min，10%a；16-22 min，10%-30%a；22-50 min，30%-34%a）；流速1 ml
·
min-1
；柱温：30℃；检测波长：212 nm；进样量10 μl。
29.2.1.2混合对照品溶液的制备精密称取岩白菜素、川续断皂苷vi对照品适量，加50%甲醇溶解并稀释，分别制成岩白菜素1021.4125μg
·
ml-1
、川续断皂苷1037.9855μg
·
ml-1
的对照品储备液。各取上述对照品储备液适量，置于同一10ml容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，配制成岩白菜素和川续
断皂苷vi分别为51.07μg
·
ml-1
、 207.60μg
·
ml-1
的混合对照品溶液。
30.2.1.3供试品溶液的制备精密量取祛风活络喷雾剂5 ml至25 ml量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤即得。
31.2.1.4阴性样品溶液的制备按照祛风活络喷雾剂的制备工艺和处方比例，分别制备缺四方藤与缺续断的阴性样品，按“2.1.3”项下方法制备。
32.2.1.5系统适应性和专属性试验精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10 μl，按“2.1.1”项色谱条件进样测定。结果显示岩白菜素和川续断皂苷vi与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且阴性无干扰，表明该方法专属性良好。
33.2.1.6线性关系考察精密吸取适量岩白菜素、川续断皂苷对照品储备液适量，稀释成质量浓度分别为岩白菜素12.77、25.54、51.07、76.61、102.14、127.68μg
·
ml-1
；川续断皂苷vi51.90、103.80、207.60、311.40、415.19、518.99μg
·
ml-1
的系列混合对照品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进样测定。以对照品浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，则岩白菜素和川续断皂苷vi分别在12.77~127.68μg
·
ml-1
和51.90~518.99μg
·
ml-1
质量浓度范围内线性良好。回归方程：岩白菜素y=4.11
×
10x 45.725，r=0.9997；川续断皂苷vi y=1.75x 0.178，r=0.9999。
34.2.1.7精密度试验取混合对照品溶液10 μl，连续进样6次，结果以岩白菜素、川续断皂苷vi峰面积计算，rsd分别为0.76%、2.58%，说明仪器精密度良好。
35.2.1.8稳定性试验取同一供试品溶液10 μl，间隔0、2、4、6、8、12 h进样，结果以岩白菜素、川续断皂苷vi的峰面积计算，rsd分别为0.41%、2.81%，说明供试品在12 h内稳定性良好。
36.2.1.9重复性试验精密量取同一批祛风活络喷雾剂，按“2.1.4”项制成6份供试品溶液，进样10 μl，结果显示岩白菜素和川续断皂苷vi含量的rsd分别为0.32%、1.29%，说明该方法重复性良好。
37.2.1.10加样回收率试验精密量取已知含量的祛风活络喷雾剂2.5ml，共6份，每份分别加入岩白菜素、川续断皂苷vi 对照品储备液0.5ml、1.5ml，用50%甲醇定容至25 ml，按“2. 1.1”项色谱条件进样测定，计算回收率及其rsd。结果显示平均加样回收率分别为103.32%、101.00%，rsd 分别为0.78%、1.63%，说明该方法准确度较高。
38.2.2单因素试验根据相关文献及前期预实验结果，对乙醇体积分数、渗漉溶剂倍量、渗漉流速等三个主要因素进行单因素考察。以中医药君臣佐使配伍理论和对病症具有疗效的物质作为评价指标原则，本发明以川续断皂苷vi、岩白菜素含量和总固体作为评价指标，设定川续断皂苷vi、岩白菜素和总固体的权重系数分别为30、30、40，总分为100，对三个指标进行总加权
评分，利用综合评分值（p）分析实验结果。其中以各指标的最大值（y
max
）为参照对同一指标数据进行标准化处理，则综合评分p=d
川续断皂苷vi
×
30 d
岩白菜素
×
30 d
总固体
×
40。（d＝y/y
max
，表示试验中该指标成分测定值的标准化数据）。
39.2.2.1乙醇体积分数取5份药材粗粉，每份96 g，分别以45%、50%、55%、60%、65%体积分数的乙醇400 ml浸润2 h后装于对应的渗漉筒中，浸泡24 h，再以10倍量乙醇，渗漉流速2.0 ml
·
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进行渗漉。收集渗漉液总混后测定岩白菜素，川续断皂苷vi含量和总固体。综合评分见表1，结果表明当乙醇体积分数为50%~60%时p值较大，故选乙醇体积分数55%为中心点。
40.表1 不同乙醇体积分数综合评分。
41.2.2.2渗漉溶剂倍量取5份药材粗粉，每份96 g，以55%乙醇400 ml浸润2 h后分别装于渗漉筒中。浸泡24 h加入6、8、10、12、14倍量55%乙醇，以渗漉流速2.0 ml
·
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·
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进行渗漉。收集渗漉液总混后测定岩白菜素，川续断皂苷vi含量和总固体。综合评分见表2，结果表明溶剂倍量在8~12倍时p值较大，故选择10倍量溶剂为中心点。
42.表2 不同溶剂倍量综合评分。
43.2.2.3渗漉流速在选择乙醇体积分数中心点为55%、溶剂倍量中心点为10倍的基础上，取5份药材粗粉，每份96 g，以55%乙醇400 ml浸润2 h后分别装于渗漉筒，浸泡24 h后加入10倍量55%乙醇，分别以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml
·
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·
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的渗漉流速进行渗漉，收集渗漉液总混后测定岩白菜素，川续断皂苷vi含量和总固体。综合评分见表3，结果表明渗漉液渗漉流速在2~4 ml
·
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kg-1
p值较大，故选渗漉流速3 ml
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为中心点。
44.表3 不同渗漉流速综合评分
。
45.2.3响应曲面优化渗漉提取工艺根据box-behnken中心组合试验设计原理，综合单因素影响试验结果，选取乙醇体积分数（a）、乙醇倍量（b）和渗漉流速（c）作为考察因素，综合评分p作为评价指标，采用design expert 10.0软件设计box-behnken响应面分析试验，以获取最佳工艺参数。实验设计及结果见表4。
[0046] 表4 响应面试验设计方案及结果。
[0047]
使用design-expert 10.0软件对表1对中各指标性成分量的综合权重数据进行多元回归拟合，得到综合评分对编码自变量a、b、c的二次多项回归方程为y=-1120.73 83.04425c 27.47495a 68.26250b－0.4725ac－2.835bc－0.245ab－5.28425c2－0.22077a2－2.21544b2。方差分析及回归系数显著性检验结果可知，所建立的二次多项式模
型具有显著性（p=0.005），模型决定系数r2=0.9671，则表明模型拟合度较好。将因变量与另外两因素拟合为三维曲面图，因该图只能表达含2个因素变量的函数，故固定3个因素之一为中值，以中心点值代入二次回归模型方程得到新方程，根据新模型方程得到响应面三维图，结果见图1，经过中心组合设计优化提取条件，得到最佳工艺条件渗漉流速2.89 ml
·
min-1
·
kg-1
，乙醇体积分数54.45%，乙醇倍量为10.35倍。
[0048]
表5方差分析。
[0049] 2.4验证试验根据design-expert软件优选出最佳工艺为渗漉流速2.89 ml
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，乙醇体积分数54.45%，乙醇量10.35倍。同时结合实际生产情况，最终确定渗漉提取工艺为乙醇体积分数55%，溶剂倍量10倍，渗漉流速为3 ml
·
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。按此最佳工艺进行验证试验，结果见表4，结果所示，在该工艺条件下所测指标与理论值进行比较，相对误差为4.3%，说明验证值与回归方程预测值吻合较好，该渗漉提取工艺稳定可靠，并对实际工业生产具有一定的指导意义。
[0050]
结论本发明前期以总固体为评价指标，对传统浸渍和渗漉进行了比较，并对乙醇浓度、渗漉液收集量、浸渍时间、渗漉流速、药材粒度等因素进行考察，结果显示，渗漉可以提高总固体的溶出并且与传统浸渍相比大大缩短提取时间，影响总固体的主要因素为乙醇体积分数、渗漉溶剂倍量、渗漉流速，故单因素主要对以上三因素进行考察。而比较浸泡时间（1、2、4、6天）的结果显示，浸泡1天总固体与其他时间相比增长不显著；考察药材粒度（最粗粉、粗粉、中粉）对总固体的影响，发现粗粉的总固体最高，故在提取工艺中确定药材粒度为粗粉，提前浸泡时间1天。
[0051]
祛风活络喷雾剂由9味中药组成，在瑶医“盈亏平衡”理论指导下，以“祛因为要”为治疗总则，遵循解毒排毒、启关透窍等治疗总法，通过内服和外治调节机体的失衡，达到治疗“湿盈”引起的寒湿凝滞等风湿病的目的。四方藤、续断是处方中的主要药物，其中四方藤
收载于《广西壮药质量标准（第二卷）》，具有祛风除湿，活血通络之功效，其指标成分为岩白菜素。续断能补肝肾，强筋骨，续折伤，止崩漏，可用于腰膝酸软，风湿痹痛，崩漏，胎漏，跌扑损伤，其指标成分为川续断皂苷vi，故本文选择以上两个指标作为本制剂的检测指标，而单一成分的测定不能完整体现制备工艺的优劣，总固体是中药复方的药效物质总和，其变化可能最终影响药物的临床疗效因此，故对其给与较高的权重分配。本文使得用多个检测指标进行综合评分，且能较为全面反映提取物有效成分的信息，更符合中医用药的整体观。
[0052]
渗漉法属于动态浸出，溶剂利用率高，有效成分浸出完全，可直接收集浸出液。相较于传统浸泡法，利用渗漉法可以大大提高祛风活络喷雾剂生产速度和设备周转效率。由于本实验中醇体积分数、溶剂倍量、渗漉流速3个因素皆为连续性变量，对于变量是连续性的多因素试验分析，box-behnken响应面法分析是最佳选择。box-behnken效应面法可以克服正交试验无法找出整个区域内的因素最佳组合和最优响应值的缺陷，将复杂的未知的函数关系在小区域内用简单的一次或二次多项式模型来拟合，计算比较简便，是解决实际问题的有效手段；其次，所获得的预测模型是连续的，可以连续地对实验的各个水平进行分析；与星点设计法相比，试验次数较少，节约成本，并且弥补了正交设计、均匀设计试验精度不够及无法精确得到最佳点的问题，且回归方程预测性良好。实验结果显示优化后的提取工艺为渗漉流速3ml
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，乙醇体积分数55%，乙醇溶剂倍量为10倍。验证试验表明，验证值与回归方程预测值吻合较好。
[0053]
此外，通过对响应面结果的方差分析（见表5），表明各因素影响程度依次为渗漉流速》乙醇倍量＞乙醇体积分数。当提取溶剂总体积一定时，渗漉流速的选择应考虑充分提取和时间消耗的平衡。渗漉流速快则意味着提取时间短，不利于活性成分充分提取；但流速过慢则会延长渗漉时间。同时渗漉时溶剂用量过小，活性成分可能提取不完全；但溶剂用量过大，则容易造成浪费，并增加后续浓缩处理量。