一种高岭石-黑色素复合止血纤维材料及其制备方法和应用

1.本发明属于功能止血材料技术领域，具体涉及一种高岭石-黑色素复合止血纤维材料及其制备方法和应用。


背景技术：

2.安全高效的止血材料的开发和利用是院前急救成功的关键。目前常见的止血材料的主要止血成分有壳聚糖、二氧化硅、沸石等。壳聚糖止血材料其多孔的结构和氨基基团，可以增加血小板的黏附、促进红细胞等血液组分在伤口部位聚集形成血栓(du,x.,liu,y.,yan,h.,et al.anti-infective and pro-coagulant chitosan-based hydrogel tissue adhesive for sutureless wound closure.biomacromolecules 2020,21,1243-1253)，但是，其难降解和易引发体内过敏反应限制了其应用。介孔二氧化硅可以促进凝血因子xii的激活，加速凝血级联反应促进凝血(wang,c.,zhou,h.,niu,h.,et al.tannic acid-loaded mesoporous silica for rapid hemostasis and antibacterial activity,biomaterials science.2018,6,3318-3331)，但是潜在的代谢毒性及粉末颗粒在伤口处难清理限制了其的应用。沸石基止血材料可以吸附伤口处血液中的水分，促进血小板和凝血因子的聚集，同时，其释放的钙离子可以激活血小板，加速凝血过程(liang,y.,xu,c.,liu f.,et al.eliminating heat injury of zeolite in hemostasis via thermal conductivity of graphene sponge.acsapplied materials interfaces.2019,11,23848-23857)，但是，其剧烈的放热效应可能会对伤口造成二次伤害。因此，需要开发一种兼顾快速凝血及生物安全的止血材料。


技术实现要素：

3.针对现有止血材料的不足，本发明的目的是在于提供一种高岭石-黑色素复合止血纤维材料及其制备方法和应用，通过静电纺丝将高岭石-黑色素复合组分制得复合纤维材料，两者协同提升止血性能，且具有良好的生物安全性。
4.为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
5.一种高岭石-黑色素复合止血纤维材料，由高岭石-黑色素复合组分与高聚物纺丝纤维基材经静电纺丝复合而成，所述高岭石-黑色素复合组分由高岭石颗粒和天然黑色素颗粒复合而成。
6.进一步地，所述高岭石-黑色素复合组分与高聚物纺丝纤维基材的质量比为0.5～0.7：1。
7.进一步地，所述高岭石-黑色素复合组分中，高岭石颗粒与天然黑色素颗粒的质量比为70～95：5～30。
8.进一步地，所述高聚物纺丝纤维基材选自聚乙烯吡咯烷酮、聚己内酯、聚乳酸、聚丙烯酸、聚酰胺中的至少一种。
9.本发明还提供了上述高岭石-黑色素复合止血纤维材料的制备方法，先将高聚物
纺丝纤维基材与纺丝溶剂混合，得到静电纺丝底液；再将高岭石颗粒和天然黑色素颗粒均匀分散到静电纺丝底液中，得到静电纺丝溶液；最后经静电纺丝制得高岭石-黑色素复合止血纤维材料。
10.本发明中的高岭石颗粒可采用高岭石原矿经水洗、超声搅拌、多次离心分离等常规处理得到，进一步优选的尺寸为300～600nm；而天然黑色素颗粒则提取自动物毛发、羽毛、真菌、细菌等，例如可通过将动物毛发、羽毛、真菌、细菌原料中的至少一种在磷酸缓冲液中稀释，经酶解或超声，然后水洗、离心、干燥等常规处理得到(可参照elucidation of the hierarchical structure of natural eumelanins journal ofthe royal society interface,2018,15,20180045)，进一步优选的尺寸为200～400nm。本发明中的高岭石颗粒和天然黑色素颗粒的处理手段均为现有常规工艺，在此不再赘述。
11.进一步地，所述静电纺丝底液中，高聚物纺丝纤维基材的浓度为10～20wt％。
12.进一步地，所述静电纺丝的工艺参数为：电压10～15kv，推料速度0.002～0.008mm/min，环境湿度25～35％，环境温度30～40℃。
13.与现有技术相比，本发明的优势在于：
14.(1)本发明的高岭石-黑色素复合止血纤维材料中，高岭石颗粒能够吸附伤口处血液中的水分，浓缩凝血成分；而天然黑色素颗粒的强吸附性能则能增加血小板、红细胞及凝血酶蛋白等在伤口处的黏附，且高岭石颗粒和天然黑色素颗粒的表面基团和电荷能通过接触作用，活化血小板和激活凝血级联反应，两者协同显著提升复合材料的止血性能。
15.(2)本发明的静电纺丝方法制备的高岭石-黑色素复合止血纤维，能够将止血活性组分颗粒均匀的分散到纳米聚合物纤维中，形成一体化的纺丝纤维，具有质轻、蓬松及柔软的特点，其高比表面积、透气性及与细胞外基质相似的结构能更有效地促进伤口止血及愈合过程。
16.(3)本发明的高岭石-黑色素复合止血纤维材料，基于低毒性的高岭石颗粒和天然黑色素颗粒及高聚物纺丝纤维基材，在具备优异的止血性能的基础上，还具有良好的生物安全性。
附图说明
17.图1为实施例1制备得到的高岭石-黑色素复合止血纤维材料的sem图。
18.图2为实施例2制备得到的高岭石-黑色素复合止血纤维材料的tem图，左图为高岭石纳米颗粒(kaolin)在纤维中的局部放大tem图；右图为天然黑色素颗粒(mgs)在纤维中的局部放大tem图。
19.图3为不同止血材料的止血时间柱状图，其中空白对照组(nc)、聚乙烯吡咯烷酮纤维(pvpnfs；对比例4)、高岭石-黑色素复合粉末(kaolin-mgs；对比例3)、天然黑色素颗粒(mgs；对比例2)、高岭石纳米颗粒(kaolin；对比例1)、高岭石-黑色素复合止血纤维材料(kaolin-mgs nfs；实施例3)、商用quikclot止血材料clotting gauze(clg)及combat gauze(cog)。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步阐述，意图是使本发明的技术特
性、方案流程及创新点更加清楚。同时，应这样理解，本具体实施例仅起到对本发明起解释说明作用，其他凡阅读本发明后，相关技术人员在此基础上做的相关修改或改进同样落入本发明的所申请的保护范围内。
21.实施例1
22.取20g高岭石原矿，溶于800ml的去离子水中(质量比2：80)，超声搅拌6h，进行抽滤。将抽滤得到的高岭石，重悬于100ml去离子水中，以3000rpm的转速进行离心分离，此步骤重复3次。将离心得到的沉淀物，在60℃的烘箱中烘12h，得到高岭石纳米颗粒，粒径尺寸范围在300～600nm。
23.取商业购买的羽毛或发丝，用丙酮洗涤3次，去离子水洗涤3次，剪碎。得到的羽毛或发丝加入到40ml的磷酸缓冲液中(ph＝6.8)，加入0.4g二硫苏糖醇(dtt)，混合均匀，在n2气氛下，37℃条件下振荡12h。加入1ml 20mg/ml的蛋白酶k和0.2g dtt，继续振荡12h。以8000rpm转速进行离心，去离子水洗涤3次，弃上清液，得到沉淀物。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中，重悬、振荡12h。离心，弃上清液，加入6ml磷酸缓冲液和0.12ml聚乙二醇辛基苯基醚，振荡6h，离心，依次用甲醇洗涤3次，去离子水洗涤3次。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中悬浮，37℃条件下振荡12h，此操作重复2次。酶解反应完全之后，在37℃条件下静置12h，离心，弃上清液，去离子水洗涤3次，50℃烘干，得到天然黑色素颗粒，颗粒尺寸范围200～400nm。
24.以具有良好的成膜性、粘结性、吸湿性及低生物毒性的聚乙烯吡咯烷酮为止血材料纤维基质。将聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml的无水乙醇纺丝溶剂中(质量比为12％)，持续搅拌6h。将高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒溶于所制备的纺丝溶液中(高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒占聚乙烯吡咯烷酮的质量比为60％，高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒的质量比为90％：10％)，然后，搅拌24h，得到均匀分散的高岭石-黑色素静电纺丝溶液。
25.结合静电纺丝技术，控制纺丝工艺参数为纺丝电压12kv，推料速度为0.003mm/min，环境湿度25％，环境温度37℃，制备得到高岭石-黑色素复合止血纤维材料。通过场发射扫描电镜观察，其形貌如图1所示，高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒均匀的分散于聚乙烯吡咯烷酮纤维中，部分颗粒暴露于纤维表面，增加了止血纤维材料表面的粗糙度及活性位点。
26.实施例2
27.取15g高岭石原矿，溶于800ml的去离子水中(质量比1.5：80)，超声搅拌8h，进行抽滤。将抽滤得到的高岭石，重悬于100ml去离子水中，以4000rpm的转速进行离心分离，此步骤重复3次。将离心得到的沉淀物，在60℃的烘箱中烘12h，得到高岭石纳米颗粒，粒径尺寸范围在300～600nm。
28.取商业购买的羽毛或发丝，用丙酮洗涤3次，去离子水洗涤3次，剪碎。得到的羽毛或发丝加入到40ml的磷酸缓冲液中(ph＝6.8)，加入0.4g二硫苏糖醇(dtt)，混合均匀，在n2气氛下，37℃条件下振荡12h。加入1ml 20mg/ml的蛋白酶k和0.2g dtt，继续振荡12h。以8000rpm转速进行离心，去离子水洗涤3次，弃上清液，得到沉淀物。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中，重悬、振荡12h。离心，弃上清液，加入6ml磷酸缓冲液和0.12ml聚乙二醇辛基苯基醚，振荡6h，离心，依次用甲醇洗涤3次，去离子水洗涤3次。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中悬浮，37℃条件下振荡
12h，此操作重复2次。酶解反应完全之后，在37℃条件下静置12h，离心，弃上清液，去离子水洗涤3次，50℃烘干，得到天然黑色素颗粒，颗粒尺寸范围200～400nm。
29.以具有良好的成膜性、粘结性、吸湿性及低生物毒性的聚乙烯吡咯烷酮为止血材料纤维基质。将聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml的无水乙醇纺丝溶剂中(质量比为15％)，持续搅拌6h。将高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒溶于所制备的纺丝溶液中(高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒占聚乙烯吡咯烷酮的质量比为70％，高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒的质量比为70％：30％)，然后，搅拌24h，得到均匀分散的高岭石-黑色素静电纺丝溶液。
30.结合静电纺丝技术，控制纺丝工艺参数为纺丝电压15kv，推料速度为0.005mm/min，环境湿度30％，环境温度30℃，制备得到高岭石-黑色素复合止血纤维材料。通过透射电镜观察纤维的结构，如图2所示，高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒均匀的分散于聚乙烯吡咯烷酮纤维中，高岭石纳米颗粒作为纤维的“骨架”支撑起纤维的立体结构，部分高岭石纳米颗粒暴露于纤维表面；而天然黑色素颗粒则在纺丝纤维内部呈现较好分散度。止血组分颗粒的暴露及其更均匀的分散度能增加止血纤维材料的止血活性位点，提高止血性能。
31.实施例3
32.取10g高岭石原矿，溶于800ml的去离子水中(质量比1：80)，超声搅拌12h，进行抽滤。将抽滤得到的高岭石，重悬于100ml去离子水中，以3000rpm的转速进行离心分离，此步骤重复3次。将离心得到的沉淀物，在60℃的烘箱中烘12h，得到高岭石纳米颗粒，粒径尺寸范围在300～600nm。
33.取商业购买的羽毛或发丝，用丙酮洗涤3次，去离子水洗涤3次，剪碎。得到的羽毛或发丝加入到40ml的磷酸缓冲液中(ph＝6.8)，加入0.4g二硫苏糖醇(dtt)，混合均匀，在n2气氛下，37℃条件下振荡12h。加入1ml 20mg/ml的蛋白酶k和0.2g dtt，继续振荡12h。以8000rpm转速进行离心，去离子水洗涤3次，弃上清液，得到沉淀物。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中，重悬、振荡12h。离心，弃上清液，加入6ml磷酸缓冲液和0.12ml聚乙二醇辛基苯基醚，振荡6h，离心，依次用甲醇洗涤3次，去离子水洗涤3次。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中悬浮，37℃条件下振荡12h，此操作重复2次。酶解反应完全之后，在37℃条件下静置12h，离心，弃上清液，去离子水洗涤3次，50℃烘干，得到天然黑色素颗粒，颗粒尺寸范围200～400nm。
34.以具有良好的成膜性、粘结性、吸湿性及低生物毒性的聚乙烯吡咯烷酮为止血材料纤维基质。将聚乙烯吡咯烷酮溶于10ml的无水乙醇纺丝溶剂中(质量比为9％)，持续搅拌6h。将高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒溶于所制备的纺丝溶液中(高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒占聚乙烯吡咯烷酮的质量比为60％，高岭石纳米颗粒和天然黑色素颗粒的质量比为95％：5％)，然后，搅拌24h，得到均匀分散的高岭石-黑色素静电纺丝溶液。
35.结合静电纺丝技术，控制静电纺丝工艺参数为纺丝电压12kv，推料速度为0.002mm/min，环境湿度为25％，环境温度为37℃，制备得到高岭石-黑色素复合止血纤维材料。
36.对比例1
37.取10g高岭石原矿，溶于800ml的去离子水中(质量比1：80)，超声搅拌12h，进行抽滤。将抽滤得到的高岭石，重悬于100ml去离子水中，以3000rpm的转速进行离心分离，此步骤重复3次。将离心得到的沉淀物，在60℃的烘箱中烘12h，得到高岭石纳米颗粒，粒径尺寸
范围在300～600nm，记为kaolin。
38.对比例2
39.取商业购买的羽毛或发丝，用丙酮洗涤3次，去离子水洗涤3次，剪碎。得到的羽毛或发丝加入到40ml的磷酸缓冲液中(ph＝6.8)，加入0.4g二硫苏糖醇(dtt)，混合均匀，在n2气氛下，37℃条件下振荡12h。加入1ml 20mg/ml的蛋白酶k和0.2g dtt，继续振荡12h。以8000rpm转速进行离心，去离子水洗涤3次，弃上清液，得到沉淀物。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中，重悬、振荡12h。离心，弃上清液，加入6ml磷酸缓冲液和0.12ml聚乙二醇辛基苯基醚，振荡6h，离心，依次用甲醇洗涤3次，去离子水洗涤3次。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中悬浮，37℃条件下振荡12h，此操作重复2次。酶解反应完全之后，在37℃条件下静置12h，离心，弃上清液，去离子水洗涤3次，50℃烘干，得到天然黑色素颗粒，颗粒尺寸范围200～400nm，记为mgs。
40.对比例3
41.取10g高岭石原矿，溶于800ml的去离子水中(质量比1：80)，超声搅拌12h，进行抽滤。将抽滤得到的高岭石，重悬于100ml去离子水中，以3000rpm的转速进行离心分离，此步骤重复3次。将离心得到的沉淀物，在60℃的烘箱中烘12h，得到高岭石纳米颗粒，粒径尺寸范围在300～600nm。
42.取商业购买的羽毛或发丝，用丙酮洗涤3次，去离子水洗涤3次，剪碎。得到的羽毛或发丝加入到40ml的磷酸缓冲液中(ph＝6.8)，加入0.4g二硫苏糖醇(dtt)，混合均匀，在n2气氛下，37℃条件下振荡12h。加入1ml 20mg/ml的蛋白酶k和0.2g dtt，继续振荡12h。以8000rpm转速进行离心，去离子水洗涤3次，弃上清液，得到沉淀物。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中，重悬、振荡12h。离心，弃上清液，加入6ml磷酸缓冲液和0.12ml聚乙二醇辛基苯基醚，振荡6h，离心，依次用甲醇洗涤3次，去离子水洗涤3次。得到的沉淀物与0.4ml蛋白酶k、32mg dtt加入16ml的磷酸缓冲液中悬浮，37℃条件下振荡12h，此操作重复2次。酶解反应完全之后，在37℃条件下静置12h，离心，弃上清液，去离子水洗涤3次，50℃烘干，得到天然黑色素颗粒，颗粒尺寸范围200～400nm。
43.配制5ml的12mm的三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液，调节ph＝8，超声1h。将50mg天然黑色素颗粒加入溶液，水浴50℃下，磁力搅拌2h-超声分散10min，此操作重复3次，超声功率为100w，频率为40khz。将950mg高岭石纳米颗粒溶于5ml的去离子水中，水浴50℃下搅拌12h。将天然黑色素颗粒溶液与高岭石溶液等体积混合，在水浴50℃下，超声分散10min-磁力搅拌2h，此操作重复6次，超声功率为100w，频率为40khz。将得到的高岭石-黑色素复合溶液静置24h之后，在50℃的烘箱中干燥，得到质量比为95：5高岭石-黑色素复合止血粉末。
44.对比例4
45.将聚乙烯吡咯烷酮(pvp)溶于10ml的无水乙醇纺丝溶剂中(质量比为9％)，持续搅拌6h，得到均匀的静电纺丝溶液。控制静电纺丝工艺参数为纺丝电压12kv，推料速度为0.002mm/min，环境湿度为25％，环境温度为37℃，制备得到pvp纺丝纤维，记为pvpnfs。
46.以小鼠肝脏创面出血模型评估止血材料的止血性能，在小鼠肝脏表面用手术刀形成明显的创面出血，将相同量的实施例3制得的材料与对比例1-4制得的材料贴敷于创面表面进行止血性能评估。如图3所示，相较于对比例1的高岭石纳米颗粒(kaolin)和对比例2的天然黑色素颗粒(mgs)，对比例3制得的高岭石-黑色素复合粉末具有显著的统计学优势，止
血时间呈现明显的缩短，这说明高岭石与天然黑色素的结合能够产生协同的止血性能；而相对于对比例3的高岭石-黑色素复合粉末(kaolin-mgs)和对比例4的聚乙烯吡咯烷酮纤维(pvpnfs)，实施例3的高岭石-黑色素复合止血纤维材料(kaolin-mgs nfs)进一步呈现出显著的统计学优势，说明复合纤维基于静电纺丝纤维结构比复合粉末的止血效果更好，具有更短的止血时间。且与商用quikclot止血材料clotting gauze(clg)和combat gauze(cog)相比，kaolin-mgs nfs复合止血材料的止血时间同样呈现出显著地降低。总之，高岭石颗粒和天然黑色素颗粒均匀分散到静电纺丝制备的复合纤维kaolin-mgs nfs能够协同提高止血性能。