一种β-酪蛋白的人工优化与合成方法及其应用

一种
β-酪蛋白的人工优化与合成方法及其应用
技术领域
1.本技术涉及生物技术领域，具体地，涉及一种优化β-酪蛋白、编码该重组β-酪蛋白的基因、插入有该基因的重组表达载体、导入有该重组表达载体的转化体、制备该重组β-酪蛋白的方法以及一种人造乳。


背景技术：

2.目前，乳制品的需求量不断增加，天然动物奶及其乳制品是最理想的蛋白营养来源，其营养成分主要是乳蛋白，同时还含有生物活性肽、脂肪、乳糖、维生素和矿物质等。
3.但是，因含有各种致敏原，天然动物奶是婴幼儿群体中排在首位的致敏源食物。牛奶及其乳制品是fao和who认定的导致人类食物过敏的主要食品之一。目前，牛奶中已知的主要致敏原包括αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β乳球蛋白和β-酪蛋白等。
4.β-酪蛋白由226个氨基酸残基组成，分子量为25382da。β-酪蛋白含有大量的谷氨酰胺，此氨基酸序列是非常保守的，在n-末端附近形成了主要的磷酸化作用位点，β-酪蛋白磷酸化位点的数量和磷酸化水平比α-酪蛋白少。
5.β-酪蛋白广泛存在于哺乳动物(牛、牦牛、山羊、马、兔等)和人的乳汁中，是由乳腺腺泡上皮细胞合成的磷酸化蛋白质。β-酪蛋白在人初乳中的含量为0.26mg/100ml，在成熟乳中含量为0.3-0.5mg/100ml。
6.目前，野生型的β-酪蛋白仍然具有较高的致过敏性。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于降低β-酪蛋白的致过敏性。
8.本发明的发明人通过对β-酪蛋白的序列和晶体结构进行分析，基于多序列比对和系统发育分析，利用同源结构元件交叉重组策略对乳蛋白按功能域分割与创建重组蛋白文库，替换或消除致敏序列和表观位点，计算蛋白分子自由能稳定系数，完成乳蛋白进行理性设计与定向进化，实现基于应用属性的乳蛋白序列全局优化，得到了具有较低致过敏性的β-酪蛋白。
9.为了实现上述目的，本发明提供了一种重组β-酪蛋白，所述重组β-酪蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
10.本发明还提供了编码如上所述的重组β-酪蛋白的基因。
11.可选地，其中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
12.本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的重组β-酪蛋白的表达框。
13.可选地，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如seq id no.3所示。
14.本发明还提供了一种转化体，所述转化体导入有如上所述的重组表达载体。
15.可选地，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。
16.本发明还提供了一种制备如上所述重组β-酪蛋白的方法，该方法包括：将如上所
述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组β-酪蛋白。
17.可选地，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/l的蛋白胨、5-20g/l的酵母提取物、1-2g/l的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/l的生物素和2-10ml/l的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。
18.本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的优化β-酪蛋白。
19.通过上述技术方案，本发明得到了致敏性几乎消失的重组β-酪蛋白，可以用于制备具有更高应用价值的人造乳制品。
20.本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
21.附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
22.图1为β-酪蛋白致敏表位分析。a，β-酪蛋白的三级结构；b，β-酪蛋白的二级结构；c，β-酪蛋白致敏表位。
23.图2为乳蛋白表达载体的构建示意图。
24.图3为β-酪蛋白的表达纯化结果。m，标准分子量；1，β-酪蛋白；2，人工重组β-酪蛋白afcs2。
25.图4为重组优化β-酪蛋白的致敏性elisa检测分析结果。
26.序列表说明
27.seq id no.1，人工优化β-酪蛋白的氨基酸序列；
28.seq id no.2，人工优化β-酪蛋白的核酸序列；
29.seq id no.3，人工优化β-酪蛋白的重组表达载体核酸序列；
30.seq id no.4，人工优化κ-酪蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
31.以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
32.本发明提供了一种重组β-酪蛋白，所述重组β-酪蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。该重组β-酪蛋白具有低致敏性。
33.本发明还提供了编码如上所述的重组β-酪蛋白的基因。
34.可选地，其中，所述基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
35.本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的重组β-酪蛋白的表达框。
36.可选地，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如seq id no.3所示。
37.本发明还提供了一种转化体，所述转化体导入有如上所述的重组表达载体。
38.可选地，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。
39.本发明还提供了一种制备如上所述重组β-酪蛋白的方法，该方法包括：将如上所
述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组β-酪蛋白。
40.可选地，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/l的蛋白胨、5-20g/l的酵母提取物、1-2g/l的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/l的生物素和2-10ml/l的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。
41.本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的重组β-酪蛋白。
42.优选地，所述人造乳还含有seq id no.4所示的κ-酪蛋白。
43.以下通过实施例进一步详细说明本发明。实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。表达载体ppic9k-his：为淼灵生物公司市售产品；酵母表达菌株gs115：为淼灵生物公司市售产品。
44.实施例1乳蛋白致敏原的删除与结构优化
45.数据库获取牦牛、水牛、山羊、骆驼等不同物种β-酪蛋白序列。通过emini-surface probability方法进行分析乳蛋白的表面可及性；通过jameson-wolf的方法计算抗原指数氨基酸区域。
46.利用全序列比对法比较等致敏性乳蛋白与致敏原序列相似性，比对牦牛、水牛、山羊、骆驼β-酪蛋白的致敏原与构象性表位的结构基序组成与定位，获得β-酪蛋白致敏原的保守结构域。
47.结合分子生物学swissprot数据库中β-酪蛋白的晶体数据进行结构分析。基于多序列比对和系统发育分析，利用schema同源结构元件交叉重组策略对乳蛋白按功能域分割与创建重组蛋白文库，替换或消除致敏序列和表观位点，计算蛋白分子自由能稳定系数，完成乳蛋白进行理性设计与定向进化。
48.基于乳蛋白的性质特征，选择亲水性好、表面可及性和可塑性较高且抗原指数较高的区域作为dnastar预测的结构，所以通过dnastar protean软件预测高原牦牛β-酪蛋白(图1)的残基表位。研究结果显示，高原牦牛β-酪蛋白的抗原表位为1-15、5-69、80-92、107-120和185-209。利用同源结构交叉重组策略对乳蛋白进行优化，删除乳蛋白致敏性线性表位，完成人工优化β-酪蛋白(seq id no.1)的理性设计与定向进化，得到seq id no.1所示的重组β-酪蛋白。
49.实施例2优质β-酪蛋白在酵母中的高效生物合成
50.针对酵母细胞工厂表达特性对优化乳蛋白的dna编码序列进行密码子优化。利用化学合成法合成优化后乳蛋白编码基因af-cs2。
51.将人工优化的乳蛋白基因两端添加限制性内切酶ecori与noti序列连接酵母表达载体ppic9k-his多克隆位点中。将连接产物热激转化大肠杆菌感受态细胞并涂布含氨苄青霉素抗性的lb平板，筛选含有重组表达质粒的菌株。
52.利用限制性内切酶saci切割将验证正确的阳性重组表达载体，制备线性化质粒dna，电击转化毕赤酵母gs115中。利用遗传霉素抗性平板筛选阳性重组酵母菌株，并利用pcr进行鉴定。研究结果显示，成功构建了优化β-酪蛋白酵母表达菌株gs-afcs2。同样方法获得天然β-酪蛋白表达菌株。
53.挑取乳蛋白表达菌株至种子液培养基中，30℃培养20小时，以2％浓度转接与
100ml发酵培养基中，30℃转速220rpm摇瓶发酵72h，每隔24h补加一次甲醇。离心收集发酵上清液，利用人工乳蛋白的his-tag，ni-nta-resin纯化柱纯化乳蛋白，通过sds-page蛋白电泳检测靶标乳蛋白的表达情况。
54.本实施例中，利用化学合成法合成优化后乳蛋白编码基因af-cs2(序列如seq id no.2)。通过表达载体构建与酵母转化(图2)，成功构建优化的β-酪蛋白酵母表达菌株gs-cs2。通过摇瓶发酵诱导β-酪蛋白异源表达。研究结果显示，优化β-酪蛋白在胞外大量表达(图3)。
55.实施例3优化β-酪蛋白的elisa致敏性分析
56.用cbs溶液将乳蛋白样品稀释至5μg ml-1
，将每种样品100μl置于96孔板中，并在4℃下包被过夜。
57.用tween 20/pbs(pbs-t)洗涤4次后，添加350μl 5％脱脂奶粉，并在37℃下孵育1h。再次洗涤，然后添加bsa稀释的变应原血清(1：500)，并在室温下孵育3h。洗涤后，将100μl过氧化物酶标记的山羊抗人/大鼠ige抗体(1：5000)添加到孔中，然后在室温下孵育板1h。
58.用pbs-t洗涤5次并用pbs洗涤3次后，将200μl tmb溶液添加至孔中30分钟，然后使用50μl 2m h2so4终止反应。
59.用分光光度计在450nm下测量值。对非过敏性血清进行相同的步骤，以确定非特异性结合的程度，将其从测试血清数据中减去。对每个样品进行三个平行实验，并将平均值作为最终数据。
60.通过elisa体外免疫实验对构建表达的人工优化乳蛋白进行致敏性表征。利用β-酪蛋白抗体血清对野生型乳蛋白与人工优化β-酪蛋白进行致敏性分析。研究结果显示，天然β-酪蛋白具有强的ige结合能力，而经过结构序列人工优化β-酪蛋白的结合能力显著降低(图4)。人工优化β-酪蛋白af-cs2的ige结合能力降低了95％，蛋白致敏性几近消失。研究结果显示，人工优化β-酪蛋白成功地降低了变应原性。
61.本发明利用合成生物学方法人工设计构建了无致敏性和低致敏性的优化β-酪蛋白，提高乳蛋白的应用性能，实现靶标乳蛋白全局优化与生物合成，能够用于食品、保健品、医疗、饲料及蛋白产品等领域。
62.以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
63.另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
64.此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。