一种细胞捕获装置及其加工方法与流程

1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种细胞捕获装置及其加工方法。


背景技术：

2.单细胞研究对生物学和医学有着重要的意义，为细胞的功能、细胞间相互作用和细胞对外源性刺激的反应提供更多的细节和原理，如何以可控和可复现的方式在三维开放微环境中捕获细胞，是实现高效、高通量地进行单细胞分析的基础。
3.其中细胞诱捕在许多创新性生物实验中都是至关重要的一步，如电穿孔转染、膜片钳技术、药物注射及荧光显微复制等技术。微流控装置成为细胞捕获和分选的主要手段，细胞流入微通道，通过一个分拣区，最后被引导到不同的通道进行收集或处理。基于荧光，磁力，流体力学流，声电泳和介电电泳等多种分类策略已在微流控平台上实现。在更小的体积和细胞数量下，仍然能够进行高通量分析。sl gac等人通过将单个细胞困在微流控装置中微米级大小的结构中，随后在单细胞水平下进行电穿孔转染(gac s l,berg a.single cell electroporation using microfluidic devices[j].methods in molecular biology,2012,853:65.)。mengsu yang等人精细加工堰型过滤器将单细胞固定在装置上，并以可控数量固定在所需位置(yang m,li c w,yang j.cell docking and on-chip monitoring of cellular reactions with a controlled concentration gradient on a microfluidic device.[j].analytical chemistry,2002,74(16):3991-4001.)。这些捕获器的一个共同特征是细胞在一个相对封闭的环境中被诱捕，这可能会影响细胞的生化性质。
[0004]
其他各式各样的细胞诱捕装置在上述的基础上不断改善和发展。现有的细胞诱捕装置基于流体动力原理和微通道结构。一方面这都是在相对封闭环境下完成细胞的捕获和固定，不利于进行后续的寻址观测和分析。另一方面微通道的存在也容易发生堵塞造成器件的失效。


技术实现要素：

[0005]
本发明针对细胞诱捕中的关键器件——细胞捕获装置，采用微纳加工工艺，实现在三维开放微环境中捕获细胞。标记符和透明基底十分有利于后续的寻址观测和分析，同时提供的微纳加工工艺能以低成本实现大批量精细加工。为单细胞研究提供高效、高通量的有力手段。
[0006]
本发明至少通过如下技术方案之一实现。
[0007]
一种细胞捕获装置，包括透明基底和金字塔形捕获结构，所述透明基底上设置有数字标识符和金字塔形捕获结构，所述数字标识符对应各个金字塔形捕获结构，辅助细胞定位观察。
[0008]
所述金字塔形捕获结构由纳米线金字塔和底部的中空圆柱组成，纳米线金字塔整体呈四面体结构，面面镂空，仅保留边缘的纳米线，圆柱形中空结构位于纳米线金字塔下
方，实现对已捕获细胞的限位。
[0009]
优选地，所述透明基底呈扁平长方体状，材料为硅硼酸玻璃，聚苯乙烯，透明陶瓷等一种或多种。采用透明基底方便后续在对捕获的细胞在倒置显微镜进行观察。
[0010]
优选地，所述数字标识符的位于透明基底上，定位各个金字塔形捕获结构，可挖空材料或者沉积材料实现标识符精细加工。标识符可为数字，字母，符号的一种或多种。通过数字标识符可以对捕获细胞单元进行快速寻址和观察，有利于实验操作和连续观察。
[0011]
优选地，所述纳米线金字塔整体呈四面体结构，面面镂空与环境相接触，仅保留边缘的纳米线，纳米线材料为si3n4。纳米线金字塔结构一方面起到固定细胞的作用，另一方面在，既能很好的保持细胞的三维形态
[0012]
优选地，所述金字塔形捕获结构的位于透明基底上的键合层，键合层材料为富硅氮化硅。在对应纳米线金字塔下方有一圆柱形中空结构。提供陷阱
[0013]
优选地，所述金字塔形捕获结构的尺寸为亚微米到微米量级，由具体需要捕获的细胞确定。
[0014]
优选地，可对上述金字塔形捕获结构和数字标识符进行阵列化精细加工，进行大规模捕获并研究单个细胞。
[0015]
本发明还提供一种精细加工细胞捕获装置的方法，包括如下步骤：
[0016]
1)清洗硅基底，在硅基底上lpcvd沉积sirn层，采用光刻完成数字标识符的精细加工；
[0017]
2)采用光刻精细加工刻蚀孔径，并以sirn层为掩膜采用腐蚀的方法精细加工倒金字塔凹槽；
[0018]
3)采用lpcvd共形沉积si3n4层；
[0019]
4)采用腐蚀的方法各向同性腐蚀，只留下纳米线在倒金字塔凹槽尖端。完成四面镂空的纳米线金字塔结构精细加工。
[0020]
5)清洗透明玻璃基底，并抛光至光学级；
[0021]
6)在纳博热专业用箱式炉完成透明玻璃基底和金字塔形捕获结构的键合；
[0022]
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
[0023]
(1)本发明细胞捕获装置是在普通硅片上进行图案转移，与现有微纳加工工艺兼容，有效降低生产成本和工艺复杂度，提高装置生产效率和工艺可靠性。
[0024]
(2)本发明细胞捕获装置中金字塔形捕获结构能在三维开放微环境中捕获细胞，既能很好的保持细胞的三维形态，也不担心传统微流控装置微通道堵塞的问题。
[0025]
(3)本发明细胞捕获装置可阵列化精细加工，完成大规模捕获细胞，同时标记符和透明基底也十分有利于后续的寻址观测和分析，实现高效、高通量的单细胞研究。
附图说明
[0026]
图1为本发明细胞捕获装置的结构示意图；
[0027]
图2a本发明采用光刻工艺将标识符的图案转移到光刻胶效果图；
[0028]
图2b本发明去除光刻胶完成光刻胶清洗工艺效果图；
[0029]
图2c本发明去除标识符填充区域以外的si3n4层效果图；
[0030]
图2d本发明采用厚胶工艺沉积标识符效果图；
[0031]
图2e本发明光刻胶清洗工艺效果图；
[0032]
图2f本发明金字塔形凹槽剖面图；
[0033]
图2g本发明采用lpcvd共形沉积工艺后效果剖面图；
[0034]
图2h本发明倒金字塔尖端剖面结构图；
[0035]
图2i本发明结构图键合过程的结构图；
[0036]
图2j本发明细胞捕获装置结构图；
[0037]
图3为本发明细胞捕获装置的捕获细胞示意图。
具体实施方式
[0038]
以下结合附图对本发明的具体实施作进一步说明。为表达的更简洁清晰，在下列描述当中，不详细描述公知的功能和结构，以凸显本发明的优势和特征。
[0039]
实施例1
[0040]
如图1所示，本实施例提供一种细胞捕获装置，透明基底1和金字塔形捕获结构2。
[0041]
所述透明基底1呈扁平长方体状，透明基底1上精细加工有标识符3和金字塔形捕获结构2，标识符3对应各个金字塔形捕获结构2，辅助细胞定位观察。金字塔形捕获结构2包括纳米线金字塔和底部的中空圆柱4；纳米线金字塔整体呈四面体结构，面面镂空，圆柱形中空结构2位于纳米线金字塔下方，实现对已捕获细胞的限位。
[0042]
本实施例中，所述透明基底1呈扁平长方体状，材料为硅硼酸玻璃、聚苯乙烯、透明陶瓷等一种或多种。
[0043]
本实施例中，所述标识符3的位于透明基底1上，定位各个金字塔形捕获结构2，通过刻蚀材料完成标识符精细加工。
[0044]
本实施例中，所述纳米线金字塔整体呈四面体结构，面面镂空与环境相接触，仅保留边缘的纳米线，纳米线材料为si3n4。
[0045]
本实施例中，所述金字塔形捕获结构2的位于透明基底1上的键合层，键合层材料为富硅氮化硅。在对应纳米线金字塔下方有一圆柱形中空结构4。
[0046]
本实施例中，所述金字塔形捕获结构的尺寸为亚微米到微米量级，由具体需要捕获的细胞确定。
[0047]
本实施例中，可对上述金字塔形捕获结构2和数字标识符3进行阵列化精细加工，进行大规模捕获并研究单个细胞。
[0048]
实施例2
[0049]
与实施例1基本相同，所不同的是：本实施例提供一种精细加工实施例1所提供的细胞捕获装置的精细加工方法。
[0050]
如图2a-2j所示，一种细胞捕获装置的精细加工方法，步骤如下：
[0051]
首先清洗晶向为《100》的硅基100，氮气吹干后，采用低压化学气相沉积(low-pressure chemical vapor deposition，lpcvd)沉积一层500nm的富硅氮化硅(silicon-rich silicon nitride layer，sirn)110(即键合层)。并采用光刻工艺将标识符的图案转移到光刻胶120上，如图2a；
[0052]
以光刻胶120为掩膜将采用电感耦合等离子体发射光谱仪(inductive coupled plasma emission spectrometer,icp)刻蚀工艺将标识符图案转移到sirn层110，完成后将
样品依次浸入85℃去胶液20min(分钟)、清洗丙酮超声10min和异丙醇30sec(秒)，大量去离子水清洗后氮气吹干去除光刻胶完成光刻胶清洗工艺，如图2b；
[0053]
随后采用等离子体增强化学气相淀积(plasma enhanced chemical vapor deposition，pecvd)设备在清洗后的样品中沉积600nm的标识符填充si3n4层111，沉积完成后采用icp刻蚀工艺将si3n4层111的整体过刻蚀约200nm，过刻蚀去除标识符填充区域以外的si3n4层111，如图2c；去除后，采用厚胶工艺沉积约8um光刻胶120，如图2d所示；
[0054]
采用光刻工艺将开窗图形转移到光刻胶120处，以光刻胶120为掩膜对sirn层110进行开窗暴露出底部硅基100，随后进行光刻胶清洗工艺，如图2e所示；
[0055]
对清洗后的样品进行氧离子清洗工艺去除残余掩膜和质量分数1％的氢氟酸hf溶液25℃浸泡3min去除表面钝化层。之后，以sirn层110为掩膜,koh溶液(25wt％,75℃)腐蚀出倒金字塔形凹槽，其剖面结构，如图2f；
[0056]
随后在上述结构表面采用lpcvd共形沉积800nm的si3n4层111，其剖面结构，如图2g；
[0057]
采用质量分数50％的氢氟酸hf溶液25℃浸泡完成si3n4层111各向同性腐蚀，只留下纳米线在倒金字塔尖端，同时暴露标识符。其剖面结构如图2h；
[0058]
清洗透明玻璃基底130，并抛光至光学级，将清洗后的透明玻璃基底130置于上述装置表面。在纳博热专业用箱式炉在790℃ 30min完成透明玻璃基底130和上述装置的键合，其剖面结构，如图2i；
[0059]
最后，将已键合样品置入tmah溶液(5％浓度，75℃)中腐蚀硅基衬底100实现金字塔捕获结构的释放，即制得细胞捕获装置，如图2j；
[0060]
如上即可较好完成所述细胞捕获装置。
[0061]
实施例3
[0062]
与实施例1基本相同，所不同的是：本实施例提供一种实施例1所提供的细胞捕获装置的使用方法。
[0063]
首先，对细胞捕获装置、培养皿、移液枪等操作器件进行消毒和清洗。氮气吹干后，置于洁净的生物安全柜中，以下操作均在生物安全柜中无菌操作。
[0064]
随后，从二氧化碳培养箱中取出含细胞的培养瓶，采用移液枪吸出培养瓶中的培养基。对生长在培养瓶中的细胞加入磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered saline，pbs)进行润洗。
[0065]
向培养瓶中加入2～3ml含的胰蛋白酶溶液，使胰酶溶液覆盖细胞。并在显微镜中观察细胞形态。当贴壁细胞间间隙变大、细胞趋于圆形但还未漂起时移除胰蛋白酶溶液。随后用吸管小心吹打贴壁的细胞，制成细胞悬液。
[0066]
将细胞捕获装置置于空白培养皿中，将细胞悬浮液沿同一个方向慢慢向培养皿中倾倒，使悬浮细胞5在流体力和重力的作用下被细胞捕获装置捕获，如图3所示。
[0067]
细胞捕获装置与商用荧光倒置显微镜系统配合使用，可实现细胞位置和状态的实时监测。
[0068]
以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明
的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。