一种大肠杆菌戊二胺响应启动子及应用

1.本发明属于菌株代谢改造领域，具体涉及一种大肠杆菌戊二胺响应启动子及应用。


背景技术：

[0002] 1,5-戊二胺(1,5-diaminopentane) ，即尸胺(cadaverine)，又称为1,5-二氨基戊烷，是一种普遍存在于生物体内的生物胺。1,5-戊二胺在工业、农业和医药领域上有着广泛的应用。在工业上，1,5-戊二胺可与二元酸反应合成生物基高分子材料聚酰胺（俗称尼龙，pa）；在农业上，可用于植物生长代谢的调节，果实质量和产量的提升；在医学上，可用于治疗痢疾的药物中。目前，聚酰胺在全球范围的需求量与日俱增。除了传统的化学合成1,5-戊二胺，生物法制备也日渐成熟，逐渐取代化学合成法，成为1,5-戊二胺合成的主流方法。其中，生物法主要分为生物催化法和细胞发酵法。催化法主要以l-赖氨酸为原料，通过赖氨酸脱羧酶脱羧生成1,5-戊二胺。但需要昂贵的辅酶且重复利用率低下。相较而言，发酵法具备条件温和，原料多样，生产成本低过程可控等优点。但1,5戊二胺对宿主菌具有毒性，导致细胞生产效率低下。
[0003]
随着合成生物学的发展，大肠杆菌可作为模式工业菌株，进行大宗化学品的生产，其中就包括了1,5-戊二胺。但是1,5-戊二胺本身的物化性质，碱性，微毒，使大肠杆菌难以在高浓度的戊二胺中进行正常的生理活动。需要开发启动子满足生产需要。


技术实现要素：

[0004]
针对现有技术的不足，本发明提供了一种大肠杆菌戊二胺响应启动子及应用，通过挖掘大肠杆菌内源性戊二胺响应启动子并对关键基因进行调控，使戊二胺的产量得到进一步的提升达到14.1g/l。
[0005]
为解决现有技术问题，本发明采取的技术方案：一种大肠杆菌戊二胺响应启动子，所述启动子的核苷酸序列如seq id no.7所示。
[0006]
一种重组质粒pcadr-pgrca-gfp，含有上述的大肠杆菌戊二胺响应启动子的核苷酸的质粒。
[0007]
上述重组质粒pcadr-pgrca-gfp构建的重组质粒pcadr-pgrca-pyc-trc-cada-rrnb构建方法，包括以下步骤：构建戊二胺响应启动子筛选质粒pcadr-gfp，所用引物中pet28a和ptrc99a的引物带有ncoi和xhoi酶切位点，通过同源重组获得pcadr-gfp；筛选大肠杆菌内源性戊二胺响应启动子pgrca，合成的pgrca启动子上游引物带有bglii酶切位点，下游引物带有xbai酶切位点，通过酶切链接获得pcadr-pgrca-gfp；筛选出的响应启动子pgrca用于调控谷氨酸棒状杆菌的基因丙酮酸羧化酶pyc，并将赖氨酸脱羧酶cada构建在同一质粒上构建重组质粒pcadr-pgrca-pyc-trc-cada-rrnb；使用引物扩增丙酮酸羧化酶pyc和赖氨酸脱羧酶cada，通过同源重组成功构建pcadr-pgrca-pyc-trc-cada-rrnb，将重组质粒导入克隆载体trans1-t1，经过lb平板初筛后，选取平板上生长的单菌落进行pcr验证，再
将阳性菌株送测。
[0008]
一种重组菌株ka30-pcadr-pgrca-pyc-trc-cada-rrnb，表达上述的重组质粒pcadr-pgrca-pyc-trc-cada-rrnb的赖氨酸高产大肠杆菌ka30。
[0009]
上述重组菌株ka30-pcadr-pgrca-pyc-trc-cada-rrnb在合成戊二胺上的应用。
[0010]
有益效果：与现有技术相比，本发明一种大肠杆菌戊二胺响应启动子及应用，通过挖掘大肠杆菌内源性戊二胺响应启动子并对关键基因进行调控，使戊二胺的产量得到进一步的提升达到14.1g/l。
附图说明
[0011]
图1为本发明中hplc检测戊二胺的生成，其中，（a）为戊二胺标准品；（b）为实施例戊二胺的产量与对照组的对比情况。
[0012]
图2为重组蛋白表达情况。
具体实施方式
[0013]
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
[0014]
实施例中未提及到的技术均为本领域常规技术，另外，使用的大肠杆菌trans1-t1、pet28a,ptrc99a等材料都是商业化产品，可直接购买。
[0015]
实施例中所述的葡萄糖，戊二胺的浓度均指的是该体系中的终浓度。
[0016]
戊二胺测定方法：agilentymccarotenoid色谱柱，流动相为5%乙腈和0.5%三氟乙酸；流速0.8ml
·
min-1
；示差检测器。
[0017]
实施例1pcadr-gfp启动子筛选质粒的构建以质粒pet28a和质粒ptrc99a分别为模板进行pcr扩增，所用pet28a为模板:上游引物带有酶切位点ncoi，序列如seqidno.1：gacggagctcgaattttactctttatcacccagcagtacggat；下游引物带有酶切位点xhoi，序列如seqidno.2：aggagatataccatgatggccaccccacacat；所用ptrc99a为模板上游引物带有酶切位点ncoi，序列如seqidno.3所示：catgccatggaattcgagctcgg下游引物带有酶切位点xhoi，序列如seqidno.4所示：ccgctcgagaaaaggccatccgtcag。
[0018]
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃10s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将回收的片段用takara公司的ncoi和xhoi酶切，酶切反应体系为：10
×
buffer1μl，ncoi1μl，xhoi1μl，两种回收片段各7μl。酶切体系于37℃条件下反应1小时。两片段有相同的黏性末端，通过t4连接酶链
接构成重组质粒，反应体系为：takara公司的t4ligase1μl，10
×
t4dnaligasebuffer1μl,两种片段各4μl。反应体系25℃反应1小时。将连接产物转化到大肠杆菌trans1-t1中，pcr筛选阳性菌株进行dna测序验证，验证pcadr-gfp启动子筛选质粒的构建正确。
[0019]
在pcadr-gfp启动子筛选质粒上插入gfp荧光蛋白作为报告基因用于启动子筛选。gfp基因可合成，作为模板进行pcr扩增。其序列如下：seqidno.5atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa对合成的gfp基因为模板进行pcr所用上游引物序列如seqidno.6：atggtgagcaagggcgag所用下游引物为序列如seqidno.7:tacttgtacagctcgtccatgcc反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃10s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。同时对pcadr-gfp分别用takara公司的限制性内切酶sali和ncoi酶切，酶切反应体系为：10
×
buffer1μl，ncoi1μl，sali1μl，回收片段7μl。将回收的gfp基因和pcadr-gfp用t4连接酶连接，反应体系为：takara公司的t4ligase1μl，10
×
t4dnaligasebuffer1μl,两种片段各4μl。反应体系25℃反应1小时。将连接产物转化到大肠杆菌trans1-t1中，pcr筛选阳性菌株pcadr-gf进行dna测序验证实施例2pcadr-pgrca-gfp质粒的构建通过转录组分析大肠杆菌对戊二胺做出响应的基因，转录分析方法和结果可见：wangx,guox,wangj,etal.amelioratingend-productinhibitiontoimprovecadaverineproductioninengineeredescherichiacolianditsapplicationinthesynthesisofbio-baseddiisocyanates[j].syntheticandsystemsbiotechnology,2021,6(4):243-253.，得到确认启动子，戊二胺下调启动子pgrca的核苷酸序列如seqidno.8所示：ttgcgaccatacttgatgtgtggtttttattgatttaaatcaaagattcaagggtgtttgaggagtatatatacactcaagcaacaatggttttaccaattggccgcgacaggctgaacaaatcaaataattttgccggggaggcatcac以大肠杆菌trans1-t1的基因组为模板，以启动子上下游序列为引物。
[0020]
所用上游引物带有酶切位点xbai，序列如seqidno.9所示：agatctttgcgaccatacttgatgt。
[0021]
下游引物带有酶切位点bglii，序列如seqidno.10所示：tctagagtgatgcctccccggc。
[0022]
反应条件为：95℃2min，95℃20s，55℃20s，72℃10s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将回收的片段及上述构建的重组质粒pcadr-gfp分别用takara公司的限制性内切酶xbai和bglii酶切，酶切反应体系为：10
×
buffer1μl，xbai1μl，bglii1μl，回收片段7μl。将回收的启动子和pcadr-gfp启动子筛选质粒用t4连接酶连接，反应体系为：takara公司的t4ligase1μl，10
×
t4dnaligasebuffer1μl,两种片段各4μl。反应体系25℃反应1小时。将连接产物转化到大肠杆菌trans1-t1中，pcr筛选阳性菌株进行dna测序验证，验证重组质粒pcadr-pgrca-gfp构建正确。
[0023]
实施例3响应启动子pgrca的表征将实施例2的阳性菌株接种含不同戊二胺浓度的lb液体培养基于96孔板，lb液体培养基组成为：蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、氯化钠5g/l，其中含戊二胺的浓度分别为0g/l、10g/l、20g/l、30g/l、40g/l，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜。12小时后测量菌体的生物量（od
600
）和荧光值(gfp)，并计算gfp/od
600
,筛选出对戊二胺响应较好的启动子pgrca。
[0024]
实施例4trans1-pcadr-pgrca-pyc表达菌株的构建以具有丙酮酸羧化酶（pyc）的谷氨酸棒状杆菌（该菌可购于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号atcc13032）的基因组（如seqno.12所示）为模板，通过常规pcr扩增丙酮酸羧化酶的核苷酸的序列。
[0025]
所用上游引物带有同源臂，序列如seqidno.11所示：catcgccaccgtgtcgattcacacatcttcaacg下游引物带有同源臂，序列如seqidno.12所示：gcaggtcgacttaggaaacgacgacgatcaagtc反应条件为：95℃2min，95℃15s，55℃20s，72℃210s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。
[0026]
将pcadr-pgrca-gfp质粒中gfp基因删除，所需pcr引物如下所用上游引物带有同源臂，序列如为seqidno.13所示：gagtcgacacggtggcgatggatccg下游引物带有同源臂，序列如为seqidno.14所示：cgtttcctaaagttggctgctgccac反应条件为：95℃2min，95℃15s，55℃20s，72℃210s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将上述pcr扩增得到的两个片段通过同源臂进行同源重组获得重组质粒，重组反应体系为：使用vazyme公司的5xceiibuffer4μl，exnaseii2μl，两个基本片段各7μl。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化大肠杆菌trans1-t1。pcr筛选阳性菌株trans1-pcadr-pgrca-pyc并进行dna测序，验证重组质粒pcadr-pgrca-pyc构建正确。
[0027]
谷氨酸棒状杆菌来源的合成丙酮酸羧化酶基因pyc的核苷酸序列seq id no.15gtgtcgactcacacatcttcaacgcttccagcattcaaaaagatcttggtagcaaaccgcggcgaaatcgcggtccgtgctttccgtgcagcactcgaaaccggtgcagccacggtagctatttacccccgtgaagatcggggatcattccaccgctcttttgcttctgaagctgtccgcattggtaccgaaggctcaccagtcaaggcgtacctggacatcgatgaaattatcggtgcagctaaaaaagttaaagcagatgccatttacccgggatacggcttcctgtctgaaaatgcccagcttgcccgcgagtgtgcggaaaacggcattacttttattggcccaaccccagaggttcttgatctcaccggtgataagtctcgcgcggtaaccgccgcgaagaaggctggtctgccagttttggcggaatccaccccgagcaaaaacatcgatgagatcgttaaaagcgctgaaggccagacttaccccatctttgtgaaggcagttgccggtggtggcggacgcggtatgcgttttgttgcttcacctgatgagcttcgcaaattagcaacagaagcatctcgtgaagctgaagcggctttcggcgatggcgcggtatatgtcgaacgtgctgtgattaaccctcagcatattgaagtgcagatccttggcgatcacactggagaagttgtacacctttatgaacgtgactgctcactgcagcgtcgtcaccaaaaagttgtcgaaattgcgccagcacagcatttggatccagaactgcgtgatcgcatttgtgcggatgcagtaaagttctgccgctccattggttaccagggcgcgggaaccgtggaattcttggtcgatgaaaagggcaaccacgtcttcatcgaaatgaacccacgtatccaggttgagcacaccgtgactgaagaagtcaccgaggtggacctggtgaaggcgcagatgcgcttggctgctggtgcaaccttgaaggaattgggtctgacccaagataagatcaagacccacggtgcagcactgcagtgccgcatcaccacggaagatccaaacaacggcttccgcccagataccggaactatcaccgcgtaccgctcaccaggcggagctggcgttcgtcttgacggtgcagctcagctcggtggcgaaatcaccgcacactttgactccatgctggtgaaaatgacctgccgtggttccgactttgaaactgctgttgctcgtgcacagcgcgcgttggctgagttcaccgtgtctggtgttgcaaccaacattggtttcttgcgtgcgttgctgcgggaagaggacttcacttccaagcgcatcgccaccggattcattgccgatcacccgcacctccttcaggctccacctgctgatgatgagcagggacgcatcctggattacttggcagatgtcaccgtgaacaagcctcatggtgtgcgtccaaaggatgttgcagctcctatcgataagctgcctaacatcaaggatctgccactgccacgcggttcccgtgaccgcctgaagcagcttggcccagccgcgtttgctcgtgatctccgtgagcaggacgcactggcagttactgataccaccttccgcgatgcacaccagtctttgcttgcgacccgagtccgctcattcgcactgaagcctgcggcagaggccgtcgcaaagctgactcctgagcttttgtccgtggaggcctggggcggcgcgacctacgatgtggcgatgcgtttcctctttgaggatccgtgggacaggctcgacgagctgcgcgaggcgatgccgaatgtaaacattcagatgctgcttcgcggccgcaacaccgtgggatacaccccgtacccagactccgtctgccgcgcgtttgttaaggaagctgccagctccggcgtggacatcttccgcatcttcgacgcgcttaacgacgtctcccagatgcgtccagcaatcgacgcagtcctggagaccaacaccgcggtagccgaggtggctatggcttattctggtgatctctctgatccaaatgaaaagctctacaccctggattactacctaaagatggcagaggagatcgtcaagtctggcgctcacatcttggccattaaggatatggctggtctgcttcgcccagctgcggtaaccaagctggtcaccgcactgcgccgtgaattcgatctgccagtgcacgtgcacacccacgacactgcgggtggccagctggcaacctactttgctgcagctcaagctggtgcagatgctgttgacggtgcttccgcaccactgtctggcaccacctcccagccatccctgtctgccattgttgctgcattcgcgcacacccgtcgcgataccggtttgagcctcgaggctgtttctgacctcgagccgtactgggaagcagtgcgcggactgtacctgccatttgagtctggaaccccaggcccaaccggtcgcgtctaccgccacgaaatcccaggcggacagttgtccaacctgcgtgcacaggccaccgcactgggccttgcggatcgtttcgaactcatcgaagacaactacgcagccgttaatgagatgctgggacgcccaaccaaggtcaccccatcctccaaggttgttggcgacctcgcactccacctcgttggtgcgggtgtggatccagcagactttgctgccgatccacaaaagtacgacatcccagactctgtcatcgcgttcctgcgcggcgagcttggtaaccctccaggtggctggccagagccactgcgcacccg
cgcactggaaggccgctccgaaggcaaggcacctctgacggaagttcctgaggaagagcaggcgcacctcgacgctgatgattccaaggaacgtcgcaatagcctcaaccgcctgctgttcccgaagccaaccgaagagttcctcgagcaccgtcgccgcttcggcaacacctctgcgctggatgatcgtgaattcttctacggcctggtcgaaggccgcgagactttgatccgcctgccagatgtgcgcaccccactgcttgttcgcctggatgcgatctctgagccagacgataagggtatgcgcaatgttgtggccaacgtcaacggccagatccgcccaatgcgtgtgcgtgaccgctccgttgagtctgtcaccgcaaccgcagaaaaggcagattcctccaacaagggccatgttgctgcaccattcgctggtgttgtcaccgtgactgttgctgaaggtgatgaggtcaaggctggagatgcagtcgcaatcatcgaggctatgaagatggaagcaacaatcactgcttctgttgacggcaaaatcgatcgcgttgtggttcctgctgcaacgaaggtggaaggtggcgacttgatcgtcgtcgtttcctaa实施例5构建bl21(de3)-pcadr-grca-pyc-trc-cada重组菌株从菌株ka30中获取赖氨酸脱羧酶cada，该菌株获取为：cn113817762a。以该基因为模板，通过常规pcr扩增赖氨酸脱羧酶（cada）所用上游引物带有同源臂，序列如seqidno.16所示：gctgctaacattgcgaccatacttgatgtgtg下游引物带有同源臂，序列如seqidno.17所示：gcagccaactttaggaaacgacgacgatcaagtc反应条件为：95℃2min，95℃15s，55℃20s，72℃180s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将载体质粒pcadr-pgrca-pyc通过pcr进行线性化,所用pcr引物如下:所用上游引物带有同源臂，序列如seqidno.18所示：atggtcgcaatgttagcagccggatctca所用下游引物带有同源臂，序列seqidno.19所示：cgtttcctaaagttggctgctgccac反应条件为：95℃2min，95℃15s，55℃20s，72℃360s，共30个循环；72℃5min。得到的序列经1%琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将目的片段和载体片段通过同源重组构成新的质粒。所用的同源重组体系如下：使用vazyme公司的5xceiibuffer4μl，exnaseii2μl，基因片段7μl，载体7μl。连接于37℃下反应1小时。将连接产物转化到trans1大肠杆菌中，pcr筛选阳性菌株trans1-pcadr-pgrca-pyc-trc-cada-rrnb并进行dna测序，验证重组质粒trans1-pcadr-pgrca-pyc-trc-cada-rrnb构建正确。将重组菌株在lb/kan5ml培养基中过夜培养，使用天根质粒小提试剂盒提取质粒转化到bl21(de3)中，构建bl21(de3)-pcadr-pgrca-pyc-trc-cada重组菌株。
[0028]
合成赖氨酸脱羧酶基因cada的核酸序列，序列如seqidno.20所示：atgaacgttattgcaatattgaatcacatgggggtttattttaaagaagaacccatccgtgaacttcatcgcgcgcttgaacgtctgaacttccagattgtttacccgaacgaccgtgacgacttattaaaactgatcgaaaacaatgcgcgtctgtgcggcgttatttttgactgggataaatataatctcgagctgtgcgaagaaattagcaaaatgaacgagaacctgccgttgtacgcgttcgctaatacgtattccactctcgatgtaagcctgaatgacctgcgtttacagattagcttctttgaatatgcgctgggtgctgctgaagatattgctaataagatcaagcagaccactgacgaatatatcaacactattctgcctccgctgactaaagcactgtttaaatatgttcgtgaaggtaaatatactttctgtactcctggtcacatgggcggtactgcattccagaaaagcccggtaggtagcctgttctatgatttctttggtccgaataccatgaaa
tctgatatttccatttcagtatctgaactgggttctctgctggatcacagtggtccacacaaagaagcagaacagtatatcgctcgcgtctttaacgcagaccgcagctacatggtgaccaacggtacttccactgcgaacaaaattgttggtatgtactctgctccggcaggcagcaccattctgattgaccgtaactgccacaaatcgctgacccacctgatgatgatgagcgatgttacgccaatctatttccgcccgacccgtaacgcttacggtattcttggtggtatcccacagagtgaattccagcacgctaccattgctaagcgcgtgaaagaaacaccaaacgcaacctggccggtacatgctgtaattaccaactctacctatgatggtctgctgtacaacaccgacttcatcaagaaaacactggatgtgaaatccatccactttgactccgcgtgggtgccttacaccaacttctcaccgatttacgaaggtaaatgcggtatgagcggtggccgtgtagaagggaaagtgatttacgaaacccagtccactcacaaactgctggcggcgttctctcaggcttccatgatccacgttaaaggtgacgtaaacgaagaaacctttaacgaagcctacatgatgcacaccaccacttctccgcactacggtatcgtggcgtccactgaaaccgctgcggcgatgatgaagggtaatgctggtaagcgtctgatcaacggttccattgaacgtgcgatcaaattccgtaaagagatcaaacgtctgagaacggaatctgatggctggttctttgatgtttggcagccggatcatatcgatacgactgaatgctggccgctgcgttctgacagcacctggcacggcttcaaaaacatcgataacgagcacatgtatcttgacccgatcaaagtcaccctgctgactccggggatggaaaaagacggcaccatgagcgactttggtattccggccagcatcgtggcgaaatacctcgacgaacatggcatcgttgttgagaaaaccggtccgtataacctgctgttcctgttcagcatcggtatcgataagaccaaagcactgagcctgctgcgtgctctgactgacttcaaacgtgcgttcgacctgaacctgcgtgtgaaaaacatgctgccgtctctgtatcgtgaagatcctgaattctatgaaaacatgcgtattcaggaactggctcaaaatatccacaaactgattgttcaccacaatctgccggatctgatgtatcgcgcatttgaagtgctgccgacgatggtaatgactccgtatgctgcgttccagaaagagctgcacggtatgaccgaagaagtttacctcgacgaaatggtaggtcgtattaacgccaatatgatccttccgtatccgccgggagttcctctggtaatgccgggtgaaatgatcaccgaagaaagccgtccggttctggagttcctgcagatgctgtgtgaaatcggcgctcactatccgggctttgaaaccgatattcacggtgcataccgtcaggctgatggccgctataccgttaaggtatt实施例6 丙酮酸羧化酶和赖氨酸脱羧酶的表达将得到的bl21(de3)-pcadr-pgrca-pyc-trc-cada重组菌株在500ml锥形瓶装液量100ml的lb培养基中37℃，200rpm培养，当od
600
达到0.4-0.6时，添加1
‰
iptg诱导,诱导温度为18℃，培养24小时后收菌超声破碎，将破碎后的菌液离心上清和沉淀分离，对上清和沉淀跑蛋白胶验证（图2）。
[0029]
实施例7 重组质粒pcadr-pgrca-pyc-trc-cada导入赖氨酸高产的大肠杆菌菌株ka30,该菌株获得来源：cn113817762a使用天根质粒小提试剂盒提取上述实施例5中的重组菌株的质粒，将提取出来的重组质粒导入赖氨酸高产的大肠杆菌的感受态中进行发酵验证ka30-pcadr-pgrca-pyc-trc-cada。
[0030]
大肠杆菌感受态制备的方法：在lb平板上，挑取单菌落，然后接入摇管（lb培养基），温度37℃，200rpm,培养10-12h。按以1%的接种量转接到500 ml摇瓶lb的液体培养基中，装液量为50ml,温度37 ℃,200rmp进行培养。待菌液光密度值od 600生长至0.4-0.5，将摇瓶放到冰上冰浴20 min（停止生长活动）后，在已预冷的离心机中，4 ℃下，4000 rpm，离心10 min，去除上清后收集菌体。用10 ml 0.1mol/l预冷(4℃)的cacl2（包含20%甘油）溶液重悬菌体，放置于冰上静置15 min，4 ℃下，4000 rpm，离心10 min（该步骤重复两次）。去除上清，最后添加1 ml提前放置冰箱预冷的含15%甘油的0.1 mol
·
l-1
cacl2溶液悬浮细胞，冰上放置5 min后，即制成了感
受态细胞悬液，分装成80μl/管的小份-80℃保存。
[0031]
实施例8重组大肠杆菌ka30-pcadr-pgrca-pyc-trc-cada一步法发酵产戊二胺的发酵验证将重组大肠杆菌在50ml离心管中接入5ml种子培养基（种子培养基的配方表1所示），并富集培养至od
600
为0.8，将富集的种子培养基接入30ml的发酵培养基（发酵培养基的配方如表2所示）中,接入初糖20g/l，当od
600
为0.6时，加入诱导剂iptg诱导赖氨酸脱羧酶的表达，分别在发酵24h和48h取样,测残糖含量和戊二胺产量，直到残糖耗完发酵结束。
[0032]
表1种子液的液体培养基的配方表2发酵液的液体培养基的配方本发明通过对大肠杆菌内源性戊二胺响应启动子的挖掘，获得戊二胺响应启动子pgrca并用于关键基因的表达调控，使大肠杆菌发酵产戊二胺的产量得到进一步的提升达
到14.1g/l，具有良好的市场前景。