一种PoSaVGIII型毒株全基因组扩增引物及其扩增方法

一种posav giii型毒株全基因组扩增引物及其扩增方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种posav giii型毒株全基因组扩增引物及其扩增方法。


背景技术：

2.札幌病毒(sapovirus，sav)又称扎如病毒，属于杯状病毒科，札幌病毒属，被认为是世界范围内引起急性胃肠炎的病毒性病原之一，最初于1977年在日本札幌市一所婴儿室内发现。1980年，美国研究人员用电子显微镜观察一头27日龄哺乳猪的腹泻肠道内容物，鉴定出了第一株猪札幌病毒(porcine sapovirus，posav)，被命名为cowden毒株，2008年张文等首次在国内暴发仔猪腹泻猪群中检测出posav，2009年黄泽斌等调查显示该病毒在我国湖南省和广东省猪群中已存在，但该病在云南猪群中的流行情况未见报道。
3.sav基于衣壳蛋白vp1的基因序列将札幌病毒分为5个基因型，即基因型gⅰ～
ⅴ
，其中gⅰ、gⅱ、gⅳ和g
ⅴ
能引起人感染，gⅲ能感染猪。最新报道将基因型分为19个。posav最初在四十多年前的混合感染病例中被发现，且被归类为giii成员。几乎所有的posav基因型都在亚洲，欧洲和北美传播，posav诊断和控制变得日趋复杂。该病防控主要依靠综合性措施，猪群中消除或阻止小猪的自然感染比较困难。母源抗体可以提供新生仔猪保护作用。严重感染病例，经口补液有一定治疗效果。
4.本发明通过对posav阳性样品进行全基因测序，与国内外参考毒株构建遗传进化树和进行同源性比对分，了解云南省posav与其他毒株亲缘关系，进一步阐明云南流行毒株基因型，为posav后续研究提供参考。


技术实现要素：

5.本发明提供了一种posav giii型毒株全基因组扩增引物及其扩增方法，以解决现有技术的上述问题。
6.本发明的方案是：
7.一种posav giii型毒株全基因组扩增引物，包括8对扩增引物：
8.引物对1：
9.sav-f1：5
’‑
tcgtgatggctaattgccgtc-3’；
10.sav-r1：5
’‑
gccatgtggatagtggayta-3’；
11.引物对2：
12.sav-f2：5
’‑
cccacycaaatgttcaccaag-3’；
13.sav-r2：5
’‑
atgtgtcagtcaacaayctcct-3’；
14.引物对3：
15.sav-f3：5
’‑
tggctttytggcgtcgcataac-3’；
16.sav-r3：5
’‑
tggtgggacatyctcaargc-3’；
17.引物对4：
18.sav-f4：5
’‑
ggttyccyttgcagtctgagtg-3’；
19.sav-r4：5
’‑
gattgccaayaacctrcaacc-3’；
20.引物对5：
21.sav-f5：5
’‑
tcmcaacaccaratgattgcc-3’；
22.sav-r5：5
’‑
tcatgccbgtggtggtyaa-3’；
23.引物对6：
24.sav-f6：5
’‑
cacacaatcatccccrtatgtg-3’；
25.sav-r6：5
’‑
ttcaccctgctcaagccycc-3’；
26.引物对7：
27.sav-f7：5
’‑
ttggrttcaccctgctcaagcc-3’；
28.sav-r7：5
’‑
cacgatgagttggatygcagg-3’；
29.引物对8：
30.sav-f8：5
’‑
tgggacawcaggaaggtccat-3’；
31.sav-r8：5
’‑
ccttacacagtgtggcggct-3’。
32.本发明还公开了一种posav giii型毒株全基因组扩增方法，包括下列步骤：
33.1)rna提取，将病料样本按照试剂盒操作说明进行反转录；
34.2)全基因分段扩增，将反转录产物用8对扩增引物分别扩增病料样本的全基因序列，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
35.3)病料样本测序，将通过琼脂糖凝胶电泳检测的产物切胶，进行胶回收，胶回收产物连接到pmd-18t载体，连接产物转化到感受态细胞dh5α，挑取单个菌落接种到氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃恒温振荡培养16-18h，按质粒提取试剂盒操作说明提取重组质粒，将提取好的重组质粒进行测序；
36.4)全基因序列分析，用dna man 6.0将测序结果依次拼接得到病料样本的全基因组序列，全基因序列在ncbi中比对分析，应用dnastar 7.1与mega 5.2软件将病料样本全基因组序列与genbank中公布的23株不同sav流行毒株基因序列进行比对及遗传特征分析，分析出病料样本的遗传变异特征。
37.作为优选的技术方案，所述步骤1)中反转录为反转录体系10μl：rna模板3.5μl，easyscript rt/ri enzyme mix 5μl，2
×
es reaction mix 0.5μl,下游引物1μl；反转录程序：42℃30min，85℃5min，反转录产物置于-20℃保存。
38.作为优选的技术方案，所述步骤2)中pcr扩增体系25μl：dna模板1μl，上游引物10pmol/μl与下游引物10pmol/μl各0.5μl，2
×
trantaq hifi pcr super mixⅱ12.5μl，depc水10.5μl。
39.作为优选的技术方案，步骤2)中pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环，72℃延伸5min，4℃低温保存。
40.作为优选的技术方案，所述步骤2)中将pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
41.由于采用了上述技术方案一种posav giii型毒株全基因组扩增引物及其扩增方法，1)rna提取，将病料样本按照试剂盒操作说明进行反转录；2)全基因分段扩增，将反转录产物用8对扩增引物分别扩增病料样本的全基因序列，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；3)病料样本测序，将通过琼脂糖凝胶电泳检测的产物切胶，进行胶回收，胶回收产物连
接到pmd-18t载体，连接产物转化到感受态细胞dh5α，挑取单个菌落接种到氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃恒温振荡培养16-18h，按质粒提取试剂盒操作说明提取重组质粒，将提取好的重组质粒进行测序；4)全基因序列分析，用dna man 6.0将测序结果依次拼接得到病料样本的全基因组序列，全基因序列在ncbi中比对分析，应用dnastar 7.1与mega 5.2软件将病料样本全基因组序列与genbank中公布的23株不同sav流行毒株基因序列进行比对及遗传特征分析，分析出病料样本的遗传变异特征。
42.本发明为posav疫苗的研制提供了研究基础，有效预防和控制该病在地域的流行提供了科学依据，为posav giii型毒株鉴定研究提供支持，了解posav giii型与其他毒株亲缘关系，为posav后续研究提供参考，为了解posav分子特征及多样性和遗传进化提供一定的参考依据，也为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。
附图说明
43.图1为实施例posav抗原检测电泳图，其中m：2000dna maker；泳道1～8分别为引物1～8的扩增结果；
44.图2为实施例中ynjd158和ynan326全基因序列与不同sav基因型构建遗传进化树图；
45.图3为实施例中全基因组序列同源性比对图；
46.图4为实施例中毒株序列构建遗传进化树图。
具体实施方式
47.为了弥补以上不足，本发明提供了一种posav giii型毒株全基因组扩增引物及其扩增方法以解决上述背景技术中的问题。
48.本发明还公开了一种posav giii型毒株全基因组扩增方法，包括下列步骤：
49.1)rna提取，将病料样本按照试剂盒操作说明进行反转录；
50.2)全基因分段扩增，将反转录产物用8对扩增引物分别扩增病料样本的全基因序列，将pcr产物进行琼脂糖凝胶电泳检测；
51.3)病料样本测序，将通过琼脂糖凝胶电泳检测的产物切胶，进行胶回收，胶回收产物连接到pmd-18t载体，连接产物转化到感受态细胞dh5α，挑取单个菌落接种到氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃恒温振荡培养16-18h，按质粒提取试剂盒操作说明提取重组质粒，将提取好的重组质粒进行测序；
52.4)全基因序列分析，用dna man 6.0将测序结果依次拼接得到病料样本的全基因组序列，全基因序列在ncbi中比对分析，应用dnastar 7.1与mega 5.2软件将病料样本全基因组序列与genbank中公布的23株不同sav流行毒株基因序列进行比对及遗传特征分析，分析出病料样本的遗传变异特征。
53.所述步骤1)中反转录为反转录体系10μl：rna模板3.5μl，easyscript rt/ri enzyme mix 5μl，2
×
es reaction mix 0.5μl,下游引物1μl；反转录程序：42℃30min，85℃5min，反转录产物置于-20℃保存。
54.所述步骤2)中pcr扩增体系25μl：dna模板1μl，上游引物10pmol/μl与下游引物
10pmol/μl各0.5μl，2
×
trantaq hifi pcr super mixⅱ12.5μl，depc水10.5μl。
55.步骤2)中pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火60s，72℃延伸60s，共35个循环，72℃延伸5min，4℃低温保存。
56.所述步骤2)中将pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
57.为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
58.实施例：
59.1材料与方法
60.1.1材料
61.1.1.1样品来源
62.猪札幌病毒阳性病料是从腹泻病猪粪便样品中分离获得，由云南农业大学动物医学院动物传染病实验室提供，阳性病料编号为ynjd158和ynan326。
63.1.1.2主要试剂
64.tripure reagent总rna抽提试剂购自北京百泰克生物技术有限公司；柱状质粒dna小提取试剂盒、胶回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；easyscript rt/ri enzyme mix、2
×
es reaction mix、2
×
trantaq hifi pcr super mixⅱ购自北京全式金生物技术有限公司；pmd18-t vector、e.coli dh5αcompetent cells、限制性内切酶等购自宝生物(大连)有限公司；其他试剂由云南农业大学动物医学院动物传染病实验室提供，试剂均为分析纯。
65.1.1.3引物设计与合成
66.根据ncbi genbank中已发表的猪札幌病毒gⅲ基因序列kt922087.1、kf204570.1，采用primer premier设计特异性引物8对，由南京擎科生物科技有限公司合成(表1)
67.表1引物信息
[0068][0069]
。
[0070]
1.2方法
[0071]
1.2.1 rna的提取
[0072]
将阳性病料按tripure reagen试剂盒操作说明提取rna，立即反转录。反转录体系10μl：rna模板3.5μl，easyscript rt/ri enzyme mix 5μl，2
×
es reaction mix 0.5μl,下游引物1μl；反转录程序：42℃30min，85℃5min。反转录产物置于-20℃保存。
[0073]
1.2.2全基因分段扩增
[0074]
将反转录产物用已设计的8对引物分别扩增ynjd158和ynan326的全基因序列。pcr扩增体系25μl：dna模板1μl，上下游引物(10pmol/μl)各0.5μl，2
×
trantaq hifi pcr super mixⅱ12.5μl，depc水10.5μl；pcr扩增程序：94℃预变性5min，94℃变性30s，60℃退火60s(每对引物有对应的退火温度)，72℃延伸60s，共35个循环，72℃延伸5min，4℃低温保存。将pcr产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0075]
1.2.3 ynjd158和ynan326基因克隆、测序
[0076]
将琼脂糖凝胶电泳正确的产物切胶，进行胶回收，胶回收产物连接到pmd-18t载体，连接产物转化到感受态细胞dh5α，挑取单个菌落接种到氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃恒温振荡培养16-18h，按质粒提取试剂盒操作说明提取重组质粒。将提取好的质粒送到南京擎科生物科技有限公司公司进行测序。
[0077]
1.2.4全基因序列分析
[0078]
用dna man 6.0将测序结果依次拼接得到病毒的全基因组序列，全基因序列在ncbi中比对分析，应用dnastar 7.1和mega 5.2等软件将ynjd158和ynan326与genbank中公布的23株不同sav流行毒株基因序列进行比对及遗传特征分析，分析ynjd158和ynan326的遗传变异特征，具体参考毒株信息见表2。
[0079]
表2参考毒株信息
[0080][0081]
2结果与分析
[0082]
2.1 posav全基因rt-pcr全基因扩增结果
[0083]
提取猪札幌病毒阳性病料总rna，反转录后用8对引物分别扩增，各目的片段与预期片段大小相符(图1)。
[0084]
m：2000dna maker；泳道1～8分别为引物1～8的扩增结果。
[0085]
2.2 posav全基因组结构分析
[0086]
使用dnastar 7.1拼接ynjd158和ynan326测序结果，成功获得2株posav(ynjd158和ynan326)全基因序列，长度均为7340bp，编码2447个氨基酸。
[0087]
ynjd158毒株4种核苷酸的比例分别为：a(24％)、t(24％)、g(26％)、c(26％)，其中g c含量为52％。
[0088]
ynan326毒株4种核苷酸的比例分别为：a(24％)、t(23％)、g(26％)、c(27％)，其中g c含量为53％高于ynjd158毒株的g c含量。
[0089]
ynjd158毒株和ynan326毒株基因组编码两个开放阅读框(orf)。orf1为6764bp(10-6774nt)，编码一个2255aa的多聚蛋白，含非结构蛋白和vp1。orf2为516bp(6770-7285nt)，与orf1有4个碱基的重叠区，该阅读框编码一个171aa的次要结构蛋白。
[0090]
2.3 posav遗传特征分析
[0091]
使用mega 5.0将研究获得的ynjd158和ynan326全基因序列与不同sav基因型构建遗传进化树(图2)。结果显示，遗传进化树分为四个分支。ynjd158和ynan326与il31538
(mk965898.1)亲缘关系最近；与giii型毒株聚类在同一进化分支上，表明云南省流行毒株ynjd158和ynan326属于giii型posav。
[0092]
2.4 posav全基因序列同源性比对
[0093]
使用dnastar 7.1将ynjd158和ynan326与giii型参考毒株进行同源性比对，结果显示，毒株ynjd158和ynan326的同源性为88.8％，与cowden(kt922087.1)的同源性分别为83.6％和84.0％；与毒株il31538(mk965898.1)的同源性最高，分别为90.5％和89.8％；与giii型posav参考毒株的同源性在80.7％～90.5％之间，表明giii型posav流行毒株间与国内外参考毒株同源性差别较大(图3)。
[0094]
2.5 posav vp1基因遗传特征分析
[0095]
基于sav分类原则，用mega 5.0比对2条posav云南流行毒株vp1基因序列和genbank中不同基因型参考毒株序列构建遗传进化树。由图4可知，遗传进化树将所有毒株分为5个大分支，2条云南流行毒株与giii型posav参考毒株聚在同一大分支上。
[0096]
3讨论
[0097]
本试验首次公布了云南省posav全基因组序列。sav基因组是一条长为7.1-8.3kb的单股正链rna，编码2个orf，本试验获得的ynjd158和ynan326毒株rna长均为7340bp，编码2447aa。
[0098]
全基因序列比对和遗传进化分析表明本试验获得的2株posav(ynjd158和ynan326)属于ciii型，同源性为88.8％，提示它们的起源可能是一样的。ynjd158和ynan326与美国毒株il31538(mk965898.1)的同源性最高，遗传进化树结果显示毒株ynjd158和ynan326与毒株il31538(mk965898.1)的亲缘关系最近。据报道在2005年～2017年间，我国种猪引进国家美国位居首位。提示云南省流行ciii型pasav可能与引种有关。在2007～2016年间研究者们检测得出的病原学和血清学结果差异较大，可能与猪群的感染状态和猪只肠道对病毒的清除能力有关。关于毒株ynjd158和ynan326的临床致病性的差异还需后续研究证实。posav会引起仔猪以腹泻为主的肠胃炎。美国、荷兰、韩国、日本和委内瑞拉等国家的研究都显示了各年龄猪群中猪sav的高感染率和血清阳性率。2008年张文等首次在国内暴发仔猪腹泻猪群中检测出posav，2009年黄泽斌等对湖南地区多个猪场感染posav进行流行病学调查，结果显示所调查地区均存在posav流行。本试验前期研究共检测云南省不同地区679份猪粪便样品，检出posav阳性196份，阳性率28.9％。证明posav已在云南地区流行。
[0099]
本试验成功扩增出两株posav全基因序列，证实posav已在云南猪群中流行。对其vp1基因和全基因序列与参考毒株序列进行比对分析，进一步阐明了posav云南流行毒株为giii型，为了解云南posav分子特征及多样性和遗传进化提供一定的参考依据，也为深入研究该病毒株的遗传与变异及其与生物学特性的关系奠定了基础。
[0100]
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。