桂花基因OfTPS380.1及其应用的制作方法

桂花基因oftps380.1及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及桂花基因oftps380.1及其在产香叶醇的应用


背景技术：

2.geraniol(香叶醇)是从植物中提取到的一种非环单萜醇类化合物。常温下为无色至黄色的油状液体，具有温和、甜的玫瑰花气息，味有苦感。它是玫瑰油、马丁香油和香茅油等香精油的主要成分之一，也少量存在于天竺葵和柠檬中。香叶醇及其酯广泛用作日用香精和食用香精，是玫瑰系香精的主剂，用于配制日用产品和食品。同时香叶醇入药用于抗菌和驱虫，临床治疗慢性支气管炎效果好，除此之外可改善肺通气功能和降低气道阻力，对提高机体免疫功能也颇有裨益。
3.桂花是著名的香花植物，含有丰富的萜类物质，它们不仅能带给人愉悦的精神感受，还有杀菌消炎、抗氧化抗衰老等康养保健价值。桂花基因组中含有大量香气基因，但桂花中尚未有香叶醇合成酶基因的相关报道。本发明利用生物信息学的技术筛选出桂花中香叶醇合成酶基因，并在酿酒酵母中进行功能验证。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术的不足，本发明从桂花基因组中筛选到在桂花花瓣中高表达香叶醇合成酶基因oftps380.1，并在酿酒酵母中进行功能验证。
5.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
6.桂花香叶醇合成酶基因oftps380.1：经基因组数据生物信息学分析，筛选到在桂花花瓣中高表达的萜类基因oftps380.1，其cds序列如seq id no.1所示。
7.一种表达载体，含有香叶醇合成酶基因oftps380.1。
8.表达oftps380.1基因的重组酿酒酵母及其应用：将含有基因oftps380.1的酵母表达载体转化酿酒酵母，通过抗性平板和测序筛选获得表达oftps380.1基因的重组酿酒酵母；将重组酿酒酵母接种于ypd培养基，并加入肉豆蔻酸异丙酯进行覆盖，发酵结束后萃取香叶醇。
9.与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：
10.香叶醇合成酶基因在植物中的研究甚少，本发明首次在桂花中挖掘出香叶醇合成酶基因并在酿酒酵母中进行功能验证，香叶醇产量达到21.67mg/l，具备工业化生产的价值。
附图说明
11.图1是实施例1中oftps380.1克隆胶图
12.图2是实施例2中表达载体质粒的图谱。
13.图3是香叶醇gc-ms检测结果。
14.图4是香叶醇离子碎片图。
具体实施方式
15.以下结合附图及具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
16.实施例1基因筛选与克隆
17.基因筛选与克隆：经基因组数据生物信息学分析，筛选到在桂花花瓣中高表达的香叶醇合成酶基因(oftps380.1)，由primer5.0软件设计扩增oftps380.1基因cds全长的特异引物oftps380.1-cds-f和oftps380.1-cds-r(见表1)，由北京擎科生物技术有限公司合成扩增引物。以桂花cdna为模板，参考phanta高保真酶说明书扩增目的基因cds，pcr反应体系和程序如表2、表3。
18.表1引物列表
[0019][0020]
表2pcr反应体系
[0021][0022]
表3pcr反应程序
[0023][0024]
凝胶电泳检测与基因测序：30ml tae添加0.45g琼脂糖粉末，微波炉煮融之后加3μl 10000
×
核酸染料，倒入制胶板，凝固之后进行点样。120v、150ma电泳30min之后，在gel-logie200凝胶扫描成像仪观察条带(如图1所示)。目的条带回收后连接t-载体，转化大肠杆
菌进行测序，oftps380.1基因cds的序列如seq id no.1所示，将测序正确的菌液提取质粒，命名为oftps380.1-cds-plasmid，作为后面构建载体的模板。
[0025]
实施例2载体构建
[0026]
酵母载体构建：以oftps380.1-cds-plasmid为模板，设计携带bsai酶切位点的上下游引物oftps380.1-bsai-f/r(表1)克隆oftps380.1基因片段，将所得的pcr产物以及所需构建的表达载体质粒(质粒图谱如图2所示，刘天罡老师课题组馈赠)进行goldengate连接。pcr反应体系和程序见表2和表3，产物直接进行大肠杆菌转化，挑单克隆阳性检测，将阳性单菌落摇菌提质粒后酶切验证，酶切验证正确的质粒测序，将测序正确的质粒命名为：oftps380.1-pkz762-plasmid，用于后续酿酒酵母的转化。
[0027]
实施例3酵母转化及平板筛选
[0028]
ypd固体培养基配制：2％蛋白胨，1％酵母提取物，琼脂10g/l，加蒸馏水加热溶解后定容至0.9倍终体积；115℃灭菌30min，之后补加0.1倍体积的20％葡萄糖溶液，得到ypd培养基。sc-ura筛选培养基：0.67％酵母氮源基础培养基ynb，按下表4称取缺尿嘧啶的氨基酸混合物，用2m naoh溶液调节ph为6.5，加蒸馏水加热溶解后定容至0.9倍体积，115℃灭菌30min；灭菌后加0.1倍体积的20％葡萄糖溶液。
[0029]
表4氨基酸混合液配方
[0030][0031][0032]
10
×
te配置：100mm的tris和10mm的edta，用盐酸调节ph至7.5，最后115℃高压蒸汽灭菌30min，置于室温下保存。
[0033]
10
×
liac(醋酸锂)配置：1m的liac，用冰醋酸(乙酸)调节ph至7.5，然后0.22μm无
菌滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱备用。
[0034]
50％的peg4000：称取40g的peg4000，加入适量的水，加热直至完全溶解后加水定容到80ml；115℃，灭菌30min，最后600μl/管分装，置于4℃冰箱备用。
[0035]
dmso：0.22μm无菌滤膜过滤除菌，置于4℃冰箱备用。
[0036]
单链鱼精dna(ssdna)：购买于北京酷来博科技有限公司。
[0037]
酿酒酵母菌株yzl141转化及平板筛选方法具体如下：
[0038]
1.挑取酿酒酵母菌株yzl141单克隆5个左右于含5ml ypd液体培养基的pa瓶中，30℃摇床过夜培养；取50μl菌液，用无菌水稀释20倍，测量od
600
值(稀释20倍，不能使od值大于1，否则会测不准)；按od
600
×
体积＝10的公式(如若od＝2，则取5ml，一般取500-1000μl之间)转接至50ml新鲜的ypd培养基中，30℃，220rpm培养3.5h；待od600长至0.5-0.8时，3000rpm离心5min收集菌体；加入20ml 1
×
te溶液重悬细胞，3000rpm，离心5min，弃上清；在沉淀的菌体中加入2ml 1
×
liac/0.5
×
te(1700μl h2o 200μl 10
×
liac 100μl 10
×
te)，室温放置10min(25℃为宜)；
[0039]
2.单链鱼精dna沸水煮10min后迅速放回冰上冷却，确保鱼精dna为单链状态，取100μl酵母菌株yzl141悬浮液，加入10μl变性单链鱼精dna，加入300ng提前稀释好备用的oftps380.1-pkz762-plasmid质粒，轻弹混匀，最后加700μl 1
×
liac/40％peg4000/1
×
te溶液(560μl peg4000 70μl 10
×
liac 70μl 10
×
te)混匀；30℃培养30min；加入88μl的dmso，混匀后42℃热激9min；10000rpm离心30s，弃上清；加入1ml ypd培养基重悬菌体，8000rpm离心30s，弃上清；加入1ml ypd培养基重悬菌体，30℃摇床温育30min；10000rpm离心30s，弃上清；加入1ml 1
×
te溶液重悬菌体，10000rpm离心30s，弃上清；
[0040]
3.将转化后的yzl141涂布在sc-ura筛选平板，待液体吹干后放于30℃培养箱中进行培养，约2-3天可见明显的单菌落。
[0041]
实施例4酵母转化菌落阳性检测
[0042]
将转化的酵母的单菌落挑至10μl无菌水里，取出2μl，加入10μl 20mm naoh溶液，用pcr仪99℃处理20min，放置于冰上，用于模板，模板在使用之前进行涡旋2s混匀防止沉降。
[0043]
pcr体系(10μl)：2
×
taq master mix 5μl，oftps380.1-酵母转化阳性检测
–
f/r各0.5μl，模板1μl，水3μl，pcr条件为：94℃预变性2min，94℃变性20s，55℃退火20s，72℃延伸1min/kb，设置30个循环，72℃终延伸5min。将pcr产物电泳后观察条带，若有明显阳性条带(目标条带1752bp)可进行酵母发酵以及香叶醇gc-ms检测。
[0044]
实施例5酵母发酵和香叶醇gc-ms检测
[0045]
1.摇瓶发酵培养
[0046]
ypd液体培养基配置：蛋白胨(安琪牌)终浓度20g/l，酵母粉(安琪牌)终浓度10g/l，葡萄糖终浓度10g/l，半乳糖终浓度10g/l(葡萄糖和半乳糖单独配，灭菌之后添加到培养基中)，肉豆蔻酸异丙酯(ipm)用之前要用无菌过滤膜过滤。
[0047]
接种：从转化的平板上挑取5个检测为阳性的单菌落于5ml的ypd液体培养基中，220rpm，30℃过夜培养。第二天吸取过夜培养菌液，按一定比例加入到50ml液体培养基中，使初始od
600
值约为0.1，并加入10％肉豆蔻酸异丙酯进行覆盖，放置于30℃摇床220rpm培养72h。
[0048]
2.gc-ms定量检测香叶醇
[0049]
发酵结束后，4℃4000rpm离心10分钟后取200μl肉豆蔻酸异丙酯到上样瓶中，gc-ms检测产物，同时加入1μl浓度为4.75mg/l的壬酸甲酯作为定量计算的内标，其中未转化的酿酒酵母菌株yzl141作为阴性对照，定量计算公式：c1/v1＝c2/v2(c1为壬酸甲酯的峰面积，v1为壬酸甲酯的浓度，c2为香叶醇的峰面积，v2为香叶醇的浓度)。
[0050]
gc-ms检测：
[0051]
gc设置：进样口温度为250℃，进样方式为不分流，升温程序起始温度为40℃，保持3.5min，10℃/min的升温速率升温至100℃，保持3min，然后以5℃/min的速率升温到280℃，保持5min。总程序时间为46.5min。
[0052]
ms的设置：接口温度为280℃，载入气体为氦气，流速为1.0ml/min，离子源温度为220℃，ei电离模式，电子能量为70ev，扫描范围为50-500amu。
[0053]
进样模式为不分流模式，进样口的温度维持在230℃，传输线温度为240℃。电子能量70ev，扫描范围为40
–
450amu，离子源温度为150℃，以高纯度氦气(99.999％)为载气，流速0.8ml/min。起始柱温为40℃，保持3min，然后以1℃/min的速率升温到80℃，维持3min，接着以10℃/min的升温速率升到220℃，保持15min。
[0054]
经gc-ms检测，目标产物峰为香叶醇，目标出峰时间为7.58min，最终香叶醇的浓度为21.67mg/l。