不耐热沙雷氏菌核酸酶的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及不耐热沙雷氏菌核酸酶。


背景技术：

2.粘质沙雷氏菌核酸酶serratia marcescens nuclease(ec 3.1.30.2)是一种非特异性核酸酶，可以将所有形式的dna和rna消化成一到四个5'-磷酸化核苷酸。该酶具有较高的比活性，每毫克蛋白质有100万单位酶活力。目前，粘质沙雷氏菌核酸酶具有多种商业化名称，包括emd millipore corp.(马萨诸塞州伯灵顿)的和accelagen(加利福尼亚州圣地亚哥)的turbonuclease
tm
。且，粘质沙雷氏菌核酸酶已经广泛应用于蛋白质的纯化。
3.野生型粘质沙雷氏菌核酸酶具有极强的热稳定性。但是，可以通过向反应体系中添加edta、高浓度磷酸盐或高浓度盐是该酶可逆地灭活，或者通过添加100mm naoh，在70℃下保持30分钟实现不可逆的完全热灭活。在这些灭活条件下，体系中其它反应很难进行。
4.对于某些在后续实验过程中需要去除核酸酶活性的反应体系而言，具有较高耐热特性的粘质沙雷氏菌核酸酶会更有优势。
5.总结
6.本发明涉及一种工程化的粘质沙雷氏菌核酸酶不耐热突变体。在相同的缓冲体系中，于60℃保持20min后，野生型粘质沙雷氏菌核酸酶酶活性为12.5％，而本发明提供的不耐热突变体r146d/d156r/d229r/d245r(seq id no:12，不含n端21个氨基酸的信号肽)仅保留0.39％的活性。因此，突变体的热敏性是野生型的32倍。然而，热灭活性能取决于温度、时间和缓冲液成分。在合适的缓冲条件下延长温度，可以实现不耐热突变体r146d/d156r/d229r/d245r更彻底的热灭活，但可能会影响其他所需要的反应。可以通过常规实验确定体系的温度和暴露时间，以达到所需的灭活程度和其他所需要的反应的抑制程度。
附图说明
7.图1为野生型粘质沙雷氏菌核酸酶与突变体r146d/d156r/d229r/d245r热稳定性对比效果电泳图；图a：未加热的野生型粘质沙雷氏菌核酸酶；图b：60℃、20分钟后的野生型粘质沙雷氏菌核酸酶；图c：未加热的突变体r146d/d156r/d229r/d245r；图d：60℃、20分钟后的突变体r146d/d156r/d229r/d245r。泳道m：1kb dna阶梯(new england biolabs,inc.)；泳道1至24，用10mm tris-hcl，ph8.0连续稀释2倍的粘质沙雷氏菌核酸酶。
8.详细描述
[0009]“r146d/d156r/d229r/d245r”和“突变体r146d/d156r/d229r/d245r”是指在名称中的四个位点有突变的粘质沙雷氏菌核酸酶突变体，序列如seq id no：12所示(不含n端21个氨基酸的信号肽，信号肽在表达过程中被切割掉)。
[0010]
本发明中术语“保守突变体”包括对给定序列进行修饰但依然保持原功能的突变体。例如，在核酸水平下，由于密码子的简并性，通过“沉默置换”改变核苷酸序列而氨基酸
序列不发生改变，所编码的多肽不发生改变。
[0011]
类似地，多肽序列的“保守突变体”保留其原有功能。例如，guo，“protein tolerance to random amino acid change”(pnas 101:9205-10；2004)一文证明即使“没有详细了解蛋白质结构与其功能用途相关的方式......”也可以成功对多肽进行修饰。保守氨基酸的置换是指将氨基酸置换为具有相同特性的另一个氨基酸。确定氨基酸之间共同特性的一种功能方法是分析同源生物的相应蛋白质之间氨基酸变化的标准化频率(schulz(1979)principles of protein structure,springer-verlag)。根据对标准化频率的分析对氨基酸进行分组，组内氨基酸对整体蛋白质结构的影响最相似，在进行置换时优先选择(schulz(1979)同上)。以这种方式确定的氨基酸基团包括：“带电/极性基团”，包括glu、asp、asn、gln、lys、arg和his；“芳香族或环状基团”，包括pro、phe、tyr和trp；和“脂肪族基团”，包括gly、ala、val、leu、ile、met、ser、thr和cys。在每个组内还可以再细分为多个子组。例如，带电/极性氨基酸组可以细分为多个子组，包括：“带正电子组”包括lys、arg和his；“带负电荷的亚组”包括glu和asp；以及“极性亚组”包含asn和gln。在另一个实例中，芳族或环状基团可细分为亚组，包括：“氮环亚组”包括pro、his和trp；以及“苯基亚基”包含phe和tyr。在更进一步的例子中，脂肪族基团可以细分为亚组，包括：“大脂肪族非极性亚组”包括val、leu和ile；“脂肪族微极性亚组”包含met、ser、thr和cys；以及由gly和ala组成的“小残基亚组”。保守突变的实施例包括上述亚组内氨基酸的置换，例如但不限于：lys替代arg或反之arg替代lys，从而保持正电荷；glu替代为asp，或反之，以保持负电荷；ser替代为thr，或反之，以保持一个游离的
‑‑
oh；和gln替代为asn或反之，以保持游离nh2。“保守突变体”是包括一个或多个氨基酸的多肽，这些氨基酸已被取代以替换原始多肽中具有共同特性(例如，属于与上述相同的氨基酸组或亚组)的一个或多个氨基酸(例如，其序列在出版物或序列数据库中公开的多肽，或其序列已通过核酸测序确定)。
[0012]
可以根据本领域众所周知的方法制备突变体r146d/d156r/d229r/d245r的保守突变体，包括以下描述的用于产生r146d/d156r/d229r/d245r或其他粘质沙雷氏菌核酸酶突变体的方法。
实施例
[0013]
粘质沙雷氏菌核酸酶的表达：将质粒与含卡那霉素抗性的pbad载体连接，之后在c2566(new england biolabs,ma)中进行细胞外表达。表达过程中，前21个氨基酸从成熟蛋白质中被去除，突变氨基酸残基编号来自信号肽的第一个氨基酸。以下点突变可以是单独进行的，也可以是组合进行的。如序列部分所述，可以使用反向pcr，以仅扩增具有所需突变序列的dna：d22r,e25k,d28r,r46d,k58e,k69e,d70r,k76e,r78d,k81e,d83r,d90r,d96r,k105e,d107r,r108d,d122r,e124k,k136e,d138r,r146d,e148k,d149r,e151k,r152d,k153e,d156r,r157d,d159r,e172k,r173d,d174r,k177e,k183e,k193e,d212r,k217e,d220r,r225d,d229r,e230k,e232k,k233e,r234d,d245r,d246r,k252e和k254e.
[0014]
本发明中也可以使用诱变pcr方法产生突变体r146d/d156r/d229r/d245r和其他突变体，以产生扩增的突变dna寡聚体。然后在表达系统(例如大肠杆菌)中将寡聚体翻译成蛋白质(核酸酶)。如美国专利nos.4,873,192&5,556,747(均通过引用并入本技术中)中关于与定点诱变有关的过程。
[0015]
用培养基对lambda dna测定实现对粘质沙雷氏菌核酸酶活性的检测。lambda dna首先被消化成涂片，然后消化1到4个核苷酸，之后加入培养基，最终体系中包含10mm tris-hcl、2mm mgcl2、ph8.0。
[0016]
本发明中还进行了热稳定性试验，比较了在60℃下孵育20分钟前、后的酶活性。反应条件为：2μl含有粘质沙雷氏菌核酸酶的培养基，2μl 10x反应缓冲液，最终体系浓度为10mm ph 8.0，2mm mgcl2，0.4μl 500ng/ul lambda dna，15.6μl h2o。反应在37℃下进行1小时。dna在1％琼脂糖凝胶上运行。四个突变体，r146d、d156r、d229r和d245r，表现出比野生型更多的热失活性能。
[0017]
包含上述四个突变的突变体r146d/d156r/d229r/d245r是最不耐热的。加热前后的酶活性比较结果如图1所示。电泳结果显示，泳道a 15-17与泳道b12-14接近，这意味着加热到60℃20分钟时，wt酶活性降低到1/8，或12.5％。泳道c15-17与泳道d 7-9接近，这意味着加热至60℃20分钟，突变体r146d/d156r/d229r/d245r的酶活性降低至1/256，即0.39％。
[0018]
因此，在相同的缓冲体系中，于60℃保持20min后，野生型粘质沙雷氏菌核酸酶酶活性为12.5％，而本发明提供的突变体r146d/d156r/d229r/d245r仅保留0.39％的活性。
[0019]
突变体r146d/d156r/d229r/d245r的应用
[0020]
突变体r146d/d156r/d229r/d245r的应用包括从生物制药反应产物中去除dna、蛋白质纯化和样品制备，类似于emd millipore corp.(burlington,ma)描述的和accelagen(san diego,ca)描述的turbonucleasetm的用途，包括但不限于：病毒疫苗生产、病毒样颗粒产生、用于疫苗和细胞及基因治疗应用的病毒载体生产、防止细胞结块、降低粘度、fab纯化以及蛋白质和包涵体纯化。
[0021]
突变体r146d/d156r/d229r/d245r的降解程度可以通过调节温度进行控制，如在保留足够长的时间使混合物中大多数污染物dna寡核苷酸降解后，升高温度以避免不需要的产物被消化，但是也要避免出现非必要物质的降解。反应停止时间可通过常规实验进行确定。基于加热至60℃20分钟时，突变体r146d/d156r/d229r/d245r的酶活性降低至1/256或0.39％的实验结果，这意味着加热和有效停止酶活性之间可能存在滞后。
[0022]
序列
[0023]
野生型粘质沙雷氏菌核酸酶dna序列(seq id no:1):
[0024]
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[0038]
野生型粘质沙雷氏菌核酸酶的蛋白质序列(seq id no：2)。下划线部分(从n端开始的前21个氨基酸)是信号肽，在表达过程中被切掉。
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[0144]
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[0145]
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[0146]
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[0148]
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[0149]
本发明中描述的具体方法和组合物仅代表优选的实施方案，上述给出的实施例仅做代表示例，并不对本技术的保护范围造成限制。本领域技术人员可以在对本技术的技术方案理解的基础上对实验方法、实施例等作出改变，并包含在本技术权利要求的保护范围内。对本领域技术人员而言，在不偏离本发明的范围和精神的情况下，可以对本发明的技术方案作出替代或修改，这对本领域技术人员而言是显而易见的。对于本发明中未明确记载为必要条件的要素，本发明可以在不包含这些要素的情况下实施。在每个实施例中，“包含”、“包括”或“包含”等词语为开放式描述。本发明中的方法或工艺顺序可以进行调整，并不局限于说明书或权利要求书中指出的步骤顺序。除另有说明外，本技术中的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指称，复数形式也包括单数形式。任何情况下，对本技术的解释都不得局限于本技术的说明书或实施例中的具体描述。除在申请人的答复文件中明确声明的以外，本技术不被任何审查员或专利商标局的职员的任何声明所限制。
[0150]
本发明中对技术方案进行了较宽泛的描述，属于同一亚属或种的微生物也属于本发明的保护范围内。本发明中所使用的术语或表述仅用于描述，并不产生限制，使用与这些术语或表述意思相同的描述都是可以的，都属于本发明的保护范围内。因此，虽然本技术中已经通过优选实施例或可选特征进行明确公开，但本领域技术人员可以依据本发明所公开的概念进行修改，这些修改都属于本发明权利要求的保护范围内。