function biomarkers in healthy geriatric cats fed reduced protein foods enriched with fish oil,l-carnitine,and medium-chain triglycerides)《兽医杂志(the veterinary journal)》202 588-596)并且示出sdma与猫的结石形成之间的关系(hall等人,2017肾结石猫的对称二甲基精氨酸和肌酐的血清浓度(serumconcentrations of symmetric dimethylarginine and creatinine in cats with kidney stones)《公共科学图书馆期刊(plos one)》12(4):e0174854)。
8.一些研究人员注意到，sdma和adma是agxt2的底物，已示出与agxt2多态性和其浓度的关联。例如，kittle等人(2014)丙氨酸-乙醛酸盐氨基转氨酶2(agxt2)多态性对健康志愿者的甲基精氨酸和β-氨基异丁酸盐代谢有显著影响(alanine-glyoxylate aminotransferase 2(agxt2)polymorphisms have considerable impact on methylarginine andβ-amino isobutyrate metabolism in healthy volunteers),《公共科学图书馆期刊》9(2):e88544示出特定的多态性影响二甲基精氨酸和β-氨基异丁酸盐的浓度，并且与β-氨基异丁酸盐浓度和sdma浓度相关联。
9.已注意到与二甲基精氨酸和β-氨基异丁酸盐的显著正相互作用。zhou等人(2014)agxt2 v140i多态性与中国人口冠心病风险的关联(association of the agxt2 v140i polymorphism with risk for coronary heart disease in achinese population),《动脉硬化与血栓期刊(j atheroscler thromb.)》21(10):1022-30也示出了与甲基精氨酸和agxt2多态性的关联。特别地，在吸烟者群体和患上糖尿病的群体中，增加的adma示出受到agxt2基因型的影响。
10.尿草酸钙滴定测试(cott)是可用于评估草酸钙结石形成风险的方法(hall等人,2017增加的饮食长链多不饱和脂肪酸会改变血清脂肪酸浓度并降低猫尿结石形成的风险(increased dietary long-chain polyunsaturated fatty acids alter serum fatty acid concentrations and lower risk of urine stone formation in cats).《公共科学图书馆期刊》12(10):e88544)。每升尿液样品中离子钙的浓度和为引发结晶而添加的草酸盐量被计算为比率[ca
2
]/(添加的ox-2
)。增加的指数值表示草酸钙结晶风险较高的样品，而降低的指数值表示风险较小的样品。草酸钙滴定测试(cott)结果可以通过饮食干预来改善，以降低猫草酸钙结石的结石形成风险。
[0011]
单核苷酸多态性(snp)是遗传变异的常见类型。snp是特定基因座处的单碱基对突变。也就是说，snp是发生在基因组中的特定位置处的dna序列中单核苷酸的差异。通常，对于特定位置处的snp，存在两种可能的核苷酸变异，其被称为此位置的等位基因。在群体中，最常出现在基因组中特定碱基位置处的核苷酸变异被称为主要等位基因；在此特定碱基位置处不太常见的核苷酸变异被称为次要等位基因。与大多数多细胞生物一样，猫科动物具有两套染色体。因此，每只猫的每个基因或基因座都有两个拷贝，并且因此每个snp有两个拷贝。因此，对于猫的基因组中的每个snp，猫可以具有两个主要等位基因拷贝，或一个次要等位基因拷贝和一个次要等位基因拷贝，或两个次要等位基因拷贝。
[0012]
snp可以充当生物标志物。已发现一些snp有助于预测药物应答和发展特定疾病的风险。snp基因分型是指基因组内snp的检测。存在用于检测snp和执行snp基因分型的多种方法。
[0013]
需要开发改进的方法来鉴定有增加的可能性或风险患上草酸钙结石的猫。需要开
发方法以确定猫是否具有相对高、中等或低可能性或风险患上草酸钙结石。需要降低患上草酸钙膀胱结石的风险的改进的组合物和方法，包含降低具有遗传标志物或表型性状的猫的至少一个亚群中患上草酸钙膀胱结石的风险的组合物和方法。需要防止具有遗传标志物或表型性状的猫的至少亚群中草酸钙结石形成的改进的组合物和方法。需要开发方法以鉴定将从治疗中获益的猫，以减少患草酸钙结石的可能性或风险。需要可用于此类方法的试剂盒、试剂、其它制品和组合物。
技术实现要素：
[0014]
提供了包括分析从所述猫科动物受试者获得的生物样品中snp a1_212891692的次要等位基因a的一个或两个拷贝的存在的方法。猫科动物受试者具有snp a1_212891692的次要等位基因a的一个或两个拷贝指示所述猫科动物受试者患上草酸钙结石的可能性或风险增加。在一些实施例中，提供执行dna测序、限制酶消化、聚合酶链反应(pcr)、杂交、实时pcr、逆转录酶pcr或连接酶链反应来分析样品。在一些实施例中，所述样品是基因组dna样品。在一些实施例中，所述样品从所述猫科动物受试者的血液、唾液、毛囊根、鼻拭子或口腔拭子获得，优选地唾液。在一些实施例中，通过执行选自以下的至少一种核酸分析技术来分析所述样品：使用全基因组snp芯片进行分析、单链构象多态性(sscp)测定、限制片段长度多态性(rflp)、自动荧光测序；钳制变性凝胶电泳(cdge)；变性梯度凝胶电泳(dgge)、迁移率变动分析、限制酶分析、异源双链体分析、化学错配切割(cmc)、rna酶保护测定、使用识别核苷酸错配的多肽、等位基因特异性pcr、序列分析和snp基因分型。在一些实施例中，通过执行选自以下的至少一种核酸分析技术来分析所述样品：基于杂交的方法、基于酶的方法、基于dna的物理特性的扩增后方法和测序方法。
[0015]
提供了包括分析从所述猫科动物受试者获得的生物样品以测定所述猫科动物受试者的β-氨基异丁酸盐(baib)浓度的方法。可以将猫科动物受试者的baib浓度与阳性参考baib浓度值或阳性对照的测量值进行比较。阳性参考baib浓度值表示草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫的baib浓度。阳性对照样品包含表示草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫的baib浓度的浓度的baib。猫科动物受试者的baib浓度等于或大于阳性参考baib浓度值或测得的阳性对照的baib浓度指示所述猫科动物受试者草酸钙结石形成的可能性或风险增加。
[0016]
提供了包括分析从所述猫科动物受试者获得的生物样品以测定所述猫科动物受试者的2-氧代精氨酸浓度的方法。可以将猫科动物受试者的2-氧代精氨酸浓度与阳性参考2-氧代精氨酸浓度值或阳性对照的测量值进行比较。阳性参考2-氧代精氨酸浓度值表示草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫的2-氧代精氨酸浓度。阳性对照样品包含表示草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫的2-氧代精氨酸浓度的浓度的2-氧代精氨酸。猫科动物受试者的2-氧代精氨酸浓度等于或小于阳性参考2-氧代精氨酸浓度值或测得的阳性对照的2-氧代精氨酸浓度指示所述猫科动物受试者草酸钙结石形成的可能性或风险增加。
[0017]
提供了一种降低猫科动物受试者中草酸钙结石形成的风险的方法。所述方法包括以下步骤：将猫科动物受试者鉴定为草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫科动物受试者；以及向所述猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食。通过检测snp a1_212891692的次要等位基因a的一个或两个拷贝的存在和/或检测猫科动物受试者的baib水平以及确定它指示
所述猫科动物受试者草酸钙结石形成的可能性或风险增加来将所述猫科动物受试者鉴定为草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫科动物受试者。在一些实施例中，猫科动物受试者被喂食低精氨酸饮食，基于干物质每日摄入，按营养摄入的百分比计，所述低精氨酸饮食含有1.84％或更少的精氨酸。
[0018]
提供包括按干重计1.84％或更少的精氨酸的猫科动物食物组合物。
具体实施方式
[0019]
对优选实施例的以下描述在本质上仅是示例性的并且决不旨在限制本发明、其应用或用途。
[0020]
如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另外明确指出。
[0021]
术语“猫”包含被称为家猫(domestic cat/house cat/felis domesticus)的伴侣动物的那些猫。术语猫与术语猫科动物同义。
[0022]
如本文所描述的，患上草酸钙结石的可能性或风险增加是指与猫群体的患上草酸钙结石的可能性或风险相比，个体猫将患上草酸钙结石的几率高于平均水平。具有aa基因型的猫的草酸钙结石发病率高于具有gg基因型的猫的草酸钙结石发病率。也就是说，与患上草酸钙结石的具有gg基因型的猫的分数相比，在具有aa基因型的猫群体中，较大分数患上草酸钙结石。如下所述，在本文所描述的研究中，具有gg基因型的猫具有最低结石形成发生率(8.5％)，具有ag基因型的猫具有中等水平的发病率(12.6％)，并且具有aa基因型的猫具有最高水平的发病率(23.3％)。因此，具有aa和ag基因型的猫患上草酸钙结石的可能性或风险增加。
[0023]
提供了用于鉴定草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫科动物受试者以及用于治疗此类猫科动物受试者以降低草酸钙结石形成的风险的方法。治疗方法包括向猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食的步骤，所述低精氨酸饮食在一些实施例中也是高纤维的。在一些实施例中，用于鉴定草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫科动物以及用于治疗此类猫科动物受试者以降低草酸钙结石形成风险的方法包括分析来自所述猫科动物受试者的样品以测定所述猫科动物受试者是否具有针对snp a1_212891692(felcat8)的aa或ag基因型。在一些实施例中，用于鉴定将从此类减少患上草酸钙膀胱结石的可能性的治疗中获益的猫科动物受试者的方法包括分析来自所述猫科动物受试者的样品，以确定循环的β-氨基异丁酸盐(baib)的水平是否指示所述猫科动物受试者将从所述治疗中受益。
[0024]
提供了用于治疗草酸钙结石形成的可能性或风险增加的猫科动物受试者以减少患上草酸钙膀胱结石的可能性的方法。降低草酸钙结石形成风险的治疗包括向猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食，所述低精氨酸饮食在一些实施例中具有高纤维含量。在一些实施例中，所述方法包括以下步骤：将猫科动物受试者鉴定为草酸钙结石形成的可能性或风险增加，以减少患上草酸钙膀胱结石的可能性，并且然后向所述猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食，所述低精氨酸饮食在一些实施例中具有高纤维含量。可以通过确定猫科动物受试者是否具有针对snp a1_212891692(felcat8)的aa或ag基因型和/或确定循环的baib的水平是否指示所述猫科动物受试者将从治疗中受益来将所述猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险增加。
[0025]
提供了可以充当具有低精氨酸含量的每日饮食的组合物。可用于所述方法的组合物可以是猫食物组合物。
[0026]
如本文所使用的，低精氨酸饮食是指具有低水平的精氨酸的每日饮食，如基于总干重的百分比，按总每日营养摄入的百分比计(而不是卡路里)所表示的。基于总干重的百分比，按总每日营养摄入的百分比计，低水平的精氨酸对应于1.84％或更少的精氨酸。在一些实施例中，基于总干重的百分比，按总每日营养摄入的百分比计，低精氨酸饮食是指1.04％-1.84％的精氨酸。在一些实施例中，基于总干重的百分比，如按总每日营养摄入的百分比计所表示的，低精氨酸饮食是指具有1.21％或更少的精氨酸的每日饮食。在一些实施例中，基于总干重的百分比，如按总每日营养摄入的百分比计所表示的，低精氨酸饮食是指具有1.11％或更少的精氨酸的每日饮食。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物包含含有少于1.04％的精氨酸的食物组合物。下文的表14是参考文本“《家养动物的营养物需求：猫的营养物需求(nutrient requirements of domestic animals:nutrient requirements of cats)》,修订版,华盛顿哥伦比亚特区国家科学院出版社(national academy press washington.dc.)1986.第63-67页”中出现的表10的摘录，所述参考文本列出了用于猫食物组合物的各种蛋白质来源中特定氨基酸的百分比。表14中的摘录部分示出精氨酸％。本领域技术人员可以容易地调配合适的猫食物，以提供佐治亚州亚特兰大美国饲料控制官员协会股份有限公司(association of american feed control officials,inc.(aafco),atlanta,ga.)官方出版物,(2012)中所公开的猫的每日营养需求。使用在参考文献中指定为表10并且摘录为本文的表14的相关部分的“《家养动物的营养物需求：猫的营养物需求》,修订版,华盛顿哥伦比亚特区国家科学院出版社1986.第63-67页”中的表，本领域技术人员可以容易地调配合适的猫食物以提供每日营养需求，同时将精氨酸水平限制为按总干重的百分比计总每日营养摄入的1.84％或更低，并且在一些实施例中，按总干重的百分比计，精氨酸水平为总每日营养摄入的1.04％-1.84％之间，并且在一些实施例中，按总干重的百分比计，精氨酸水平为总每日营养摄入的1.21％或更少，并且在一些实施例中，按总干重的百分比计，精氨酸水平为总每日营养摄入的1.11％或更少。
[0027]
在一些实施例中，“食物”、“食物组合物”、“宠物食物组合物”或“猫食物组合物”可以是其所喂食的猫的营养全面的饮食。
[0028]
如本文所使用的，“成分”是指组合物的任何组分。
[0029]
术语“营养物”是指提供营养的物质。在一些情况下，成分可以包括多于一种“营养物”，例如，组合物可以包括玉米，所述玉米包括重要营养物，包含蛋白质和碳水化合物两者。
[0030]
食物组合物可以以猫食物的形式提供。猫的所有者可获得各种通常已知的猫食物。猫食物的选择包含但不限于湿猫食物、半湿猫食物、干猫食物和猫零食。湿猫食物的水分含量通常大于约65％。半湿猫食物的水分含量通常为约20％到约65％，并且可以包含润湿剂、山梨酸钾和其它防止微生物生长(细菌和霉菌)的成分。干猫食物，如但不限于粗磨食物，水分含量通常低于约15％。宠物零食通常可以是半湿的可咀嚼零食；多种形式的干零食，或烘焙、挤压或冲压的零食；糖果零食；或本领域技术人员已知的其它种类的零食。
[0031]
如本文所使用的，术语“粗磨粒”或“粗磨食物”是指猫饲料中的颗粒团粒状组分。
在一些实施例中，粗磨食物的水分含量或水含量为小于15重量％。粗磨食物的质地可以从硬到软。粗磨食物的内部结构可以从膨胀到致密。粗磨食物可以通过挤出工艺或烘焙工艺形成。在非限制性实例中，粗磨食物可以具有均匀的内部结构或变化的内部结构。例如，粗磨食物可以包含芯和涂层以形成经涂覆的粗磨粒。应当理解，当使用术语“粗磨粒”或“粗磨食物”时，其可以指未经涂覆的粗磨粒或经涂覆的粗磨粒。
[0032]
如本文所用的，术语“挤出”或“挤压”是指通过挤出机送出预处理和/或预制备的成分混合物的工艺。在挤出的一些实施例中，通过挤出工艺形成粗磨食物，其中可以在热和压力下挤出粗磨粒生面团(包含湿和干成分的混合物)以形成粗磨食物。可以使用任何类型的挤出机，其实例包含但不限于单螺杆挤出机和双螺杆挤出机。列出了下文所描述的来源、成分和组分的列表，使得其组合和混合物也被考虑并且在本文的范围内。
[0033]
如本文所设想的，组合物意指涵盖但不限于营养全面且均衡的猫食物组合物。“营养全面的饮食”是包含足够的营养物的饮食，用于维持进行所述饮食的健康猫的正常健康。营养全面且均衡的猫食物组合物是本领域技术人员熟悉的。例如，适用于营养全面且均衡的动物饲料组合物的物质(如营养物和成分)和其推荐量可以在例如佐治亚州亚特兰大美国饲料控制官员协会股份有限公司(aafco)官方出版物,(2012)中找到。
[0034]
遗传因素指示对降低风险的治疗的反应性
[0035]
遗传因素已被鉴定为与草酸钙结石形成的可能性或风险增加相关联。通过猫科动物群体的全基因组研究，已经鉴定处在agxt2基因下游的单核苷酸多态性(snp a1_212891692，felcat8；对应于snp a1_212069607，felcat5)，并且与草酸钙结石形成的可能性或风险增加以及包括低精氨酸饮食的治疗是否可以有效地降低风险相关联。具体地，次要等位基因(aa基因型)的两个拷贝的存在与草酸钙结石形成的高可能性或风险相关联；次要等位基因的一个拷贝和主要等位基因(ag基因型)的一个拷贝的存在与草酸钙结石形成的中等可能性或风险相关联。具有aa和ag基因型的猫特别响应于本文所描述的降低猫的草酸钙结石形成的风险的治疗。
[0036]
进行了全基因组关联分析，其表明agxt2(丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶2)基因与2-氧代精氨酸的循环浓度之间存在关系，2-氧代精氨酸是精氨酸转氨作用的产物。当与gg基因型对比时，aa和ag基因型具有增加的β-氨基异丁酸盐(baib)浓度。由agxt2编码的蛋白质是iii类吡哆醛-磷酸盐依赖性线粒体氨基转移酶。它被称为使用l-丙氨酸作为氨基供体将乙醛酸盐转化为甘氨酸的催化剂。此基因中的多态性也与baib浓度相关联。agxt2具有作为底物的二甲基精氨酸(adma)和作为产物的baib之一。agxt2多态性不仅与baib浓度相关，而且与结石形成相关。
[0037]
gg基因型具有最低结石形成发病率(8.5％)，ag中等(12.6％)并且aa最高(23.3％)。这些较高结石形成发病率与baib浓度增加相关联。在相对单位中，aa基因型中的baib浓度为6.8，在具有ag的猫中baib浓度为3.0，并且在具有gg的猫中baib浓度为1.7。每个基因型内患上结石的猫的baib浓度比所述基因型中的非结石形成猫的baib浓度更高。使用每种基因型作为单元，在结石形成猫中，baib浓度平均增加38％。总之，具有最高baib的基因型经历了最高结石形成水平，并且在每个基因型内，结石形成猫的baib浓度较高。
[0038]
通过减少饮食氨基酸精氨酸，具有agxt2多态性的aa或ag基因型的猫显示出baib显著降低，baib是草酸钙结石风险的生物标志物。原始数据在下文表17-20中示出。
[0039]
也已观察到agxt2多态性与循环的baib水平之间的关系。
[0040]
具有aa和ag基因型的猫对降低草酸钙结石形成的风险的治疗有响应，所述治疗包括施用低精氨酸饮食。因此，在来自猫科动物受试者的样品中确定位于猫科动物受试者agtx2基因下游的snp a1_212891692(felcat8)的特定基因型，为确定猫科动物受试者患上草酸钙结石的可能性或风险是否更高并且因此将从低精氨酸饮食中受益提供了准确的基础。
[0041]
snp a1_212891692处的猫科动物遗传多态性可以用于将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险更高的猫。具有snp a1_212891692的aa或ag基因型的猫将从低精氨酸饮食中受益。aa基因型(也被称为双次要等位基因基因型或纯合次要等位基因基因型)是指猫在snp a1_212891692的两个拷贝中都存在次要等位基因a。ag基因型(也被称为次要-主要等位基因基因型或杂合基因型)是指猫在snp a1_212891692的两个拷贝中都存在一个次要等位基因a拷贝和一个主要等位基因g拷贝。
[0042]
基因型差异转化为可检测的表型差异。与具有gg基因型的猫中的水平相比，具有aa和ag基因型的猫具有循环的baib水平的可检测差异。与来自具有gg基因型的猫的生物样品的baib水平相比，具有aa基因型的猫具有更高水平的baib。具有ag基因型的猫具有的baib水平小于具有aa基因型猫的baib水平并且大于具有gg基因型的猫的baib水平。
[0043]
因此，除了或替代确定基因型以将猫鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险更高，表型差异，即baib水平，也可以用于鉴定猫科动物受试者患上草酸钙结石的可能性或风险是否更高。
[0044]
基因型分析和表型分析可以单独使用或组合使用以提供确认，并且因此在将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险更高时提供更高水平的准确性，并且可以用于通过喂食低精氨酸饮食来降低此类猫患上草酸钙结石的可能性或风险的方法。在一些实施例中，对来自猫的样品进行基因型分析。为了将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险较高的猫，可以执行以下分析中的一项或多项：可以使用来自猫科动物受试者的样品进行基因型分析以确定此猫科动物受试者具有aa或ag基因型和/或可以使用来自猫科动物受试者的样品进行表型分析以鉴定baib水平，所述baib水平指示猫科动物受试者是患上草酸钙结石的可能性或风险较高的猫。在一些实施例中，仅执行基因型分析。在一些实施例中，进行基因型分析和baib水平分析的组合。
[0045]
用于减少被鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险更高的猫科动物受试者的患上草酸钙结石的可能性或风险的治疗包括向猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食。提供了治疗猫以减少患上草酸钙结石的可能性的方法，所述方法包括将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险更高的猫并且向所述猫喂食低精氨酸饮食。在一些实施例中，低精氨酸饮食也是高纤维饮食。在一些实施例中，治疗方法包括以下步骤：1)通过执行a)snp a1_212891692的基因型分析和/或b)用于鉴定指示患上草酸钙结石的可能性增加的baib水平的表型分析来将猫鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险更高的猫；以及2)向所述猫喂食低精氨酸饮食。
[0046]
提供了可用于用于将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险更高的猫的方法的试剂盒、试剂、其它制品和组合物。所述试剂盒、试剂、其它制品和组合物可以用于评价基因型的方法和/或评价baib水平的方法。可用于评价baib水平的方法的试剂
盒、试剂、其它制品和组合物可以包括可用于测量此类baib水平的测定的试剂，并且还可以包括阳性对照样品和阴性对照样品。
[0047]
提供了可用于治疗猫科动物受试者以防止草酸钙结石形成、减少草酸钙结石形成的可能性、延迟草酸钙结石形成的发作和/或降低草酸钙结石形成的严重性的方法的试剂盒、试剂、其它制品和组合物。猫科动物受试者可以被鉴定为患上草酸钙结石的可能性增加或者可能从通过本文提供的各种方法降低草酸钙结石形成的风险的治疗中受益。治疗猫科动物受试者以防止草酸钙结石形成、减少草酸钙结石形成的可能性、延迟草酸钙结石形成的发作和/或降低草酸钙结石形成的严重性的方法可以包括向猫科动物受试者提供低精氨酸饮食。
[0048]
在agxt2基因下游的染色体1上的snp a1_212891692(felcat8)处的猫的基因型、β-氨基异丁酸盐(baib)浓度和草酸钙结石形成的发病率之间存在关联。如表1中所示出的，具有次要等位基因的两个拷贝(aa基因型)的猫草酸钙结石形成的发病率最高。具有主要等位基因的两个拷贝(gg基因型)的猫草酸钙结石形成的发病率最低。具有一个主要等位基因拷贝和一个次要等位基因拷贝(ag基因型)的猫的草酸钙结石形成的发病率在所述两个纯合基因型之间。agtx2基因中的这些多态性也与baib浓度相关联。当与具有ag基因型的猫的baib浓度对比时，具有aa基因型的猫的baib浓度增加。与具有ag和aa基因型的猫的baib浓度相比，具有gg基因型的猫的baib浓度最低。表1示出了baib的相对浓度。
[0049]
表1
[0050]
基因型aaaggg猫数量n＝30n＝167n＝248草酸钙结石形成的发病率23.3％12.6％8.5％以相对单位表示的baib浓度6.83.01.7
[0051]
在每个基因型内分析草酸钙结石形成的发病率与baib浓度之间的关联。每个基因型内患上草酸钙结石的猫比所述基因型中的非结石形成猫的baib浓度更高(表2)。使用每种基因型作为单元，在结石形成猫中，baib浓度平均增加38％。
[0052]
表2
[0053][0054]
具有最高baib的基因型(aa基因型)经历了最高结石形成水平(表1)，并且在每个基因型内，结石形成猫的baib浓度较高(表2)。由于草酸钙结石形成的发病率较高，因此在agxt2基因中携带a等位基因的猫的健康状况存在显著降低。草酸钙结石形成的较高发病率与baib的循环浓度增加有关。本文所提供的方法减少并且由此改善了具有aa和ag基因型的猫科动物的baib水平。所述治疗涉及降低与此多态性相关联的草酸钙结石的发病率。
[0055]
具有在猫科动物agtx2基因下游的snp a1_212891692(felcat8)的特定基因型的个体猫科动物为评估猫科动物的草酸钙结石形成的可能性或预测猫科动物中草酸钙结石形成的相对风险提供了准确的基础。作为snp a1_212891692(felcat8)的猫科动物遗传多态性可以用于鉴定患上草酸钙结石的风险增加的猫。纯合次要等位基因基因型aa也可以被
称为双次要等位基因基因型或aa基因型。杂合主要-次要等位基因基因型ag也可以被称为主要-次要等位基因基因型或ag基因型。纯合主要等位基因基因型gg也可以被称为双主要等位基因基因型或gg基因型。
[0056]
基因型与患上草酸钙结石的可能性之间存在关联。与具有gg基因型的猫相比，具有aa或ag基因型的猫患上草酸钙结石的风险增加。在两个较高风险基因型之间，与具有ag基因型的猫相比，具有aa基因型的猫患上草酸钙结石的风险增加。因此，患上草酸钙结石的可能性或风险的次序为具有aa基因型的猫的风险或可能性最高，并且也可以被称为是高风险或高可能性。具有gg基因型的猫的风险或可能性最低，并且也可以被称为低风险或低可能性。具有ag基因型的猫的风险或可能性中等(intermediate/medium)。
[0057]
因此，通过分析来自猫科动物受试者的样品并鉴定次要等位基因a的一个或两个拷贝，可以将所述猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的风险增加。基因型ag和aa患上草酸钙结石的风险增加。被鉴定为具有次要等位基因a的两个拷贝，即aa基因型的猫科动物受试者可以被称为患上草酸钙结石的风险高或可能性高。被鉴定为具有次要等位基因a的一个拷贝，即ag基因型的猫科动物受试者可以被称为患上草酸钙结石的风险或可能性中等(moderate/medium/intermediate)。被鉴定为具有次要等位基因a的零个拷贝，即gg基因型的猫科动物受试者可以被称为患上草酸钙结石的风险低或可能性低。
[0058]
基因型与baib水平之间存在关联。具有aa基因型的猫的baib浓度最高。具有gg基因型的猫的baib浓度最低。与具有gg基因型的猫相比，具有ag基因型的猫的baib浓度通常更高，并且具有aa基因型的猫的baib浓度更低。
[0059]
通过减少饮食氨基酸精氨酸，具有agxt2多态性的aa或ag基因型的猫经历显着的益处。饮食氨基酸精氨酸的减少导致具有agxt2多态性的aa或ag基因型的猫的较低baib水平并且草酸钙结石形成的发病率降低。被喂食低精氨酸饮食的猫患上草酸钙结石的风险降低或可能性降低。
[0060]
因此，提供了用于通过检测aa或ag基因型来将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的风险或可能性增加的方法。提供了用于分别通过检测aa、ag或gg基因型来将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的风险或可能性高、患上草酸钙结石的风险或可能性中等或患上草酸钙结石的风险或可能性低的方法。提供了用于通过检测aa或ag基因型来将猫科动物受试者鉴定为可能从减少患上草酸钙结石的可能性的低精氨酸饮食治疗中受益的猫科动物受试者。相反地，用于将猫科动物受试者鉴定为不是可能从减少患上草酸钙结石的可能性的低精氨酸饮食治疗中受益的猫的方法可以包括检测gg基因型。还提供了用于通过a)将猫科动物受试者鉴定为可能从此类治疗中受益的猫科动物受试者，其中所述猫科动物受试者被鉴定为具有aa或ag基因型，以及b)向猫科动物受试者喂食具有降低水平的饮食氨基酸精氨酸的饮食来降低患上草酸钙结石的可能性的方法。
[0061]
参考基因组felcat8中的snp a1_212891692(以前被称为参考基因组felcat5中的snp a1_212069607)
[0062]
snp a1_212891692是指猫科动物参考基因组felcat8中列出的agxt2基因下游的猫科动物染色体a1序列的snp。在此数据库中，snp a1_212891692是指染色体a1碱基位置212891692。snp a1_212891692位于agxt2基因下游的序列中。
[0063]
felcat8是改进的猫参考基因组，其使用猫的新dna序列重新组装。felcat5是先前
的猫参考基因组。参考基因组felcat8中的snp a1_212891692对应于以前被称为参考基因组felcat5中的snp a1_212069607的snp。felcat5中包含snp的序列在felcat8中更新。felcat8序列更完整。
[0064]
snp a1_212891692是指位于felcat8中的染色体a1碱基位置212891692上的snp。(felcat8中的snp a1_212891692是felcat5中的snp a1_212069607，其是指felcat5染色体a1碱基位置212069607。)
[0065]
seq id no:1是包含snp a1_212891692的felcat8中的序列。seq id no:1是felcat8中的chra1:212891592-212891792。
[0066]
》felcat8_dna范围＝chra1:212891592-212891792 5'垫＝0 3'垫＝38链＝ 重复掩模＝无
[0067]
seq id no:1：
[0068]
atatgttagt atctctacat gtgggagaac cagatgtcag 40
[0069]
gttcatgtat gatacagcag gaagaacaca gcacggcctt 80
[0070]
tgaagtattc ctgtttatag[a/g]aataattct ttcatatgca 120
[0071]
ggtacgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 160
[0072]
tgtgtatttt ataaaggtag ctactcctta ttcatagata t 201
[0073]
在seq id no:1中，snp在(201的)位置101处，其对应于位置212891692处的染色体a1。seq id no:1含有100个snp的5'核苷酸和100个snp的3'核苷酸。seq id no:1的核苷酸101处的snp(染色体a1 felcat8的位置212891692)以次要等位基因a和主要等位基因g作为替代核苷酸显示。
[0074]
如本文所使用的，当提及作为本文所提及的多态性和基因分型的主题的snp时，snp a1_212891692旨在指felcat8和felcat5(snp a1_212069607)中呈现的相同snp。在felcat8中，snp位于染色体1、位置212891692处；在felcat5中，snp位于染色体1、位置212069607处。
[0075]
基于个体猫科动物的基因组中的snp检测的存在一个a等位基因和一个g等位基因(ag基因型)或存在两个a等位基因(aa基因型)可以用于将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险较高。
[0076]
通过指示猫科动物受试者具有aa或ag基因型的基因分型结果，所述猫科动物受试者被鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险较高的猫。为了对猫科动物受试者进行基因分型，在一些实施例中，可以询问来自猫科动物受试者的样品是否存在g等位基因和a等位基因两者。存在g等位基因且不存在a等位基因的检测指示gg基因型。存在g等位基因和a等位基因的检测指示ag基因型。不存在g等位基因且存在a等位基因的检测指示aa基因型。在一些实施例中，可以询问来自猫科动物受试者的样品是否仅存在g等位基因；由此仅间接地确定是否存在a等位基因。不存在g等位基因的检测指示aa基因型。
[0077]
通过询问从猫科动物受试者获得的生物样品中是否存在snp a1_212891692主要等位基因g和snp a1_212891692次要等位基因a，从而提供用于确定猫科动物受试者具有gg基因型、ag基因型或aa基因型，将猫科动物受试者鉴定为患上草酸钙结石的可能性或风险更高的猫。可替代地，可以询问从猫科动物受试者获得的生物样品中是否仅存在snp a1_212891692主要等位基因g的两个拷贝。在此类情况下，检测snp a1_212891692主要等位基
因g的零拷贝是两个aa的间接检测，并且因此是aa基因型。当仅询问主要等位基因g时，检测到主要等位基因g的存在指示猫科动物受试者具有gg基因型或ag基因型；因此，其仅在本发明的上下文中可用作鉴定属于最高风险组的具有aa基因型的受试者的方法。
[0078]
本领域技术人员可以使用在来自参考基因组的序列中公开的坐标来确定受试者的基因型。提供了确定关于单核酸多态性snp a1_212891692的基因型的方法。本领域技术人员可以使用本文提供的信息来确定个体猫科动物的基因型。在一些实施例中，用于执行基因型分析的样品是基因组dna样品。在一些实施例中，所述样品从猫科动物受试者的血液、唾液、毛囊根、鼻拭子或口腔拭子获得。在一些实施例中，生物样品是使用可商购获得的试剂盒，如performagene pg-100口腔样品收集试剂盒(宾夕法尼亚州伯利恒dna genotek公司，奥瑞许科技公司(dna genotek,orasure technologies,inc.,bethlehem,pa))从猫科动物受试者获得的基因组dna样品。用于确定存在或不存在作为单个snp的特定等位基因的优选方法是使用等位基因特异性荧光探针来测定样品中存在哪些变体的基于pcr的测定。
[0079]
在一些实施例中，可以使用包含选自以下的至少一种核酸分析技术的方法来测定个体猫的snp a1-212069607的基因型：dna测序、限制酶消化、聚合酶链反应(pcr)、杂交、实时pcr、逆转录酶pcr或连接酶链反应。
[0080]
在一些实施例中，可以通过执行选自由以下组成的组的至少一种核酸分析技术来测定个体猫的snp a1-212069607的基因型：使用全基因组snp芯片进行分析；单链构象多态性(sscp)测定；限制片段长度多态性(rflp)；自动荧光测序；钳制变性凝胶电泳(cdge)；变性梯度凝胶电泳(dgge)；迁移率变动分析限制酶分析；异源双链分析；化学错配切割(cmc)；rna酶保护测定；使用识别核苷酸错配的多肽；等位基因特异性pcr；序列分析；和snp基因分型。
[0081]
在一些实施例中，可以使用选自由以下组成的方法类型的方法来确定个体猫的snp a1-212069607的基因型：基于杂交的方法、基于酶的方法、基于dna的物理特性的扩增后方法和测序方法。
[0082]
在一些实施例中，可以使用选自由以下组成的方法类型的方法来确定个体猫的snp a1-212069607的基因型：选自由以下组成的组的基于杂交的方法：动态等位基因特异性杂交、分子信标方法和snp微阵列；选自由以下组成的组的基于酶的方法：限制片段长度多态性(rflp)、基于pcr的方法、瓣状内切核酸酶、引物延伸方法、5'-核酸酶和寡核苷酸连接测定；选自由以下组成的组的基于dna的物理特性的扩增后方法：单链构象多态性、温度梯度凝胶电泳、变性高效液相色谱、高分辨率扩增子熔融、dna错配结合蛋白、snplex和surveyor核酸酶测定；以及测序方法。
[0083]
在一些实施例中，可以使用含有遗传标志物的高密度阵列以询问snp a1-212069607是否存在主要和/或次要等位基因的零个、一个或两个拷贝来确定个体猫的snp a1-212069607的基因型。在一些实施例中，可以使用低密度阵列。在一些实施例中，除了询问样品关于snp a1-212069607的基因型之外，可以使用含有能够检测多种snp的遗传标志物的高密度阵列来执行其它snp分析和检测。
[0084]
可以使用基于杂交的方法执行基因型分析。基于杂交的方法的实例包含动态等位基因特异性杂交、采用分子信标的方法以及采用包含高密度寡核苷酸snp阵列或低密度寡
核苷酸snp阵列的snp微阵列的方法。snp可以通过将互补dna探针与snp位点杂交来询问。在动态等位基因特异性杂交中，基因组区段被扩增并且通过与生物素化引物的pcr反应连接到珠粒。然后将扩增产物连接到链霉亲和素柱，并洗涤以去除未生物素化的链。然后，在存在与双链dna结合时发出荧光的分子的情况下添加等位基因特异性寡核苷酸。随着温度增加对强度进行测量，直到可以测定熔融温度(tm)。通过低于预期的tm来检测snp。特异性工程化的单链寡核苷酸探针用于使用分子信标的snp检测。寡核苷酸被设计成其中互补区在每个末端处，并且探针序列位于其之间，使得探针在其自然、孤立的状态下呈现发夹或茎环结构。使荧光团与探针的一个末端连接，使荧光淬灭剂与另一个末端连接。当寡核苷酸呈发夹构型并且分子不发射荧光时，荧光团紧邻淬灭剂。探针序列与测定中使用的基因组dna互补。如果分子信标的探针序列在测定期间遇到其靶基因组dna，则所述探针序列将粘接并杂交。寡核苷酸将不再假定发夹构型并且发出荧光。高密度寡核苷酸snp阵列包括数十万个排列在小芯片上的探针，从而允许同时询问多个snp。被设计成使snp位点在若干个不同位置以及含有snp等位基因错配的若干冗余探针用于询问每个snp。靶dna与这些冗余探针中的每个冗余探针的不同杂交量允许确定特定的纯合和杂合等位基因。
[0085]
可以使用基于酶的方法执行基因型分析。可以采用广泛的酶，包含dna连接酶、dna聚合酶和核酸酶。基于酶的方法的实例包含基于限制片段长度多态性(rflp)的方法、基于pcr的方法、利用瓣状内切核酸酶的方法；利用引物延伸的方法、利用5'-核酸酶的方法和包含寡核苷酸连接测定的方法。检测snp的rflp方法使用许多不同的限制内切核酸酶来消化基因组样品。可以通过凝胶测定来测定片段长度，从而确定酶是否切割预期限制位点。rflp测定被设计成包含在存在或不存在snp的情况下切割的酶，并且片段长度的模式可以用于确定存在或不存在snp。基于pcr的方法包含四引物扩增阻滞阻碍突变系统pcr或arms-pcr以及多个qpcr反应。四引物扩增阻滞突变系统pcr或arms-pcr采用两对引物在一个pcr反应中扩增两个等位基因。引物被设计成使得两个引物对在snp位置处重叠，但各自与仅可能的snp之一完美匹配。可替代地，可以用单独靶向每个等位基因的不同引物组运行多个qpcr反应。一些实施例利用瓣状内切核酸酶(fen)，所述fen是催化结构特异性切割的内切核酸酶。此切割对错配高度敏感，并且可以用于以高度特异性询问snp。被称为切割酶的fen与两个特异性寡核苷酸探针组合，与靶dna一起，可以形成由切割酶识别的三联结构。被称为侵入物寡核苷酸的第一探针与靶dna的3'端互补。侵入物寡核苷酸的最后一个碱基是与靶dna中的snp核苷酸重叠的非匹配碱基。第二探针是等位基因特异性探针，其与靶dna的5'端互补，但也延伸超过snp核苷酸的3'侧。等位基因特异性探针将含有与snp核苷酸互补的碱基。
[0086]
引物延伸是两步骤过程，其首先涉及探针与紧邻snp核苷酸上游的碱基的杂交，随后为“微型测序”反应，其中dna聚合酶通过添加与snp核苷酸互补的碱基来延伸杂交引物。检测到此并入的碱基并且确定snp等位基因。引物延伸方法用于多种测定格式。这些格式使用包含maldi-tof质谱法(参见西格诺公司(sequenom))和elisa样方法的宽范围的检测技术。西格诺公司的iplex snp基因分型方法使用massarray质谱仪。引物延伸的灵活性和特异性使其适合于高通量分析。引物延伸探针可以排列在载玻片上，从而允许立即对许多snp进行基因型分析。被称为阵列引物延伸(apex)的此技术与基于探针的差异杂交的方法相比有若干个优点。
[0087]
若干种基因型分析方法基于dna的物理特性，如熔融温度和单链构象。使用单链构
象的方法基于折叠成三级结构的单链dna(ssdna)。构象是序列依赖性的，并且大多数单碱基对突变将改变结构的形状。当应用于凝胶时，三级形状将确定ssdna的迁移率，从而提供区分snp等位基因的机制。此方法首先涉及靶dna的pcr扩增。使用热和甲醛使双链pcr产物变性以产生ssdna。将ssdna施加到非变性电泳凝胶上，并且允许其折叠成三级结构。dna序列的差异将改变三级构象，并且被检测为ssdna链迁移率的差异。温度梯度凝胶电泳(tgge)或温度梯度毛细管电泳(tgce)方法基于以下原理：部分变性的dna在凝胶或其它多孔材料中受到更大限制且行进较慢。在另一种方法中，变性高效液相色谱(dhplc)使用反相hplc来询问snp。在dhplc中，对单链和双链dna具有差异亲和力的固相。使用的另一种方法是整个扩增子的高分辨率熔融。dna错配结合蛋白也可以用于检测snp。来自水生栖热菌(thermus aquaticus)的muts蛋白以不同的亲和力结合不同的单核苷酸错配，并且可以用于毛细管电泳以区分所有六组错配。snplex是应用生物系统公司(applied biosystems)销售的专有基因分型平台。surveyor核酸酶测定使用识别所有碱基取代和小插入/缺失(插入缺失)的surveyor核酸酶，即错配内切核酸酶，并且切割两个dna链中错配位点的3'侧。测序技术也可以用于snp检测。测序技术的进展使通过测序进行snp检测变得更实用。
[0088]
使用下一代测序技术通过测序进行基因分型已成为通常的实践。通过测序进行基因分型，也被称为gbs，是发现单核苷酸多态性(snp)以便执行基因分型研究的方法，如全基因组关联研究(gwas)。gbs使用限制酶来降低基因组复杂性并且对多个dna样品进行基因分型。消化后，进行pcr以增加片段池，并且然后使用下一代测序技术对gbs文库进行测序。随着下一代测序技术(如illumina短读段边合成边测序和pacbio的单分子实时测序)的进展，进行gbs变得越来越可行。在未来，如纳米孔单一分子测序等新技术的开发可以允许全基因组测序/基因分型。
[0089]
baib浓度
[0090]
如上所述，baib浓度与基因型相关联。与具有ag和gg基因型的猫相比，具有aa基因型的猫的baib浓度最高，并且与具有gg基因型的猫相比，具有ag基因型的猫的baib浓度更高。如上所述，与具有gg基因型的猫相比，具有aa和ag基因型的猫科动物受试者患上草酸钙结石的风险增加或可能性增加。因此，与gg基因型的baib浓度较低的猫相比，baib浓度较高的猫科动物受试者，如在具有aa和ag基因型的猫科动物受试者中发现的那些猫科动物受试者患上草酸钙结石的风险增加或可能性增加。baib水平可以用作用于鉴定患上草酸钙结石的风险增加或可能性增加的猫科动物受试者以及用于鉴定患上草酸钙结石的风险没有增加或可能性没有增加的猫科动物受试者的替代标志物。baib水平可以用作用于鉴定将从涉及用于减少患上草酸钙结石的可能性的低精氨酸饮食的治疗中受益的猫科动物受试者，以及用于鉴定不会从涉及用于减少患上草酸钙结石的可能性的低精氨酸饮食的治疗中受益的猫科动物受试者的替代标志物。减少猫科动物受试者将患上草酸钙结石的可能性的方法可以包括通过检测猫科动物受试者的baib浓度并将所述baib浓度与阳性参考值或阳性对照进行比较，将猫科动物受试者鉴定为将从涉及用于减少患上草酸钙结石的可能性的低精氨酸饮食的治疗中受益的猫科动物受试者。然后，向被鉴定为将从所述治疗中受益的猫的猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食。
[0091]
可以使用以下方法在以下样品中的任一样品中检测baib。
[0092]
表1和2提供了用于各种基因型的平均baib浓度。此类信息可以用于建立阳性参考
baib浓度值。来自猫科动物受试者的样品中的可检测baib浓度等于或大于阳性参考baib浓度值指示所述猫科动物受试者将从使用低精氨酸饮食以减少猫科动物受试者患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。阳性参考baib浓度值将充当阈值，其中检测到的水平等于或大于所述阈值将指示猫科动物受试者将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益，并且检测到的水平小于所述阈值将指示猫科动物受试者将不会从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。也可以建立阴性参考baib浓度值以充当阈值，其中检测到的水平等于或小于此类阴性参考baib浓度值将指示猫科动物受试者将不会从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。当为更多受试者生成另外的数据时，将持续微调识别阳性参考baib浓度值和任何阴性参考baib浓度值的精度和准确性。
[0093]
除了使用表1和2中的数据建立阳性参考baib浓度值之外，所述数据还可以用于制备阳性对照baib浓度样品。阳性对照样品可以是以对应于阈值浓度的浓度用baib加标的生物样品，用于确定猫科动物受试者是否将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。优选地将确定来自猫科动物受试者的样品和阳性对照的baib浓度以使结果更可靠。在来自猫科动物受试者的样品中检测到的水平等于或大于阳性对照指示所述猫科动物受试者将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。在来自猫科动物受试者的样品中检测到的水平小于阳性对照指示所述猫科动物受试者将不会从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。也可以制备阴性对照baib浓度样品以充当具有阈值浓度的阴性对照，其中检测到的水平等于或小于阴性对照baib浓度样品中的baib浓度将指示猫科动物受试者将不会从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。阴性对照样品可以通过对如不具有baib的生物样品等样本加标来制备。当为更多受试者生成另外的数据时，将持续微调识别阳性参考baib浓度值和任何阴性参考baib浓度值的精度和准确性，并且此类信息用于改进阳性对照baib浓度样品和阴性对照baib浓度样品。
[0094]
减少患上草酸钙结石的可能性的治疗的方法可以包括使用对来自猫科动物受试者的样品中的baib浓度的检测、将检测到的水平与阳性参考值或阳性对照测定(其中在阳性对照baib浓度样品中测量baib浓度)的结果进行比较来将所述猫科动物受试者鉴定为将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益的猫。向使用此类方法被鉴定为将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益的猫的猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性。
[0095]
2-氧代精氨酸浓度
[0096]
除了baib浓度之外，2-氧代精氨酸浓度与基因型相关联。与具有ag和gg基因型的猫相比，具有aa基因型的猫的2-氧代精氨酸浓度最低，并且与具有gg基因型的猫相比，具有ag基因型的猫的2-氧代精氨酸浓度更低(参见表16)。如上所述，与具有gg基因型的猫相比，具有aa和ag基因型的猫科动物受试者患上草酸钙结石的风险增加或可能性增加。因此，与gg基因型的2-氧代精氨酸浓度较高的猫相比，2-氧代精氨酸浓度较低的猫科动物受试者，如在具有aa和ag基因型的猫科动物受试者中发现的那些猫科动物受试者患上草酸钙结石的风险增加或可能性增加。2-氧代精氨酸水平可以用作用于鉴定患上草酸钙结石的风险增加或可能性增加的猫科动物受试者以及用于鉴定患上草酸钙结石的风险没有增加或可能
性没有增加的猫科动物受试者的替代标志物。2-氧代精氨酸水平可以用作用于鉴定将从涉及用于减少患上草酸钙结石的可能性的低精氨酸饮食的治疗中受益的猫科动物受试者，以及用于鉴定不会从涉及用于减少患上草酸钙结石的可能性的低精氨酸饮食的治疗中受益的猫科动物受试者的替代标志物。减少猫科动物受试者将患上草酸钙结石的可能性的方法可以包括通过检测猫科动物受试者的2-氧代精氨酸浓度并将所述baib浓度与阳性参考值或阳性对照进行比较，将猫科动物受试者鉴定为将从涉及用于减少患上草酸钙结石的可能性的低精氨酸饮食的治疗中受益的猫科动物受试者。然后，向被鉴定为将从所述治疗中受益的猫的猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食。
[0097]
可以使用熟知的方法在样品中检测2-氧代精氨酸。表16和2提供了用于各种基因型的平均2-氧代精氨酸浓度。此类信息可以用于建立阳性参考2-氧代精氨酸浓度值。来自猫科动物受试者的样品中的可检测2-氧代精氨酸浓度等于或小于阳性参考2-氧代精氨酸浓度值指示所述猫科动物受试者将从使用低精氨酸饮食以减少猫科动物受试者患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。阳性参考2-氧代精氨酸浓度值可以充当阈值，其中检测到的水平等于或小于所述阈值将指示猫科动物受试者将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。也可以建立阴性参考2-氧代精氨酸浓度值以充当阈值，其中检测到的水平等于或大于此类阴性参考2-氧代精氨酸浓度值将指示猫科动物受试者将不会从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。当为更多受试者生成另外的数据时，将持续微调识别阳性参考2-氧代精氨酸浓度值和任何阴性参考2-氧代精氨酸浓度值的精度和准确性。
[0098]
除了使用表16中的数据建立阳性参考2-氧代精氨酸浓度值之外，所述数据还可以用于制备阳性对照2-氧代精氨酸浓度样品。阳性对照样品可以是以对应于阈值浓度的浓度用2-氧代精氨酸加标的生物样品，用于确定猫科动物受试者是否将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。优选地将确定来自猫科动物受试者的样品和阳性对照的2-氧代精氨酸浓度以使结果更可靠。在来自猫科动物受试者的样品中检测到的水平等于或小于阳性对照指示所述猫科动物受试者将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。也可以制备阴性对照2-氧代精氨酸浓度样品以充当具有阈值浓度的阴性对照，其中检测到的水平等于或小于阴性对照2-氧代精氨酸浓度样品中的2-氧代精氨酸浓度将指示猫科动物受试者将不会从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益。阴性对照样品可以通过对如不具有2-氧代精氨酸的生物样品等样本加标来制备。当为更多受试者生成另外的数据时，将持续微调识别阳性参考2-氧代精氨酸浓度值和任何阴性参考2-氧代精氨酸浓度值的精度和准确性，并且此类信息用于改进阳性对照2-氧代精氨酸浓度样品和阴性对照2-氧代精氨酸浓度样品。
[0099]
减少患上草酸钙结石的可能性的治疗的方法可以包括使用对来自猫科动物受试者的样品中的2-氧代精氨酸浓度的检测、将检测到的水平与阳性参考值或阳性对照测定(其中在阳性对照2-氧代精氨酸浓度样品中测量2-氧代精氨酸浓度)的结果进行比较来将所述猫科动物受试者鉴定为将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益的猫。向使用此类方法被鉴定为将从使用低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性的治疗中受益的猫的猫科动物受试者喂食低精氨酸饮食以减少患上草酸钙结石的可能性。
[0100]
组合物和调配物
[0101]
上文概述的方法的应用已经鉴定了已组合以提供组合物、食物和饮食的生物活性饮食组分，所述组合物、食物和饮食为已鉴定为将从减少草酸钙结石形成的可能性的治疗中受益的猫提供显著的益处。提供喂食低精氨酸饮食可以显著降低具有aa或ag基因型的猫科动物受试者中草酸钙结石形成的风险。
[0102]
食物产品是针对成年猫科动物的营养全面的饮食。在特定方面，食物产品是为成年伴侣猫科动物调配的营养全面的饮食。
[0103]
在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物包含含有少于1.84％或更少的精氨酸的食物组合物。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物包含含有1.04％-1.84％的精氨酸的食物组合物。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物包含含有1.21％或更少的精氨酸的食物组合物。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物包含含有1.11％或更少的精氨酸的食物组合物。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物包含含有少于1.04％的精氨酸的食物组合物。所述组合物可以包括按以干物质为基础的组合物的总重量计4％到75％或更多的量的蛋白质，按以干物质为基础的组合物的总重量计5％到50％或更多的量的脂肪，以及按以干物质为基础的组合物的总重量计5％到75％或更多的碳水化合物，其中所述食物组合物适合由猫食用。
[0104]
在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，营养全面且均衡的低精氨酸(即，)猫食物组合物可以包括1.84％或更少的精氨酸、或1.21％或更少的精氨酸、或1.11％或更少的精氨酸、或少于1.04％的精氨酸或介于1.04％-1.84％之间的精氨酸，并且可以进一步包括4重量％到90重量％、5重量％到75重量％、10重量％到60重量％的蛋白质以及15重量％到50重量％的蛋白质；0重量％到90重量％、2重量％到80重量％、5重量％到75重量％和10重量％到50重量％的碳水化合物；2重量％到60重量％、5重量％到50重量％和10重量％到35重量％的脂肪。所述组合物可以进一步含有0重量％到15重量％或2重量％到8重量％的维生素和矿物质、抗氧化剂以及支持动物的营养需求的其它营养物。
[0105]
适合包含在组合物中并且特别是在以本文所提供的方法施用的食物产品中的蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素、矿物质、平衡剂等的来源可以选自本领域普通技术人员已知的那些常规材料。
[0106]
在一些实施例中，可用作食物组合物的成分的蛋白质可以包括来自动物来源的蛋白质，如动物蛋白，包含哺乳动物蛋白、禽类蛋白、爬行动物蛋白、两栖动物蛋白、鱼类蛋白、无脊椎动物蛋白和其组合；例如，来自牛、绵羊、猪、山羊、鹿、兔、马、袋鼠、其乳汁、凝乳、乳清或血液以及内部组织和器官，如平滑肌、横纹肌、肝脏、肾脏、肠或心脏中任一项；其它禽类蛋白来源涵盖火鸡、鹅、鸭、鸵鸟、鹌鹑、鸽子、其蛋和内部组织和器官，如平滑肌、横纹肌、肝脏、肾脏、肠或心脏；两栖动物来源包含青蛙或蝾螈，爬行动物蛋白来源包含短吻鳄、蜥蜴、乌龟和蛇；鱼类蛋白来源包含鲶鱼、鲱鱼、鲑鱼、金枪鱼、鲹鱼、鳕鱼、大比目鱼、鳟鱼、剑鱼和其卵；并且无脊椎动物蛋白来源包含龙虾、螃蟹、蛤蜊、贻贝或牡蛎和其组合、肉蛋白分离物、乳清蛋白分离物、卵蛋白、其混合物等，以及植物来源，如大豆蛋白分离物、玉米麸质粉、小麦面筋、其混合物等。
[0107]
在一些实施例中，可用作食物组合物的成分的碳水化合物可以包含但不限于玉
米、全黄玉米、高梁、小麦、大麦、大米、小米、酿酒米、去壳燕麦以及在水解时代谢为能量的多糖(例如，淀粉和糊精)和糖(例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖、葡萄糖和果糖)中的一种或多种。适合于包含在本文所公开的组合物中的另外的碳水化合物来源的实例包含水果和非番茄渣蔬菜。
[0108]
可用作食物组合物的成分的脂肪可以来自任何来源，如但不限于家禽脂肪、牛脂、猪油、精选白色油脂、大豆油、玉米油、菜籽油、葵花油、其混合物等。脂肪可以完全并入食物组合物中、沉积在食物组合物的外部或两种方法的混合。
[0109]
在一些实施例中，组合物进一步包含有效量的选自由以下组成的组的一种或多种物质：氨基葡萄糖、软骨素、硫酸软骨素、甲基磺酰甲烷(“msm”)、肌酸、抗氧化剂、新西兰绿唇贻贝(perna canaliculus)、ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸和其混合物。
[0110]
在一些实施例中，食物组合物进一步包含一种或多种氨基酸，如但不限于精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸(包含dl-甲硫氨酸和l-甲硫氨酸)、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸、牛磺酸、肉碱、丙氨酸、天冬氨酸、胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸、酪氨酸和羟基脯氨酸。
[0111]
在一些实施例中，食物组合物进一步包括一种或多种脂肪酸，如但不限于月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈烯酸、十七烷酸(margaric acid)、十七碳一烯酸(margaroleic acid)、硬脂酸、油酸、亚油酸、g-亚麻酸、a-亚麻酸、亚麻油酸、花生酸、鳕油酸、dhgla、花生四烯酸、二十碳四烯酸(eicossatetra acid)、epa、山嵛酸、芥酸、二十二碳四烯酸(docosatetra acid)和dpa。
[0112]
在一些实施例中，食物组合物进一步包括一种或多种大量营养物，如但不限于水分、蛋白质、脂肪、粗纤维、灰分、膳食纤维、可溶性纤维、不溶性纤维、棉子糖和水苏糖。
[0113]
在一些实施例中，食物组合物进一步包括一种或多种微量营养物，如但不限于β-胡萝卜素、α-硫辛酸、氨基葡萄糖、硫酸软骨素、番茄红素、叶黄素和槲皮素。
[0114]
在一些实施例中，食物组合物进一步包括一种或多种矿物质，如但不限于钙、磷、钾、钠、氯化物、铁、铜、铜、锰、锌、碘、硒、硒、钴、硫、氟、铬、硼和草酸盐。
[0115]
在一些实施例中，食物组合物进一步包括一种或多种其它维生素，如但不限于维生素a、维生素c、维生素d、维生素e、藜麦粒、硫胺素、核黄素、烟酸、吡哆醇、泛酸、叶酸、维生素b12、生物素和胆碱。
[0116]
在一些实施例中，食物组合物进一步包括纤维，所述纤维可以从各种来源供应，包含例如植物纤维来源，如纤维素、甜菜浆、花生壳和大豆纤维。
[0117]
在一些实施例中，食物组合物进一步包括稳定物质，例如倾向于增加组合物的保质期的物质。此类物质的潜在合适实例包含例如防腐剂、抗氧化剂、增效剂和螯合剂、包装气体、稳定剂、乳化剂、增稠剂、胶凝剂和润湿剂。乳化剂和/或增稠剂的实例包含例如明胶、纤维素醚、淀粉、淀粉酯、淀粉醚和改性淀粉。
[0118]
在一些实施例中，食物组合物进一步包括用于着色、适口性和营养目的的添加剂，包含例如着色剂；氧化铁、氯化钠、柠檬酸钾、氯化钾和其它食用盐；维生素；矿物质；和调味剂。组合物中此类添加剂的量通常为至多5％(组合物的干基)。
[0119]
组合物的制备
[0120]
低精氨酸组合物可以制备为适合猫食用的食物产品。这些食物产品可以具有任何
稠度或水分含量；即，组合物可以是湿的、半湿的或干的食物产品。“湿”食物产品通常是水分含量为60％到90％或更大的那些食物产品。“干”食物产品通常是水分含量为3％到11％的那些食物产品，并且通常以小块或粗磨粒的形式制造。“半湿”食物产品的水分含量通常为25％到35％。食物产品还可以包含具有多于一种稠度的组分，例如软的、耐嚼的像肉的颗粒或碎片，以及具有外部谷类组分或涂层和内部“奶油”组分的粗磨粒。
[0121]
可以使用本领域普通技术人员已知的常规食物制备过程以罐装或湿形式制备低精氨酸食物产品。通常，将地面动物蛋白质组织与其它成分和水以足以用于加工的量混合，所述其它成分如谷物、合适的碳水化合物源、脂肪、油和平衡成分，包含特殊用途添加剂，如维生素和矿物质混合物、无机盐、纤维素、甜菜浆等。将所述成分在适合于加热的容器中混合，同时混合组分。使用任何合适的方式，例如直接蒸汽喷射或使用装配有热交换器的容器加热混合物。在添加调配物的所有成分后，将混合物加热到50℉到212℉的温度。虽然可以使用超出此范围的温度，但如果不使用其它加工助剂，则所述超出此范围的温度可能在商业上不实用。当加热到适当的温度时，材料通常会呈粘稠液体的形式，然后分配到罐中。盖上盖子并且将容器气密密封。然后将密封罐放置在设计用于内容物消毒的常规设备中。取决于使用的温度、组合物的性质和相关因素，通常通过加热到高于230℃的温度持续适当的时间来完成灭菌。本发明的组合物和食物也可以在其制备之前、期间或之后添加到食物组合物中或与食物组合物组合。
[0122]
在一些实施例中，可以使用本领域普通技术人员已知的常规过程以干形式制备食物产品。通常，将包含干燥的动物蛋白、植物蛋白、谷物等在内的干成分研磨并混合在一起。添加包含脂肪、油水、动物蛋白、水等的液体或湿成分，与干材料组合。用于组合各种成分的具体调配物、添加顺序、组合以及方法和设备可以选自本领域已知的那些。例如，在某些实施例中，将所得混合物加工成粗磨粒或类似的干碎片，其使用挤出工艺形成，其中干和湿成分的混合物经受高压和高温下的机械加工，被迫穿过小开口或开孔，并且例如用旋转刀切割成粗磨粒。所得粗磨粒可以干燥并且任选地涂覆有包括例如调味剂、脂肪、油、粉末状成分等的一个或多个局部涂层。也可以通过烘烤而不是挤压从生面团制备粗磨粒，其中在干热加工之前将生面团放置到模具中。
[0123]
在制备组合物时，任何成分通常可以在调配物加工期间，例如在组合物的其它组分的混合期间和/或之后并入到组合物中。这些组分到组合物中的分配可以通过常规方式完成。在某些实施例中，地面动物和/或家禽蛋白质组织与其它成分以及用于加工的足够的水混合，所述其它成分包含营养均衡剂、无机盐，并且可以进一步包含纤维素、甜菜浆、膨胀剂等。
[0124]
在一些实施例中，组合物被调配以便更易于咀嚼。在具体实施例中，组合物和食物产品被调配成解决猫之间的特定营养差异，如生命期、年龄、大小、重量、身体组成和繁殖。
[0125]
低精氨酸组合物被调配成营养全面的饮食，以满足成熟成年猫科动物的需求。这些营养全面的饮食包含足够的营养物的饮食，用于维持进行所述饮食的健康猫的正常健康。营养全面且均衡的猫食物组合物是本领域技术人员熟悉的。例如，适用于营养全面且均衡的动物饲料组合物的物质(如营养物和成分)和其推荐量可以在例如佐治亚州亚特兰大美国饲料控制官员协会股份有限公司(aafco)官方出版物,(2012)中找到。
[0126]
本文所提及的所有出版物都是出于描述和公开出版物中所报告的材料和方法的
目的而以引用方式并入本文中，所述材料和方法可以结合本发明一起使用。
[0127]
根据下文提供的详细描述，本发明的另外的应用领域将变得显而易见。应当理解，虽然详细描述和具体实例指示了本发明的优选实施例，但仅出于说明的目的，并不旨在限制本发明的范围。
[0128]
实例
[0129]
实例1
[0130]
完成了一项研究，其中将具有ag基因型的猫与具有纯合gg基因型的猫进行比较。研究使用了34只猫，并且比较了三种食物。所有食物均喂食一个月，并且在一个月的喂食期结束时，分析猫的血液的baib。每只猫食用每种食物，使得每只猫在一个月的喂食期之后具有来自每种食物的血液样品。
[0131]
表3示出了纤维和精氨酸的饮食浓度(以百分数计)。
[0132]
表3
[0133]
饮食纤维精氨酸纤维增加，高精氨酸1.41.84纤维增加，低精氨酸1.31.47低纤维，低精氨酸0.91.44
[0134]
表4示出了研究中猫的相对baib浓度。每个基因型有17只猫。
[0135]
表4
[0136]
饮食ag基因型gg基因型纤维增加，高精氨酸4.71.6纤维增加，低精氨酸3.41.5低纤维，低精氨酸3.71.6
[0137]
如表5中所示出的，食物对具有不同基因型的猫的不同作用在结石形成猫中尤其明显。
[0138]
表5
[0139][0140]
ag基因型中存在显著(p《0.01)下降，并且基因型之间在baib浓度的变化方面存在显著差异(p＝0.02)。这些数据表明在具有ag基因型的猫中，通过减少饮食氨基酸精氨酸，在减少草酸钙结石风险生物标志物baib方面存在显著益处。
[0141]
实例2
[0142]
收集血液以便测定血浆代谢组学曲线。可以通过商业实验室(美国北卡罗来纳州达勒姆metabolon公司(metabolon,durham,nc,usa))测量血浆中的baib和/或2-氧代精氨酸的水平。将提取的上清液分离，并在气相色谱和液相色谱质谱仪平台上运行。baib和/或2-氧代精氨酸中的每一个的峰是已知的，并且每个样品的峰下面积可以归一化到已知样
plasma homocysteine in humans).《动脉硬化、血栓形成与血管生物学(arterioscler thromb vasc biol)》25,379-385公开了用于测量甜菜碱的技术。技术可以被适配并且用于测量来自猫科动物受试者的样品中的甜菜碱水平。
[0143]
实例3
[0144]
从猫科动物获得唾液样品。样品可以在采集时被运送到位于另一个地点的实验室、部分处理并且然后运送到位于另一个地点的实验室或者在实验室和采集地点处完全处理和分析。如果样品在采集时被运送到位于另一个地点的实验室或部分处理并且然后运送到位于另一个地点的实验室，则可能包含实验室从样品中采集的部分或全部数据的结果可能会传送给收集地点和/或兽医和/或猫科动物的所有者或责任方。获得唾液样品后，可以对其进行处理以分析和评估是否存在aa和ag基因型。
[0145]
如果结果指示猫科动物将从本文所提供的治疗中受益，则可以向所述猫科动物喂食低精氨酸饮食。
[0146]
实例4
[0147]
使用performagene pg-100口腔采集试剂盒从猫科动物采集样品。
[0148]
这样做时，所述动物不应在唾液采集前30分钟进食或10分钟前饮水，进行采集的个人不应用海绵刮所述动物的牙齿或脸颊，也不应允许所述动物咀嚼或咬海绵。
[0149]
作为performagene pg-100口腔采集试剂盒的一部分提供的采集管含有保留dna样品的液体，并且实验室需要所述液体来分析样品。在样品采集之前，不应去除盖子。
[0150]
在采集方案的第一步骤中，将海绵放置在动物的口中在颊囊处。通过移动海绵并在唾液自然聚集的地方(颊囊和舌下)擦拭唾液，采集唾液30秒。对于大于6个月的动物，可能需要适度约束。
[0151]
接下来，竖直握住管子，从管子上拧下盖子。将盖子倒置，并且将口腔拭子放置在管子中。拧紧盖子以防止液体样品在运输期间泄漏。将管子倒转并剧烈振荡多次，例如10次，以完全混合样品。
[0152]
可以使用永久性记号笔在管子标签上的空白处清楚地写下动物识别号。
[0153]
使用pg-100采集试剂盒以performagene化学方法采集并保存的performagene
tm
样品的0.5ml等分试样中人工纯化dna的逐步实验室方案如下。人工纯化所需的试剂可用pg-ac1试剂包或pg-ac4试剂包。
[0154]
当采集dna样品并与performagene溶液混合时，dna立即稳定，performagene样品从收集时起在室温下稳定1年。performagene样品可以在-15℃到-20℃下无限期储存，并且可以进行多次冻融循环而不会损坏dna。
[0155]
纯化过程中使用以下设备和试剂：能够以15,000
×
g运行的微量离心机；50℃下的空气或水培育箱；室温下的乙醇(95％到100％)；dna缓冲液：te(10mm tris-hcl，1mm edta，ph 8.0)或类似溶液；任选的糖原(20mg/ml)(例如，英杰公司(invitrogen)目录号10814-010)；室温下的乙醇(70％)和5m nacl溶液。
[0156]
在第一步骤中，通过剧烈摇动5秒来混合样品。这是为了确保粘性样品与performagene溶液正确混合。
[0157]
将样品在50℃空气培育箱中温育至少2小时，或在50℃水培育箱中温育至少1小时。即使没有温育步骤，performagene中的dna在室温下也是稳定的。此热处理步骤对于确
保dna充分释放和核酸酶永久失活至关重要。此温育步骤可以在从动物采集样品之后且在纯化之前的任何时间执行。建议对整个样品进行温育。如果更方便的话，样品可以在50℃下温育过夜。在空气培育箱中需要更长的时间，因为温度平衡比在水培育箱中更慢。
[0158]
任选地，可以去除采集海绵。取下盖子，将采集海绵压在管子内部，以尽可能提取出尽可能多的样品。将海绵和盖子丢弃。海绵去除取决于对工作流的偏好。
[0159]
接下来，将500μl混合的performagene样品转移到1.5ml微量离心管中。剩余的performagene样品可以在室温下储存或冷冻(-15℃到-20℃)。然后将20μl(1/25体积)的pg-l2p纯化剂添加到微量离心管中并通过涡旋几秒钟来混合。当杂质和抑制剂沉淀时，样品变得浑浊。
[0160]
将样品在冰上温育10分钟(可以取代室温温育，但是在去除杂质方面将略微不太有效)，然后在室温下以15,000
×
g离心5分钟。较长的离心周期(至多15分钟)可以有利于降低最终dna溶液的浊度(高a320)。用移液管吸头将透明上清液转移到新鲜的微量离心管中，并丢弃含有浑浊杂质的沉淀。将25μl(1/20体积)的5m nacl添加到500μl上清液中，然后混合。添加nacl是确保dna有效回收所必需的。将600μl室温95％到100％乙醇添加到500μl上清液中，然后通过倒置10次轻轻混合。在与乙醇混合期间，将沉淀dna。取决于样品中dna的量，dna可能会呈现为dna纤维凝块或细沉淀物。即使未观察到凝块，也会仔细遵循后续步骤来回收dna。
[0161]
将样品在室温下静置10分钟，以允许dna完全沉淀。然后将管以已知朝向(离心后dna沉淀可能不可见)放置在离心机中，并且在室温下以＞15,000
×
g离心2分钟。例如，每个管可以放置在微量离心机中，其中盖的铰链部分指向远离转子的中心。离心后，可以定位沉淀物的位置(即使太小而不易被看到)；它将位于铰链下方的管子尖端。
[0162]
用移液管吸头去除上清液并丢弃。沉淀物含有dna。旋转管子，使得沉淀物在上部壁上，这将允许沿下部壁安全地移动移液器吸头，并去除所有上清液。上清液可能含有杂质，并且应尽量完全去除。沉淀物的过度干燥会使dna更难溶解。通过首先添加250μl 70％乙醇，然后将其在室温下静置1分钟来洗涤dna。用移液器吸头去除乙醇，而不干扰沉淀物。70％乙醇洗涤有助于去除残余抑制剂。然而，完全去除乙醇对于防止下游施用期间的抑制至关重要。因此，将管子离心6秒以混合所有剩余的乙醇，并用移液器吸头将其去除。
[0163]
将100μl dna缓冲液(例如te缓冲液)添加到管中以溶解dna沉淀物。涡旋至少5秒有助于溶解过程。为确保dna完全再水化，在室温下静置过夜。现在可以对dna进行定量并且用于下游应用。
[0164]
在定量dna样品中双链dna(dsdna)的量时，使用荧光染料的测定比在260nm处的吸光度更具特异性。为了通过荧光法定量dna，可以使用或green i等荧光染料对dsdna进行定量，因为污染rna的干扰较少。可替代地，可以使用可商购获得的试剂盒，如英杰公司的quant-it
tm picogreen dsdna测定试剂盒(目录号q-33130)。对于任一方案，纯化的dna优选地用te溶液1:50稀释，并且在定量测定中使用5μl。
[0165]
可替代地，dna可以通过吸光度进行定量，在这种情况下，优选首先用rnase处理纯化的样品以消化污染的rna，并且然后通过dna的乙醇沉淀去除rna片段。来自performagene样品的dna通常含有的rna明显多于血液样品中的rna。在读取吸光度之前，确保酒精沉淀的dna完全溶解。在260nm处的吸光度为1.0对应于对于纯dsdna的50ng/μl(50μg/ml)的浓度。
应使用能够读取100μl或更少体积的分光光度计比色皿，避免使用太大体积的样品。在260nm处的吸光度值应介于0.1与1.5之间。更低的值可能不可靠。
[0166]
用90μl te(1/10稀释)稀释经纯化rna酶处理的dna的10μl等分试样，并且通过上下移液轻轻混合。等待气泡清除。te用于参比(空白)池。在320nm、280nm和260nm处测量吸光度。通过从a
280
和a
260
值中减去320nm(a
320
)处的吸光度来计算校正的a
280
和a
260
值。以ng/μl为单位的dna浓度＝校正后的a
260
×
10(稀释因子)
×
50(转换因子)。a
260
/a
280
比率：将校正后的a
260
除以校正后的a
280
。
[0167]
实例5
[0168]
提供降低被鉴定为具有较高可能性或风险患上草酸钙结石的猫的草酸钙结石的可能性的每日饮食。在一些实施例中，方法可以包括向被鉴定为具有snp a1_212891692的aa或ag基因型的猫喂食低精氨酸饮食。在一些实施例中，方法可以包括向被鉴定为baib水平等于或大于参考水平和/或等于或大于在阳性对照样品中测量的水平的猫喂食低精氨酸饮食，所述参考水平对应于被鉴定为从治疗中受益的猫的水平，所述阳性对照样品含有的baib水平对应于被鉴定为从治疗中受益的猫的水平。在一些实施例中，方法可以包括分析来自猫科动物受试者的样品，以确定所述猫科动物受试者是否具有snp a1_212891692的aa或ag基因型。在一些实施例中，方法可以包括分析来自猫科动物受试者的样品，以确定所述样品中的baib水平，并将测得的水平与对应于阳性测试结果的参考水平和/或阳性对照样品中测得的水平进行比较。阳性参考标准值对应于被认为是具有可比较的大小、体重、年龄、品种等的猫的阳性结果的baib水平。
[0169]
实例6
[0170]
以下组合物基于每天提供的总营养。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，精氨酸的量等于1.84％或更小。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，精氨酸的量等于1.21％或更小。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，精氨酸的量等于1.11％或更小。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，精氨酸的量等于小于1.04％。在一些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，精氨酸的量等于介于1.04％-1.84％之间。在某些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物可以包括5％、7.5％、10％、12.5％、15％、17.5％、20％、22.5％或25％的量的鸡肉。在某些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物可以包括4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的量的卵蛋白。在某些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物可以包括6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％的量的玉米麸质粉。在某些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物可以包括0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％、1.6％、1.7％、1.8％或1.9％或2.0％的量的植物来源。在某些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物可以包括0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％或1.5％的量的除番茄渣之外的另外的水果来源。在某些实施例中，按以干物质为基础的组合物的总重量计，组合物可以包括5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的选自小米、酿酒米、去壳燕麦和其组合的碳水化合物。在这些实施例的特定方面，本发明的组合物可以包括在由这些值中的任何两个作为端点定义的
范围内的碳水化合物来源的干重。
[0171]
实例7
[0172]
表6描述了具有包含以1.84％或更少存在的总精氨酸的组合物的比例(组分组合物干重％)的某些实施例，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.21％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.11％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以小于1.04％存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.04％-1.84％存在。
[0173]
表6
[0174][0175]
实例8
[0176]
表7描述了具有包含以1.84％或更少存在的总精氨酸的组合物的比例(组分组合物干重％)的某些实施例，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.21％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.11％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以小于1.04％存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.04％-1.84％存在。
[0177]
表7
[0178]
[0179][0180]
实例9
[0181]
表8描述了具有包含以1.84％或更少存在的总精氨酸的组合物的比例(组分组合物干重％)的某些实施例，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.21％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.11％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以小于1.04％存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.04％-1.84％存在。
[0182]
表8
[0183]
[0184][0185]
实例10
[0186]
表9描述了具有包含以1.84％或更少存在的总精氨酸的组合物的比例(组分组合物干重％)的某些实施例，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.21％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.11％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以小于1.04％存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.04％-1.84％存在。
[0187]
表9
[0188]
[0189][0190]
实例11
[0191]
表10描述了具有包含以1.84％或更少存在的总精氨酸的组合物的比例(组分组合物干重％)的某些实施例，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.21％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.11％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以小于1.04％存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.04％-1.84％存在。
[0192]
表10
[0193][0194][0195]
实例12
[0196]
表11描述了具有包含以1.84％或更少存在的总精氨酸的组合物的比例(组分组合
物干重％)的某些实施例，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.21％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.11％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以小于1.04％存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.04％-1.84％存在。
[0197]
表11
[0198]
成分大约w/w％大约w/w％玉米淀粉31.1048.11水解的鸡肝和鸡心37.0032.00大豆油，粗品，脱胶3.604.66纤维素，粒状—3.94鸡肉，肝脏，分解物，优化剂ldpe h2.002.00乳酸，食用级1.501.50碳酸钙1.221.22磷酸二钙1.221.22精选白色油脂/磷酸1.251.00flav gen#1 cwg1.250.75单硬脂酸甘油酯0.740.74氯化钾0.690.69天然香料、猪肉、肝脏、分解物、d
′
t0.750.50氯化钠，碘化0.440.44氯化胆碱，液体，70％0.380.38甲硫氨酸，dl0.300.30三聚磷酸钠0.150.15维生素预混物0.120.12矿物质，预混物，23050.070.07牛磺酸0.020.02山核桃壳，研磨至多7.00—亚麻籽，整体，褐色至多3.00—甜菜浆，研磨，细至多2.50—蔓越橘渣至多1.00—
[0199]
实例13
[0200]
表12描述了具有包含以1.84％或更少存在的总精氨酸的组合物的比例(组分组合物干重％)的某些实施例，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.21％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.11％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以小于1.04％存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.04％-1.84％存在。
[0201]
表12
[0202]
成分大约w/w％大约w/w％鸡肉茸15.3615.36大米，酿酒米8.648.64蛋，干燥，粒状8.008.00
玉米，麸，粉7.627.62高粱，整体5.005.00精选白色油脂/磷酸4.004.00增味剂，12l，液体3.003.00乳酸，食用级1.501.50大豆油，粗品，脱胶1.051.05增味剂，ite2，干燥1.001.00氯化钾0.890.89氯化钠，碘化0.610.61碳酸钙0.410.41磷酸二钙0.250.25维生素e，油，29％0.170.17氯化胆碱，液体，70％0.160.16矿物质，预混物，23050.060.06色氨酸0.040.04牛磺酸0.040.04纤维素，粒状—1.50玉米，黄色，整体26.0040.00山核桃壳，研磨7.00—亚麻籽，整体，褐色3.00—甜菜浆，研磨，细2.500.50蔓越橘渣1.00—
[0203]
实例14
[0204]
表13描述了具有包含以1.84％或更少存在的总精氨酸的组合物的比例(组分组合物干重％)的某些实施例，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.21％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.11％或更少存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以小于1.04％存在，并且在一些实施例中，总精氨酸以1.04％-1.84％存在。
[0205]
表13
[0206][0207][0208]
实例15
[0209]
表14示出了各种宠物食物成分的精氨酸％。本领域技术人员可以容易地调配合适的猫食物，以提供佐治亚州亚特兰大美国饲料控制官员协会股份有限公司(aafco)官方出版物,(2012)中所公开的猫的每日营养需求。使用在参考文献中指定为表10并且摘录为本文的表14的相关部分的“《家养动物的营养物需求：猫的营养物需求》,修订版,华盛顿哥伦比亚特区国家科学院出版社1986.第63-67页”中的表，本领域技术人员可以容易地调配合
适的猫食物以提供每日营养需求，同时将精氨酸水平限制为按总干重的百分比计，总每日营养摄入的1.04％-1.84％之间，并且在一些实施例中，按总干重的百分比计，精氨酸水平为总每日营养摄入的1.21％或更少，并且在一些实施例中，按总干重的百分比计，精氨酸水平为总每日营养摄入的1.11％或更少。
[0210]
表14
[0211]
[0212]
[0213]
[0214]
[0215]
[0216][0217]
实例16
[0218]
下表15和16中示出了来自上述全基因组关联分析的原始数据，所述数据表明agxt2基因与β-氨基异丁酸盐和2-氧代精氨酸的循环浓度之间存在关系，2-氧代精氨酸是精氨酸转氨作用的产物。
[0219]
原始数据在下表17和18中示出，所述原始数据来自比较喂食不同饮食的动物的β-氨基异丁酸盐的循环浓度的实验。
[0220]
表17
[0221][0222]
表18
[0223][0224]
表17
[0225][0226]
表18
[0227]
再多了解一些
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