一种中药益智EST-SSR标记引物及其应用

一种中药益智est-ssr标记引物及其应用
技术领域
1.本发明涉及分子标记技术领域，特别涉及一种中药益智est-ssr标记引物及其应用。


背景技术：

2.益智alpinia oxyphylla miq.是我国著名四大南药之一，也是一种由中国卫生部公布的重要的药食同源植物。经过长期的人工培育和选择，形成了丰富的变异，但目前对于益智的研究主要集中在化学成分、药理临床、栽培学领域，尚缺少分子机制方面的探索，能从ncbi里检索到的益智分子遗传方面的信息仅限23条从益智叶片基因组dna中开发出来的ssr，其功能基因数据库缺乏，益智的分子生物学及代谢途径研究几乎是空白的。利用益智转录组序列开发est-ssr引物的研究也未见报道。
3.益智药材的质量标准简单，2010年版《中国药典》(一部)
1.中仅规定益智种子含挥发油不得少于1％(ml/g)，而对于其中指标性成分的含量限度暂无规定。不同地域/产地益智药效成分的相对含量具有显著差异。李婷
2.经gc-ms方法分析广东产益智果实发现，香橙烯valencene相对含量最高，为18.31％，而圆柚酮nootkatone含量是3.99％。但黄勤挽
3.等从广西益智果实挥发油中鉴定出相对含量最高的化合物则是圆柚酮(12.11％)。对于海南的益智果实成分含量测定结果也是差异显著，相对较早的是陈画虹
4.等人针对益智果实几个部位的挥发油进行gc-ms分析比对，发现益智种子、果皮、全果挥发油含量及油中主要成分均有显著差异。其中全果中相对含量最高的是4-异丙基甲苯p-cymene(26.71％)，而圆柚酮含量是4.57％。同样罗秀珍等
5.经gc-ms分析海南产益智果实，发现挥发油中4-异丙基甲苯的含量也是最高，相对含量达44.87％，而圆柚酮的含量仅为1.27％。但近年来，陈新
6.等人对同一成熟时期的海南野生益智果实测定后发现，其倍半萜类的相对含量却是最高，(e,e)-α-金合欢烯(e,e)-α-farnesene和香橙烯valencene分别是7.62％和7.51％，圆柚酮的相对含量极少为0.326％。翟红莉
7.的gc-ms测定结果则发现海南琼中、屯昌、白沙和五指山四地益智果实中圆柚酮的相对含量最高均达30％以上，但海南不同产地间存在一定差异，均含有特有成分。总结以上研究发现不同产地益智果实的药效成分多样性和含量具有显著差异。因此，构建益智的转录组数据库，在此基础上开发出est-ssr标记，利用这些标记对不同地域益智种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，评价其遗传因素在药效成分差异化形成上的贡献率，为其品质形成理论的阐述提供全面的数据，对益智种质资源保护和种质创新具有重要意义。
4.参考文献：
5.[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版(一部)[s].北京:中国医药科技出版社,2010:274.
[0006]
[2]李婷,李远志,卢昌阜,等.益智果和叶的挥发油提取及gc-ms分析[j].食品科技,2010,35(9):301-306.
[0007]
[3]黄勤挽,胡昌江,李兴迎,等.益智仁盐炙前后挥发油成分对比研究[j].中国药
业,2008,17(5):3-4.
[0008]
[4]陈画虹,朱文姬,王冰洁.益智不同部位挥发油成分分析[j].中药材,1999,22(9):460.
[0009]
[5]罗秀珍,余竞光,徐丽珍.中药益智挥发油化学成分[j].中国中药杂志.2001,26(4):262-264.
[0010]
[6]陈新,刘晓静,吴娇,等.益智果实挥发油化学成分及抑菌活性研究[j].中国农学通报,2010,26(22):366-371.
[0011]
[7]翟红莉,刘寿柏,蔡真金,等[j].海南4个不同产地益智果实挥发油成分的gc-ms分析[j],广东农业科学,2015,19:83-86.


技术实现要素：

[0012]
基于以上现有技术，本技术提出一种中药益智est-ssr标记引物及其应用。
[0013]
本发明方案包括以下内容：
[0014]
一方面，本发明提供一种中药益智est-ssr标记引物，包括序列表中seq id no.1、seq id no.2、seq id no.19、seq id no.20、seq id no.43、seq id no.44、seq id no.45、seq id no.46、seq id no.47、seq id no.48、seq id no.49、seq id no.50、seq id no.51、seq id no.52、seq id no.53、seq id no.54、seq id no.55、seq id no.56、seq id no.59、seq id no.60、seq id no.61、seq id no.62、seq id no.63、seq id no.64、seq id no.65、seq id no.66、seq id no.67、seq id no.68、seq id no.69、seq id no.70、seq id no.71、seq id no.72、seq id no.73、seq id no.74、seq id no.75、seq id no.76、seq id no.77、seq id no.78、seq id no.79和seq id no.80所示的引物序列。
[0015]
另一方面，本发明还提供了所述的中药益智est-ssr标记引物在中药益智遗传多样性分析中的应用。
[0016]
优选的，所述应用是：用所述的est-ssr标记引物对不同地域的益智种质资源进行ssr引物筛选和扩增；计算每对引物在不同地域益智种质资源的多态性信息。
[0017]
优选的，所述应用是：用seq id no.1和seq id no.2引物序列对不同地域来源的益智种质资源进行多态性差异分析；所述引物注释的化合物为白杨素。
[0018]
优选的，所述应用是：用seq id no.47和seq id no.48引物序列对不同地域来源的益智种质资源进行多态性差异分析；所述引物所注释的化合物为杨芽黄素。
[0019]
优选的，所述应用是：用seq id no.77和seq id no.78引物序列对不同地域来源的益智种质资源进行多态性差异分析；所述引物注释的化合物为圆柚酮。
[0020]
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0021]
本发明首次开发了中药益智est-ssr标记引物，该引物可用于对不同地域来源的中药益智的遗传多样性和聚类分析，有助于快速准确的区分不同地域的中药益智种质，为益智的定向育种、品种标准化等建立良好的基础。
附图说明
[0022]
图1：ssr位点分布信息简图；
[0023]
图2：转录组注释结果为白杨素的1号ssr标记在不同地域的益智样品中的扩增结
果；目的片段大小在100～250bp之间。m:marker dl2000；1～17：对应样品a1～a17；18：阴性对照；19：空白对照。
[0024]
图3：转录组注释结果为杨芽黄素的24号ssr标记在不同地域的益智样品中的扩增结果；目的片段大小在250bp左右。m:marker dl2000；1～17：对应样品a1～a17；18：阴性对照；19：空白对照。
[0025]
图4：转录组注释结果为圆柚酮的39号ssr标记在不同地域的益智样品中的扩增结果；目的片段大小在250bp左右。m:marker dl2000；1～17：对应样品a1～a17；18：阴性对照；19：空白对照。
[0026]
图5：用20对引物构建的17个不同地域益智样品遗传聚类图(引物1/10/22/23/24/25/26/27/28/30/31/32/33/34/35/36/37/38/39/40)。
[0027]
图6：用20对引物构建的17个不同地域益智样品亲缘关系图(引物1/10/22/23/24/25/26/27/28/30/31/32/33/34/35/36/37/38/39/40)。
具体实施方式
[0028]
为对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下结合实施例和附图进行说明，但以下实施例所描述的仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0029]
实施例
[0030]
供试材料：
[0031]
表1不同地域的益智样品信息
[0032][0033][0034]
1、选取17个地域的益智植株嫩叶提取总dna，提取方法参照植物基因组dna提取试剂盒说明书步骤。
[0035]
2、利用本发明设计的est-ssr标记进行分析，具体步骤如下：
[0036]
2.1 est-ssr引物筛选与扩增：
[0037]
2.1.1 pcr反应体系：本实验的最佳反应体系为20μl：10μl 2
×
power taq pcr mastermix(即10μl dna polymerase、buffer含mg
2
、2.0mm/μl ddtp mixture)、2μl dna、2μl引物(浓度10μmol/l)、6μl ddh2o(灭菌)。
[0038]
2.1.2 pcr反应程序：94℃预变性2min，95℃变性45sec，退火45sec(退火温度为每个引物最适温度)，72℃延伸10min，36个循环，16℃保存。
[0039]
2.1.3琼脂糖凝胶电泳：
①
配制2％浓度的琼脂糖凝胶，倒入水平制胶槽中；
②
待冷却凝固后点样，每个点样孔10μl，轻放到电泳槽中；
③
电泳：120v电压，电泳40min；
④
拍照：放置于显微成像系统(明美mc20-n)进行拍照。
[0040]
2.14 est-ssr标记筛选：根据已有的益智转录组数据设计了168对ssr引物(部分引物序列见表2)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；ssr引物筛选是以10份不同地域益智dna为模板，根据以上所述的反应体系和反应条件进行。根据电泳结果筛选多态性较好的引物进行温度梯度pcr筛选；每对引物设置10个温度梯度，分别从48℃到66℃，依次为66℃、64℃、62℃、60℃、58℃、56℃、54℃、52℃、50℃、48℃。经过温度梯度pcr扩增后，筛选能扩增出清晰、稳定条带的退火温度，最后确定20对多态性较好的引物进行全部益智种质资源的est-ssr标记分析。
[0041]
2.2 ssr标记条带的统计：采用0、1二进制数据进行统计，将所得图片采用人工计数，同一位置条带有记1无记为0资料缺失记为9建立excel表格数库。
[0042]
2.3聚类图和亲缘关系图构建：利用ntsyspc version 2.10y和popgene 1.3.1软件，基于nei’s(1972)法计算其遗传距离和遗传相似度，聚类分析按upgma(unweighted pair group method arithmetic averages)法进行。
[0043]
基于dice相似系数构建的聚类图显示：所有样品在相似系数为0.35时可分为两大类，其中一大类包括了来自15个地区的样品，在相似系数为0.35时又分成了两亚类；另一类仅包括两个样品，分别来自海南东方(a2)和海南海口(a8)，其相似性系数比较高，约0.67。从这17个样品的发生聚类相似系数上来看其遗传基础相对较丰富，说明可能与其种质来源广泛以及长期的地理环境隔离有关。基于遗传距离构建的亲缘关系进化树结果表明，17个地区的样品被划分到了四大类中：a3、a6、a4、a16(1)；a11、a13、a8、a15、a10、a12(2)；a2、a14、a7、a17(3)；a1、a9、a5(4)。可以看出，不同地域的益智种质资源交流广泛，共同经历了类似的进化过程，这也验证了海南作为益智种苗的重要来源地的说法。
[0044]
表2
[0045][0046][0047]
益智est-ssr标记引物的应用：
[0048]
用上述的益智est-ssr引物对不同地域的益智种质资源进行分子标记分析。用设计完成的益智est-ssr引物对不同地域的益智种质资源进行筛选和扩增，并计算每对引物在不同地域益智种质资源的多态性信息，进行亲缘关系分析。
[0049]
益智est-ssr标记引物的应用：
[0050]
用上述设计完成的1号est-ssr引物(其注释的化合物为白杨素(chrysin，cluster-35522.0，seq id no.81))，对不同地域来源的益智种质资源进行该位点的多态性
差异分析，与其他引物相比，该引物清晰、准确地鉴定出不同地域益智资源白杨素基因的表达差异。
[0051]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。