重组基因组、非人哺乳动物细胞及其产生方法和用途与流程

1.本发明涉及基因工程领域，具体涉及用于医学和疾病研究目的的遗传工程化改造的非人哺乳动物细胞及其基因组，基于此类非人哺乳动物细胞和其基因组获得非人哺乳动物的方法，以及源自这种动物的细胞，抗体，抗体片段和包含抗体片段的衍生药物或药物组合物。


背景技术：

2.bruggemann et al.1989a首次报道了在动物体内引入未重排的人免疫球蛋白基因片段可导致动物血清中检测到源自人免疫球蛋白基因的抗体，这样的尝试开启了利用遗传工程改造的动物在动物体内直接产生可变区为全人源的治疗性抗体的篇章。许多公司都基于类似的原理产生带有人免疫球蛋白基因的转基因动物，这些制备方法和实例被描述在国际申请wo90/10077，wo90/04036，wo2012/018610，wo2010/039900，wo2011/004192，wo2002/066630，wo1994/002602，wo1996/030498，wo1998/024893，wo1994/004667，wo1990/006359，wo1992/003917，美国申请us7041871，us6673986，us6091001，us5877397以及nat biotechnol.2014apr；32(4):356-63，proc natl acad sci usa.2014apr 8；111(14):5147-52和proc natl acad sci usa.2014 apr 8；111(14):5153-8等公开文献中。
3.这些方法涉及动物体内内源性抗体基因簇功能的失活和人免疫球蛋白基因的重组(recombination)和表达。为了达到这两个目的而进行的遗传工程改造通常都在这些非人哺乳动物胚胎干细胞中进行，例如敲除小鼠胚胎干细胞中的部分或全部重链和轻链基因座，并以导入人的重链和轻链基因座来弥补这种基因功能缺失而导致小鼠产生源于人重链和轻链基因片段的抗体。但是现有技术这些动物模型耗时耗资，通常具有一些限制或缺陷：
4.1)需要敲除或失活的动物的内源性免疫球蛋白基因座大小通常都是megabase级别，这通常导致这种敲除或失活的基因操作效率低下或仅部分成功。内源性免疫球蛋白基因座的敲除或失活不彻底的情况下将导致所获得的动物在表达人源抗体的同时也表达内源性鼠源抗体，增大抗体筛选的难度；
5.2)需要插入的人源免疫球蛋白基因座大小也是megabase级别，而载体大小限制了一次性导入的人源dna片段的大小，通常需要较多步骤和较长的时间才能分批将所有人源免疫球蛋白基因片段全部导入。在无法全部导入的情况下所获得的动物仅具有较小的v区库或较少的恒定区类别，从而仅能拥有较小的人源抗体多样性或较差的b细胞发育；
6.3)人源免疫球蛋白基因座大片段dna成功插入，特别是定点(in situ)插入的效率极低，当这些插入步骤需要多次实施时，低效率因素增加了获得这类转基因动物的时间成本和失败风险。当使用随机插入的方法将人源免疫球蛋白基因座大片段dna导入这类转基因动物中，由于远距离调控区域的缺失及随机插入位点所带来的不确定性影响，部分小鼠模型出现b细胞发育不同程度的阻滞，特别是t1型b细胞发育到t2型b细胞过程被延迟。这些动物对抗原的免疫反应很难达到非转基因动物的水平，产生的抗体的亲和性也难以达到非转基因动物中产生的抗体的亲和性；
7.4)由于人源免疫球蛋白基因片段导入大小、数量等制约，限制了可以进行最优化表达分析的转基因品系的数目，最终得到的转基因小鼠，由于具有较低效的v(d)j重组和部分基因互补(partial gene complement)，通常产生的抗体有限，导致抗体产生效率低下。
8.基于对上述限制的分析可以看出，对于低成本，快捷的获得抗体表达库大，而且人源可变区基因片段重排效率高和表达效率高的方法存在需求，特别是，对具有良好抗原响应能力并且能高效表达高亲和力人源化免疫球蛋白的转基因动物存在需求。


技术实现要素：

9.为了解决前述现有技术的缺陷，本发明提供一种可稳定遗传的、用于全人源治疗性抗体筛选的非人哺乳动物细胞，其基因组可包含41个人免疫球蛋白重链可变区功能性v基因，或20个人免疫球蛋白kappa轻链可变区功能性v基因，或31个人免疫球蛋白lambda轻链可变区功能性v基因。基于所述非人哺乳动物细胞制备的转基因动物能够高效快捷的获得多样性高，亲和力强的可变区为全人源的抗体。
10.本技术的发明人分析了人类基因组数据库，人重链可变区dna片段来源于第14号染色体105863198和106879844位置之间，人kappa轻链可变区dna片段来源于第2号染色体88860568和90235398位置之间，人lambda轻链可变区dna片段来源于第22号染色体22023114和22922913位置之间，所有坐标参照ensembl grch38.p13版本的人类基因组数据库。
11.发明人发现在人的免疫球蛋白基因座中，v区基因，d区基因，j区基因或者恒定区基因都有可能出现不贡献或者仅低效贡献到重排后的抗体转录组中的假性基因或开放读码框。关于这三类基因的定义和特点可参考以下imgt数据库说明性链接http://www.imgt.org/imgtscientificchart/sequencedescription/imgtfunctionality.html通过http://www.imgt.org/genedb/数据库链接选择物种人(homo sapiens)和基因类别(v区基因选择variable,d区基因选择diversity,j区基因选择joining,恒定区基因选择constant)以及对应的免疫球蛋白基因座名称(重链基因座选择igh,kappa轻链基因座选择igk,lambda轻链基因座选择igl)即可查找人类免疫球蛋白基因座中的功能性基因(functional)，假性基因(pseudogene)和开放读码框(orf,open reading frame)的基因名称列表。值得注意的是，imgt数据库中收录的是所有报道过的功能性基因，假性基因或开放读码框基因，而在实际事实中，数据库中部分基因是可能仅存在于少数个体。
12.人免疫球蛋白重链基因座，kappa轻链和lambda轻链基因座基因片段可通过bac或yac文库构建的方法克隆至可在大肠杆菌或酵母中复制的bac载体或yac载体。在未经基因编辑的情况下，假性v基因，开放读码框v基因和功能性v基因片段混合排列(如图1所示)。这些基因均可能包括三个区域，位于5’端的基因调控区域,基因编码序列区域(包括内含子与外显子)以及位于3’端的抗体基因重组信号序列(rss,recombination signal sequence)。部分人源功能性v基因，假性v基因和开放读码框基因片段(包括v区基因的5
‘
端调控区域，基因编码序列区域和3’端抗体基因重组信号序列(rss,recombination signal sequence))在基因组的位置可参考表1所示，这些坐标参照的是ensembl grch38.p13版本的人类基因组数据库。
13.表1.人重链v区基因，人kappa轻链近端(proximal)v区基因和人lambda轻链v区基
因列表及其类别
14.15.[0016][0017]
[0018][0019]
[0020]
[0021][0022]
注：1)起始位置数值比终止位置大的v区基因方向为反向互补方向，起始位置编号数值比终止位置小的v区基因方向为正向；2)所有坐标参照ensembl grch38.p13版本的人类基因组数据库。
[0023]
进一步，发明人发现，通过http://www.imgt.org/genefrequency/query数据库中这三类可变区基因片段在重排后的抗体转录组cdna的测序和基因使用频率(gene frequency)的分析表明，功能性基因片段可以通过基因重排高频率的贡献到抗体转录组，而假性基因和开放读码框通常很少或者从不贡献到抗体转录组中。
[0024]
虽然假性基因和开放读码框很少或者从不贡献到抗体转录组中，这两类基因仍可通过基因重排产生无效的v/d/j或v/j重排产物。虽然仅有非生产性的重排(unproductive rearrangement)的b细胞最终将通过凋亡的方式消失，但是数量庞大的假性基因和开放读码框的存在可能是低效非生产性v/d/j或v/j重组的重要原因。因此，发明人推测无差别的将假性基因(pseudogene)和开放读码框(orf,open reading frame)同样导入动物基因组增加了人源可变区基因片段在动物体内的重排试错成本，降低了重组效率。
[0025]
以人，小鼠或大鼠免疫球蛋白可变区基因座为例，功能性基因，假性基因和开放读码框均间插排列，在基因重排阶段，基因转录阶段甚至翻译阶段，假性基因和开放读码框均可能造成对有效重排的干扰从而降低有成效的重排效率。在本发明的发明人认识到仅有功能性基因可以通过重排和表达产生有功能的免疫球蛋白后，发明人尝试在基因组水平将这些假性基因，开放读码框，包括这些假性基因和开放读码框的编码序列和非编码序列进行敲除，以期满足高效产生人抗体的需求。
[0026]
一方面，本发明提供了一种核酸构建体(或非人哺乳动物基因工程重组基因组)，所述核酸构建体(或重组基因组)包含人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段，所述人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段中的假性v基因和/或开放读码框基因中的部分(即，一个或多个)或全部缺失。
[0027]
在本技术中“部分或全部”是指一个或多个或全部。
[0028]
所述人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段的编码区和非编码区均来自人免疫球蛋白。
[0029]
具体地，本发明提供一种非人哺乳动物基因工程重组基因组(或，一种核酸构建体)，其中内源性免疫球蛋白可变区基因部分或全部被人免疫球蛋白可变区基因替代，所述人免疫球蛋白可变区基因的部分或全部假性基因和/或开放读码框被敲除。
[0030]“人免疫球蛋白可变区基因”与“人免疫球蛋白基因座的可变区基因(区段)”具有相同的意义。
[0031]
在本技术中，任选地，所述人免疫球蛋白可变区基因的其他无关基因(例如表1中
的h35片段所标注的基因)被部分或全部敲除。
[0032]
任选地，人免疫球蛋白基因座的可变区选自人免疫球蛋白的重链可变区、和/或轻链κ可变区、和/或轻链λ可变区。
[0033]
任选地，人免疫球蛋白基因座的可变区选自人免疫球蛋白的重链可变区的v、d和j区中的任一或其组合。
[0034]
任选地，人免疫球蛋白基因座的可变区选自人免疫球蛋白的轻链κ可变区的v和j区中的任一或其组合。
[0035]
任选地，所述人免疫球蛋白基因座的可变区选自人免疫球蛋白的轻链λ可变区的v和j区中的任一或其组合。
[0036]
任选地，通过基因敲除缺失所述假性基因和/或开放读码框基因。任选地，所述基因敲除在原核或真核细胞中进行，例如细菌、酵母、昆虫细胞、植物细胞、大肠杆菌、cho、毕赤酵母等。
[0037]
另外，所述假性v基因和开放读码框基因的定义参照imgt数据库。
[0038]
本发明的核酸构建体(或基因工程重组基因组)中，人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段的编码区和非编码区均来自人免疫球蛋白。任选地，所述人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段包括人免疫球蛋白的重链可变区功能性v、d和j区的编码序列和非编码序列。任选地，所述人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段包括人免疫球蛋白的κ轻链可变区功能性v和j区的编码序列和非编码序列，和/或包括人免疫球蛋白的λ轻链可变区功能性v和j区的编码序列和非编码序列。
[0039]
例如，在一个具体实施方式中，本发明的核酸构建体(或基因工程重组基因组)包含：(1)敲除了表1中人免疫球蛋白重链v区中的h2，h4，h9，h11，h13，h15，h19，h21，h23，h17这10个包含假性v区基因或者开放读码框v区基因的dna片段，保留了h1，h3，h5，h6，h7，h8，h10，h12，h14，h16，h18，h20，h22，h24(它们分别包含了功能性人重链v区基因ighv6-1，ighv1-2，ighv1-3，ighv4-4，ighv7-4-1，ighv2-5，ighv3-7，ighv1-8，ighv3-9，ighv3-11，ighv3-13，ighv3-15，ighv1-18，ighv3-20，ighv3-21，ighv3-23)，和来源于人第14号染色体105863198和105939714之间的包含人免疫球蛋白重链d基因区和j基因区序列；或者，(2)敲除了如表1所述序列编号h26，h28，h39，h41，h43，h46，h49，h51，h53，h57，h59，h61，h64，h68这14个包含假性v基因或者开放读码框v区基因的dna片段，保留了如表1所述序列编号h25，h27，h29，h31，h33，h36，h38，h40，h42，h44，h45，h47，h48，h50，h52，h54，h55，h56，h58，h60，h62，h63，h65，h66，h67这25个包含功能性v区基因的片段和如表1所述序列编号h30，h32，h34，h37这几个假性v区基因片段以及h35基因片段；或者，(3)敲除了如表1所述序列编号k3，k6，k9，k12，k16，k19，k21，k24，k26，k28这10个包含假性v基因或开放读码框的区域，保留了如表1所述序列编号k1，k2，k4，k5，k7，k8，k10，k11，k13，k14，k15，k17，k18，k20，k22，k23，k25，k27，k29，k30这20个包含功能性人kappa轻链v区基因和第2号人染色体88861967和88860568之间的人免疫球蛋白kappa轻链j基因区；或者，(4)敲除了如表1所述序列编号l2，l4，l10，l12，l14，l17，l19，l21，l23，l25，l28，l30这12个包含假性v基因或开放读码框的区域，保留了如表1所述序列编号l1，l3，l5，l6，l7，l8，l9，l11，l13，l15，l16，l18，l20，l22，l24，l26，l27，l29，l31这19个包含功能性人lambda轻链v区基因的区域和第22号人染色体22881432和22922913之间的包含人免疫球蛋白lambda轻链j基因区和人c基因区；或
者，包含(5)敲除了如表1所述序列编号l36，l38，l41，l43，l45，l48，l50这7个包含假性v基因或开放读码框的区域，保留了包含如表1所述序列编号l32，l33，l34，l35，l37，l39，l40，l42，l44，l46，l47，l49这12个包含功能性人lambda轻链v区基因的区域；或者，包含(1)-(5)中的任意两个或多个，优选包含(1)和(2)或者(4)和(5)。
[0040]
本发明还提供了制备本发明的核酸构建体(或非人哺乳动物基因工程重组基因组)的方法，包括：
[0041]
(1)通过pcr方法扩增获得所述人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段的各片段，任选地，还包括将扩增得到的各片段单独插入载体中的适当位置，或者将扩增得到的片段部分或全部连接后插入载体中的适当位置；或
[0042]
(2)通过基因敲除的方法将人免疫球蛋白的重链可变区dna片段或轻链可变区dna片段中的假性v基因和/或开放读码框基因敲除，从而得到所述人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段；或。
[0043]
(3)合成基因的方式。
[0044]
在本技术中，所述人免疫球蛋白可变区基因包括人重链功能性vh,dh,jh的编码序列和非编码序列，或人轻链功能性v
l
,j
l
的编码序列和非编码序列，所述轻链是kappa或lambda轻链。
[0045]
进一步，所述内源性免疫球蛋白可变区基因包括小鼠免疫球蛋白重链可变区vh,dh,jh或轻链可变区v
l
,j
l
，其中所述轻链是指kappa或lambda轻链。
[0046]
进一步，所述人重链功能性vh,dh,jh编码序列和非编码序列来自人第14号染色体，所述人轻链功能性v
l
,j
l
的编码序列和非编码序列来自人第2号或22号染色体。
[0047]
进一步，所述人重链功能性vh,dh,jh编码序列和非编码序列包含来自人第14号染色体第105863198和106879844核苷酸位置之间的序列，所有坐标参照ensembl grch38.p13版本的人类基因组数据库，包括如表1所述序列编号h1、h3、h5、h6、h7、h8、h10(该片段包括3个功能性v区基因)、h12、h14、h16、h18、h20、h22、h24、h25、h27、h29、h31、h33、h36、h38、h40、h42、h44、h45、h47、h48、h50、h52、h54、h55、h56、h58、h60、h62、h63、h65、h66、h67序列片段中的一个或多个vh区基因，优选地10-41个功能性vh区基因，更优选15-41个功能性vh区基因，更优选18-41个功能性vh区基因，更优选22-41个功能性vh区基因，更优选25-41个功能性vh区基因，例如25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40或41个功能性v区基因。
[0048]
进一步，所述人kappa轻链功能性v
l
,j
l
编码序列和非编码序列包含来自人第2号染色体88860568和90235398核苷酸位置之间的序列，包括如表1中所述序列编号k1、k2、k4、k5、k7、k8、k10、k11、k13、k14、k15、k17、k18、k20、k22、k23、k25、k27、k29、k30序列片段中的一个或多个v
l
区基因；或来自人第22号染色体22023114和22922913核苷酸位置之间的序列，包括如表1中所述序列编号l1、l3、l5、l6、l7、l8、l9、l11、l13、l15、l16、l18、l20、l22、l24、l26、l27、l29、l31、l32、l33、l34、l35、l37、l39、l40、l42、l44、l46、l47、l49序列片段中的一个或多个v
l
区基因,其中所有坐标参照ensembl grch38.p13版本的人类基因组数据库。
[0049]
进一步，所述内源性免疫球蛋白可变区基因通过同源重组方法部分或全部缺失，所述人免疫球蛋白重链可变区基因插入至所述缺失的内源性免疫球蛋白重链可变区上游
3kb至下游3kb位置，所述人免疫球蛋白轻链可变区基因插入至所述缺失的内源性免疫球蛋白kappa轻链可变区上游3kb至下游3kb位置。
[0050]
所述人免疫球蛋白可变区基因的假性基因和/或开放读码框基因中被敲除(或,被部分或全部敲除)的数量应该使得各种基因的长度缩短，尤其，足以使得较大程度地缩短。一般，插入至非人哺乳动物细胞基因组中的人免疫球蛋白重链、lambda轻链可变区基因的长度分别为敲除假性基因和/或开放读码框基因之前人免疫球蛋白重链、lambda轻链可变区基因总长的10％-50％，优选12％-47％，优选14％-45％，优选15％-43％，更优选16％-40％，更优选16.10％、18％、18.50％、20％、25％、30％、31％、31.75％、35％、38％或38.06％。另外，插入至非人哺乳动物细胞基因组中的人免疫球蛋白kappa轻链可变区基因的长度为敲除假性基因和/或开放读码框基因之前人免疫球蛋白kappa轻链可变区基因总长的35％-65％，优选37％-63％，优选38％-61％，优选40％-60％，优选42％-58％，优选45％-57％，优选47％-56％，更优选50％-55％，例如51％、52％、53％、53.08％或54％。
[0051]
所述假性基因和/或开放读码框基因的总数量在人重链可变区大约是75个，在人kappa轻链近端可变区大约是20个，在人lambda轻链可变区大约是42个。
[0052]
优选，对于“部分或全部敲除”或“部分或全部缺失”，10-100％(优选15-95％，20-90％,例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、72％、75％、78％、80％、83％、85％或88％)的假性基因和/或开放读码框基因被敲除或缺失,该百分比基于人免疫球蛋白可变区基因的假性基因和开放读码框基因的总数量。
[0053]
进一步，所述非人哺乳动物细胞为小鼠胚胎干细胞，缺失的内源性免疫球蛋白重链可变区位置位于小鼠第12号染色体113428530至116027502这两个位置之间；缺失的内源性免疫球蛋白kappa轻链可变区位置位于小鼠第6号染色体67536984至70723924这两个位置之间；缺失的内源性免疫球蛋白lambda轻链可变区位置位于小鼠第16号染色体19065021至19260700这两个位置之间，小鼠基因组染色体位点坐标均以ensembl grcm38.p6版本c57bl/6j小鼠基因组数据库位置为参照；
[0054]
优选地，所述人免疫球蛋白重链可变区基因插入位点为小鼠基因组第12号染色体113428513位置；所述人免疫球蛋白kappa轻链可变区基因插入位点为小鼠基因组第6号染色体70723924位置；所述人免疫球蛋白lambda轻链可变区基因插入位点为小鼠基因组第6号染色体70726758位置，小鼠基因组染色体位点坐标均以ensembl grcm38.p6版本c57bl/6j小鼠基因组数据库位置为参照。
[0055]
本发明的另一方面提供一种包含所述基因工程重组基因组的非人哺乳动物细胞。所述哺乳动物细胞为非人哺乳动物胚胎干细胞，更优选，所述胚胎干细胞为小鼠胚胎干细胞、大鼠胚胎干细胞或兔胚胎干细胞。
[0056]
本发明还提供了一种包含本发明的核酸构建体的重组细胞，它是通过将本发明的核酸构建体导入靶细胞制备的。任选地，所述细胞是永生化的细胞或非永生化的细胞(例如，原代细胞、传代细胞)，包括原核细胞或真核细胞，例如，大肠杆菌细胞、酵母细胞、禽类细胞、哺乳动物细胞、大鼠或小鼠胚胎干细胞、禽类原生殖细胞、c57bl/6j*129s3胚胎干细胞。
[0057]
还提供了本发明的核酸构建体、重组细胞在制备转基因动物中的用途。
[0058]
另一方面，本发明提供了一种工程化的非人哺乳动物细胞，其基因组中包含的免
疫球蛋白基因座缺失宿主非人哺乳动物细胞内源性免疫球蛋白可变区基因，并被插入编码区和非编码区均来自人免疫球蛋白可变区的基因片段；所述人免疫球蛋白可变区的基因片段缺失部分或全部假性v基因和/或开放读码框。
[0059]
一般，所述细胞是永生化的细胞或非永生化的细胞(例如，原代细胞或传代细胞)。
[0060]
本发明的工程化的非人哺乳动物细胞中，插入的所述人免疫球蛋白可变区的基因片段包括：重链可变区功能性v、d、j区编码序列和非编码序列，和/或，κ或λ轻链可变区功能性v、j区编码序列和非编码序列。任选地，非人哺乳动物是禽类、啮齿动物等，例如小鼠、大鼠、鸡、兔等，非人哺乳动物细胞可以来自禽类、啮齿动物、小鼠、大鼠、鸡、兔等，可以是大鼠或小鼠胚胎干细胞、禽类原生殖细胞、c57bl/6j*129s3胚胎干细胞等。可选的，缺失的内源性免疫球蛋白基因座的可变区基因片段包括小鼠免疫球蛋白重链可变区v、d、j区或者轻链κ或λ可变区v、j区。可选的，插入的所述重链可变区功能性v、d、j区编码序列和非编码序列包含来自人第14号染色体第105863198和106879844核苷酸位置之间的序列；任选地，插入的所述轻链κ可变区功能性v、j区编码序列和非编码序列包含来自人第2号染色体88860568和90235398核苷酸位置之间的序列；任选地，插入的所述轻链λ可变区功能性v、j区编码序列和非编码序列包或来自人第22号染色体22023114和22922913核苷酸位置之间的序列；并且，所有核苷酸位置坐标参照ensembl grch38.p13版本的人类基因组数据库。
[0061]
本发明的另一方面提供一种产生非人哺乳动物细胞的方法，该方法包括：
[0062]
a)在宿主非人哺乳动物细胞基因组的免疫球蛋白基因座的可变区基因簇上游和下游分别引入方向相同且兼容的重组酶靶向位点；b)继续向步骤a)的细胞中引入能够识别所述重组酶靶向位点的特异性重组酶，在允许步骤a)所述的两个重组酶靶向位点之间发生重组的条件下使宿主非人哺乳动物细胞内源性免疫球蛋白基因座的可变区基因部分或全部缺失，得到打靶细胞；c)提供包含部分或全部人免疫球蛋白基因座的可变区的载体，将所述载体中包含的人免疫球蛋白基因座的可变区基因中的部分或全部假性v基因和/或开放读码框敲除，得到打靶载体；d)将打靶载体导入步骤b)得到的打靶细胞中，使得打靶载体中包含的人免疫球蛋白基因座的可变区替代打靶细胞中缺失的所述内源性免疫球蛋白基因座的可变区基因，从而得到所述的工程化的非人哺乳动物细胞。
[0063]
任选地，步骤c)的打靶载体是包含重链可变区基因的重链打靶载体、或者是包含κ或λ轻链可变区基因的轻链打靶载体。另外，可以根据需要导入的可变区基因数目构建一个或多个重链打靶载体或轻链打靶载体，例如，图10、13、14所示的打靶载体。当重链或轻链打靶载体为多个时，步骤d)中可以依次导入这些打靶载体。
[0064]
其中，步骤c)所述打靶载体在大肠杆菌或酵母细胞中完成构建。
[0065]
更具体地说，本发明的另一方面提供一种产生非人哺乳动物细胞的方法，该方法包括：
[0066]
a)缺失或失活宿主非人哺乳动物ig基因座的轻、重链可变区；b)在宿主非人哺乳动物ig基因座的重链恒定区上游插入缺失部分或全部假性v基因和/或开放读码框基因的人igh vdj区，所述人igh vdj区包含多个人igh v区、一或多个人d区及一或多个人j区，和/或；c)在宿主非人哺乳动物ig基因座的κ恒定区上游插入缺失部分或全部假性v基因和/或开放读码框的人κvj区，所述人κvj区包含多个人ig轻链κv区及一或多个人ig轻链κj区，和/或；d)在宿主非人哺乳动物ig基因座的κ恒定区下游插入缺失部分或全部假性v基因和/或
开放读码框的人λvj区，所述人λvj区包含多个人ig轻链λv区及一或多个人ig轻链λj区；其中步骤a)-c)可以以任何顺序进行且既可以逐步方式进行也可以单一步骤进行。
[0067]
另外，本发明的另一方面提供一种产生非人哺乳动物细胞的方法，该方法包括：
[0068]
a)在非人哺乳动物细胞基因组免疫球蛋白可变区基因上游和下游分别引入方向相同且兼容的重组酶靶向位点；
[0069]
b)引入能够识别步骤a)所述重组酶位点的特异性重组酶，允许步骤a)所述两个重组酶靶向位点之间发生重组事件，导致所述非人哺乳动物细胞内源性免疫球蛋白可变区基因产生部分或全部缺失；
[0070]
c)提供包含部分或全部人免疫球蛋白可变区的打靶载体，所述打靶载体包含人功能性可变区基因并且部分或全部假性基因和/或开放读码框被敲除，所述人功能性可变区基因包括人功能性vh,dh,jh编码序列和非编码序列，或人功能性v
l
,j
l
编码序列和非编码序列，所述轻链是kappa或lambda轻链；所述打靶载体选自bac载体或yac载体；
[0071]
d)引入步骤c)所述打靶载体，导致在非人哺乳动物细胞内步骤c)中所包含的人免疫球蛋白可变区基因替代步骤b)所述缺失的非人哺乳动物细胞内源性免疫球蛋白基因；
[0072]
e)由步骤d)产生基因组中包含人免疫球蛋白可变区基因的非人哺乳动物细胞。
[0073]
优选，步骤c)所述打靶载体在大肠杆菌或酵母细胞中完成构建。
[0074]
本发明的另一方面提供一种打靶载体，包含人免疫球蛋白可变区基因，所述人免疫球蛋白可变区基因部分或全部假性基因和/或开放读码框被敲除，所述人免疫球蛋白可变区基因包括人重链功能性vh,dh,jh的编码序列和非编码序列，或人轻链功能性v
l
,j
l
的编码序列和非编码序列，所述轻链是kappa或lambda轻链。所述打靶载体选自bac载体或yac载体。
[0075]
本发明的另一方面提供产生表达可变区为全人源抗体的非人哺乳动物的方法，将所述的非人哺乳动物细胞引入雌性野生型非人哺乳动物子宫内，选择子代嵌合非人哺乳动物为f0代非人哺乳动物。
[0076]
进一步地，在将非人哺乳动物细胞引入雌性野生型非人哺乳动物子宫内之前，对所述非人哺乳动物细胞进行筛选，获得染色体数目无增加或者减少的非人哺乳动物细胞克隆，将所述非人哺乳动物细胞克隆移入野生型非人哺乳动物胚胎囊胚腔，并将囊胚移植至假孕雌性野生型非人哺乳动物子宫中。
[0077]
进一步地，f0代非人哺乳动物与野生型非人哺乳动物繁殖后即获得能够稳定遗传的，在指定位置插入人免疫球蛋白可变区基因的f1代非人哺乳动物。进一步地，以表达重链可变区为全人源的抗体的非人哺乳动物和表达轻链可变区为全人源的抗体的非人哺乳动物为亲本进行繁殖，即可获得表达重链，轻链可变区均为全人源的抗体的非人哺乳动物。
[0078]
本发明的另一个方面提供所述的产生表达可变区为全人源的抗体的非人哺乳动物的方法所制备的非人哺乳动物。
[0079]
优选地，所述非人哺乳动物为小鼠、大鼠或兔，所述非人哺乳动物细胞为小鼠胚胎干细胞、大鼠胚胎干细胞或兔胚胎干细胞。
[0080]
本发明的另一个方面提供所述的重组基因组、所述的非人哺乳动物细胞、所述的打靶载体或所获得的非人哺乳动物在筛选全人源抗体或制备全人源抗体药物过程中的应用。
[0081]
本发明的另一个方面提供所述的重组基因组、所述的非人哺乳动物细胞、所述的产生非人哺乳动物细胞的方法或所述的打靶载体在制备非人哺乳动物中的应用。
[0082]
本发明的另一个方面提供由所述非人哺乳动物所产生的可变区为全人源的抗体、抗体片段，或包含所述抗体或抗体片段的衍生药物或药物组合物。
[0083]
本发明还提供了本发明的工程化的非人哺乳动物细胞在制备转基因动物中的用途和产生转基因动物的方法，该方法包括：将本发明的工程化的非人哺乳动物细胞(如胚胎干细胞)注射进胚泡中，随后将嵌合的胚泡植入雌性动物体内以产生后代，以及繁殖和选择具有所需插入的纯合重组体，获得转基因动物。任选地动物是禽类、啮齿动物等，可以是大鼠、小鼠、鸡或兔。
[0084]
另一方面，本发明提供了产生抗体或其抗原结合片段的方法，包括用抗原免疫本发明制备获得的转基因动物，并且回收所述抗体或抗体链或者回收产生所述抗体或重链或轻链的细胞。任选地，将得到的抗体或其抗原结合片段的恒定区用人恒定区置换，以产生完全人源化抗体。本发明还提供了这样制备得到的抗体或其抗原结合片段，以及它们在制备药物组合物中的用途，也提供了包含这些抗体或其抗原结合片段的药物组合物，任选还包含药学上可接受的载体；药物组合物也可以是抗体衍生药物，其包含抗体并且与其他分子结合形成的药物，如抗体小分子毒素偶联药物、抗体放射免疫偶联药物、抗体治疗性多肽偶联药物、双/多特异性抗体等。
[0085]
本发明中人免疫球蛋白基因所有坐标参照ensembl grch38.p13版本的人类基因组数据库，人重链可变区dna片段来源于第14号染色体105863198和106879844位置之间，人kappa轻链可变区dna片段来源于第2号染色体88860568和90235398位置之间，人lambda轻链可变区dna片段来源于第22号染色体22023114和22922913位置之间。
[0086]
在人免疫球蛋白基因座的可变区基因区段中假性v基因和开放读码框的总数量中，一般10-100％的假性v基因和/或开放读码框被敲除，例如20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0087]
本发明中基因敲除的方法可以是本领域已知的任意适用的方法，例如，利用同源重组进行敲除，示例性的实例参见附图。
[0088]
本发明中的重组酶可以是本领域已知的任意适合的酶，如cre、flp等，识别位点可以是loxp、frt等。可以利用同源重组和位点特异性重组的组合来产生本发明的构建体、细胞和动物。示例性的同源重组方法被描述在美国专利第6,689,610号、第6,204,061号、第5,631，153号、第5,627,059号、第5,487,992号和第5,464,764号中，这些专利通过引用的方式并入本文。位点特异性重组需要专用的重组酶来识别位点和在这些位点处催化重组。许多噬菌体和酵母衍生的位点特异性重组系统，如酪氨酸家族的噬菌体p1 cre/loxp、酵母flp-frt系统和dre系统，各自包括重组酶和特异性同源位点，可用于真核细胞中dna的整合，也适合用于本发明。这样的系统和使用方法被描述在，例如美国专利第7,422,889号、第7,112,715号、第6,956,146号、第6,774,279号、第5,677,177号、第5,885,836号、第5,654,182号和第4,959,317号中，它们通过引用并入本文。重组酶介导的盒式交换(rmce)程序通过使用野生型和突变的loxp(或frt等)位点连同阴性选择的组合来进行。酪氨酸家族的其他系统例如噬菌体λint整合酶、hk2022整合酶，以及另外属于重组酶的丝氨酸家族的系统，例如
噬菌体phic31、r4tp901整合酶也适用于本发明。位点特异性重组位点的引入可以通过常规同源重组技术来实现，这样的技术被描述在参考文献，例如sambrook和russell(2001)(molecular cloning：a laboratory manual第3版(cold spring harbor，n.y.：cold spring harbor laboratory press)和nagy，a.(2003).(manipulating the mouse embryo：a laboratory manual，第3版(cold spring harbor，n.y.：cold spring harbor laboratory press)。frederic p.miller，agnes f.vandome和john mcbrewster的genetic recombination：nucleic acid，homology(biology)，homologous recombination，non-homologous end joining，dna repair，bacteria，eukaryote，meiosis，adaptive immune system，v(d)j recombination(平装本-2009年12月23日)。
[0089]
敲除或敲入基因可以采用本领域已知的任意方法鉴定，包括但不限于酶切鉴定、pcr鉴定、杂交或筛选标记(如抗性、营养、毒素选择等)鉴定，示例性的方式是如图11、12所示。
[0090]
本发明中使用的打靶载体(targeting vector)可以是适用于本发明的任意已知类型。典型的基因打靶载体一般由三部分组成，即含有要插入到受体细胞基因组中去的用于打靶的基因或外源基因，处于外源基因两侧的、与细胞内靶基因座同源的dna序列以及用于筛选的标记。通常用新霉素磷酸转移酶基因(neo)作为正( )选择标记，表达了新霉素磷酸转移酶基因的受体细胞可通过在含g418的培养基上进行培养而筛选。示例性的打靶载体如bac载体。
[0091]
用于在本发明中产生在细胞中同源重组的载体的重组工程方法在例如wo9929837和wo0104288中描述，该技术为本领域熟知。一方面，使用bac作为人dna的来源进行人dna的重组工程。使用mn nucleobond bac 100纯化试剂盒分离人bac dna。每个人bac的基因组插入序列均使用重组工程编辑，由此一旦插入，则在小鼠igh或igk基因座形成人v(d)j基因组区的无缝连续部分。bac dna的电穿孔转染和基因分型可参考标准方案(prosser,h.m.,rzadzinska,a.k.,steel,k.p.,and bradley,a.(2008).mosaic complementation demonstrates a regulatory role for myosin vila in actin dynamics ofstereocilia.molecular and cellular biology 28,1702-1712；ramirez-solis,r.,davis,a.c.,and bradley,a.(1993).gene targeting in embryonic stemcells.methods in enzymology 225,855-878.)。
[0092]
本发明的工程化的非人哺乳动物细胞可以用于产生转基因动物，以生产包含人免疫球蛋白可变区的抗体或其抗原结合片段。在一个方面，被替换内源性免疫球蛋白基因的宿主细胞是胚胎干细胞，该胚胎干细胞随后可以用于产生转基因哺乳动物。因此，本发明的方法还包括：分离包括被引入的部分人免疫球蛋白可变区的胚胎干细胞和使用所述胚胎干细胞来产生包含被部分替换的免疫球蛋白基因座的转基因动物。任选地，转基因动物可以是禽类，且使用原生殖细胞来生产转基因动物。因此，本发明的方法还包括：分离包括被引入的部分人免疫球蛋白可变区的原生殖细胞，和使用所述生殖细胞来产生包含被部分替换的免疫球蛋白基因座的转基因动物。用于生产这样的转基因禽类的方法被公开在，例如美国专利第7,323,618号和第7,145,057号，它们通过引用并入本文。
[0093]
本发明的转基因动物可以用于生产人源抗体，例如，多克隆抗体和单克隆抗体。这些抗体可以用于本领域常规的用途，包括制备组合物(如药物组合物)、检测抗原(如检测试
剂或试剂盒)或诊断(如诊断试剂或试剂盒)等不同目的。抗原免疫和制备抗体的方法以及组合物、检测或诊断用产品的制备技术都是本领域熟知的。
[0094]
本发明的有益效果：
[0095]
1)通过去除部分或全部假性基因和/或开放读码框，将尽可能多的具有功能的(functional)人抗体可变区基因片段集中在同一个载体中，可实现小鼠体内高效率的v
hdh
jh或v
ljl
重组；
[0096]
2)通过较小的载体能够把更多的功能性人抗体基因片段导入实验动物，降低构建风险，缩短构建时间，减低构建成本；
[0097]
3)由于本发明敲除假性基因或开放读码框的操作是在大肠杆菌中完成的，操作简易，这样的敲除效率很高，耗时较短；通过在大肠杆菌中将人免疫球蛋白可变区基因精简，这样在胚胎干细胞中的基因打靶的步骤将会最少化，甚至一个步骤即可完成，因此，仅需要很少的非人哺乳动物细胞基因打靶步骤完成尽可能多的具有功能的人抗体可变区基因导入，在很短的时间内即可完成构建表达全人源可变区的实验动物；
[0098]
4)通过本发明构建完成的实验动物可正常表达可变区为全人源，恒定区为鼠源的嵌合抗体，对抗原也有与野生型小鼠类似或更高水平的特异性免疫反应；
[0099]
5)较现有抗体筛选平台而言，本发明的转基因小鼠可以产生更大的抗体库，可用于高效筛选抗体，产生的抗体亲和力达到nm级，甚至pm级，亲和力更强。
[0100]
6)本发明的转基因小鼠的成熟型b细胞和非成熟型b细胞在脾脏中的比例，与野生型小鼠无差别，能保障高效正常的b细胞发育。
附图说明
[0101]
图1：源自人类免疫球蛋白重链，kappa和lambda轻链基因座基因组的dna片段分段插入bac或yac载体的示意图及功能性(functional)可变区v基因片段，假性(pseudogene)可变区v基因片段以及开放读码框(open reading frame)v基因片段的基本结构示意图；
[0102]
图2：当两个重组酶识别位点位于同一条染色体上并且方向相同时重组敲除示意图；
[0103]
图3：当两个重组酶识别位点位于两条同源染色体上并且方向相同时易位事件示意图；
[0104]
图4：在基因组中同一染色体上分步骤导入方向相同的兼容重组酶识别位点和分成两半的抗生素筛选基因表达元件后，通过导入重组组合成完整抗生素筛选基因表达元件，从而高效的实现重组酶识别位点之间长目标片段dna序列敲除的方法示意图；
[0105]
图5：对小鼠基因组内源性免疫球蛋白重链可变区(小鼠第12号染色体113428530至116027502之间的序列)进行重组敲除的示意图(polya-hygromycin-loxp,puro-cag,polya-neo-loxp-pgk,polya-hygro-loxp-pgk)；
[0106]
图6：对小鼠基因组内源性免疫球蛋白kappa轻链可变区(小鼠第6号染色体67536984至70723924之间的序列)进行重组敲除的示意图；
[0107]
图7：对小鼠基因组内源性免疫球蛋白lambda轻链可变区(小鼠第16号染色体19065021至19260700之间的序列)进行重组敲除的示意图；
[0108]
图8：在包含人免疫球蛋白区域dna片段的bac载体中敲除假性基因或开放读码框
的流程示意图；
[0109]
图9：将不同功能性v区基因的5’端基因调控区域，v区编码序列(包括内含子与外显子)和3’抗体基因重组信号序列(rss，recombination signal sequence)重新重组为一个全新的功能性v区基因片段的示意图；
[0110]
图10：两个包含人重链免疫球蛋白可变区基因片段的打靶载体序列和结构示意图；
[0111]
图11：以重链打靶载体1的细菌人工染色体酶切脉冲电泳凝胶成像图为例，说明鉴定bac载体中包含的人免疫球蛋白区域dna片段的完整性的方法；
[0112]
图12：以重链打靶载体1的细菌人工染色体为pcr模板，说明利用pcr方法鉴定人免疫球蛋白基因片段完整性的方法；
[0113]
图13：包含人kappa轻链免疫球蛋白可变区基因片段的打靶载体序列和结构示意图；
[0114]
图14：两个包含人lambda轻链免疫球蛋白可变区基因片段的打靶载体序列和结构示意图
[0115]
图15：将人免疫球蛋白重链可变区基因插入小鼠内源性免疫球蛋白重链可变区位置(原有的12号染色体113428530至116027502缺失)的方案示意图；
[0116]
图16：人重链打靶载体1和2分阶段导入缺失了小鼠内源性重链可变区序列的小鼠胚胎干细胞的示意图；
[0117]
图17：以图2中ace001-h2单同源臂打靶载体实现基因片段的定点插入为例，说明打靶载体通过同源重组精准实现基因片段的定点插入方案中准确基因插入事件的pcr鉴定方法示意图；
[0118]
图18：以图2中ace001-h2单同源臂打靶载体实现基因片段的定点插入为例，说明使用引物p1/p4和p3/p2进行5’端和3’端pcr鉴定准确基因插入事件的方法和电泳结果；
[0119]
图19：将人免疫球蛋白kappa轻链可变区基因插入小鼠内源性免疫球蛋白kappa轻链可变区位置(原有的6号染色体67536984至70723924缺失)的方案示意图；
[0120]
图20：人kappa轻链打靶载体导入缺失了小鼠内源性kappa轻链可变区序列的小鼠胚胎干细胞的示意图；
[0121]
图21：将人免疫球蛋白lambda轻链可变区基因插入小鼠内源性免疫球蛋白kappa轻链恒定区下游位置(原有的6号染色体67536984至70723924缺失)的方案示意图；
[0122]
图22：人lambda轻链打靶载体1和2分阶段导入缺失了小鼠内源性kappa轻链序列的小鼠胚胎干细胞的示意图；
[0123]
图23：本发明的转基因小鼠与野生型balb/c鼠的b细胞发育情况对比；
[0124]
图24：转基因与野生型balb/c小鼠在第三次加强免疫后ova特异性抗体血清水平比较；
[0125]
图25：本发明转基因小鼠获得的抗体的亲和力水平。
[0126]
图26：实施例4的步骤2中的seq id no.1。
[0127]
定义：
[0128]
假性基因(pseudogene)：又称假基因、伪基因，是基因家族在进化过程中形成的无功能的残留物。假基因可视为基因组中与编码基因序列非常相似的非功能性基因组dna拷
grch38.p13版本的人类基因组数据库为参照。
[0141]
本发明中分步敲除dna片段的方法，如图2所示，通过以下几个步骤可敲除细胞中的目的片段：1)在细胞目的片段5’端通过同源重组插入一个含有重组酶识别位点(例如loxp或frt)的dna片段；2)在1)步骤完成的同一细胞克隆目的片段3’端通过同源重组插入一个含有与1)步骤重组酶识别位点兼容，并且方向相同的重组酶识别位点(例如loxp或frt)的dna片段；3)在2)步骤完成的同一细胞克隆中导入识别1)或2)步骤中插入的重组酶识别位点的重组酶(例如cre或flp)，当两个重组酶识别位点位于同一条dna上，并且方向相同，重组酶可有效切除两个重组酶之间的序列而实现目的片段的敲除(如图2)。
[0142]
在二倍体细胞中，由于目的片段存在于两条不同的染色体上，上述1)步骤中的同源重组介导的重组酶识别位点插入和2)步骤中的同源重组介导的重组酶识别位点插入在一半的几率中会发生在两条不同的染色体上，这种情况下同方向的重组酶识别位点在3)步骤中仍然有可能会被导入的重组酶识别，且发生同源染色体之间的易位事件(translocation)，如图3所示，这种情况下仍然能够实现目的片段的敲除。
[0143]
目的片段越长，通过步骤1)到步骤3)的方法进行目的片段敲除的效率也越低，在这种情况下，优选地，将同一个抗性筛选基因(包括启动子，编码区和多聚a转录终止区)分割成为两个分别都无抗性筛选功能的a、b部分，分别由1)步骤和2)步骤携带进入目的基因两端插入的重组酶识别位点的5’端和3’端，重组事件发生后，有效切除两个重组酶之间的目的片段，将a、b两部分重新组合成为一个有筛选功能的抗性筛选基因，从而高效筛选有效敲除目的基因片段的细胞克隆(图4)。
[0144]
用于进行基因敲除或者人免疫球蛋白可变区基因敲入的小鼠胚胎干细胞可来源于129，c57bl/6j，c57bl/6n等品系或杂交f1代，例如c57bl/6j*129品系小鼠胚胎干细胞，这种干细胞可分离自早期小鼠胚胎内细胞团(参考文献：evans m.j.,kaufman m.h.(1981).establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.nature 292,154
–
156.10.1038/292154a0)，或者购自商业化提供商，例如赛业生物(货号muaes-01001或mubes-01001)或美国应用干细胞公司(applied stemcell，货号ase-9005，ase-9006，ase-9007，ase-9008或ase-9005)
[0145]
实施例1:小鼠内源性重链免疫球蛋白可变区基因座的敲除
[0146]
小鼠内源性重链免疫球蛋白可变区基因座敲除的整体策略可参考图5所示。具体步骤为：
[0147]
步骤1，构建ace001-h1、ace001-h2两个打靶载体，打靶载体的构建为本领域普通技术人员所熟悉。
[0148]
ace001-h1载体如图5所示，具有如下特征1)包含作为同源臂的小鼠第12号染色体113428529和113425469之间的序列(hc arm)，并且在113426998位置插入了一个独特的线性化酶切位点ecori；2)包含一个新霉素筛选基因表达元件pgk-neo-polya，其中新霉素neo编码基因翻译初始密码子atg前插入了一个重组酶识别位点loxp；
[0149]
ace001-h2载体如图5所示，具有如下特征1)包含作为同源臂的小鼠第12号染色体116032177和116027503之间的序列(hv arm)，并且在116029758位置插入了一个独特的线性化酶切位点pmei；2)包含一个具有完整表达功能的嘌呤霉素抗性基因表达元件cag-puro-polya；3)包含一个不具有启动子的潮霉素b抗性基因编码区和polya，并且在该元件
两端分别携带一个重组酶识别位点frt和loxp；在ace001-h1和ace001-h2载体中，frt和loxp的方向采用箭头所表示。
[0150]
步骤2，依次将ace001-h1,ace001-h2载体导入小鼠胚胎干细胞，分别用225μg/ml新霉素(neomycin，供应商：英潍捷基(上海)贸易有限公司，货号：10131027)或1.25μg/ml嘌呤霉素(puromycin，供应商：英潍捷基(上海)贸易有限公司，货号a1113803)筛选获得存活的胚胎干细胞克隆，对这些克隆使用常规pcr方式检测获得两个载体均敲入正确小鼠胚胎干细胞基因组位置的胚胎干细胞克隆；然后在这些胚胎干细胞克隆中引入表达cre重组酶的载体，使用50μg/ml潮霉素b(hygromycin b，供应商：英潍捷基(上海)贸易有限公司，货号：10687010)筛选获得存活的胚胎干细胞克隆，对这些克隆使用常规pcr方式检测获得成功产生cre重组酶介导的大片段敲除的胚胎干细胞克隆，这些小鼠胚胎干细胞克隆的其中一条染色体上缺失了第12号染色体113428530至116027502这两个位置之间的小鼠内源性序列；在此步骤中，ace001-h1和ace001-h2可依次按任意顺序导入小鼠胚胎干细胞。该步骤中，对同源重组打靶载体敲入小鼠胚胎干细胞采用同源臂区域外正向和反向引物pcr的鉴定方法(如图17所示)，引物的设计和pcr实验的具体操作步骤为本领域普通技术人员所熟悉。
[0151]
实施例2:小鼠内源性kappa轻链免疫球蛋白可变区基因座的敲除
[0152]
小鼠内源性kappa轻链免疫球蛋白可变区基因座敲除的整体策略可参考图6所示。具体步骤为：
[0153]
步骤1，构建ace002-k1，ace002-k2两个打靶载体。
[0154]
ace002-k1载体如图6所示，具有如下特征1)包含作为左同源臂的小鼠第6号染色体70718872和70723924之间的序列(kcl arm)，作为右同源臂的小鼠第6号染色体70723925和70726001之间的序列(kcr arm)，其中kcr下游携带一个独特的线性化酶切位点noti；2)左同源臂和右同源臂之间包含一个新霉素筛选基因表达元件pgk-neo-polya，其中新霉素neo编码基因翻译初始密码子atg前插入了一个重组酶识别位点loxp；
[0155]
ace002-k2载体如图6所示，具有如下特征1)包含作为同源臂的小鼠第6号染色体67532019和67536983之间的序列，并且在67534443位置插入了一个独特的线性化酶切位点pmei；2)包含一个具有完整表达功能的嘌呤霉素抗性基因表达元件cag-puro-polya；3)包含一个不具有启动子的潮霉素b抗性基因编码区和polya，并且在该元件两端分别携带一个重组酶识别位点frt和loxp；在ace002-k1和ace002-k2载体中，frt和loxp的方向采用箭头所表示。
[0156]
步骤2，依次将ace002-k1,ace002-k2载体导入小鼠胚胎干细胞，分别用225μg/ml新霉素(neomycin)或1.25μg/ml嘌呤霉素(puromycin)筛选获得存活的胚胎干细胞克隆，对这些克隆使用常规pcr方式检测获得两个载体均敲入正确小鼠胚胎干细胞基因组位置的胚胎干细胞克隆；然后在这些胚胎干细胞克隆中引入表达cre重组酶的载体，使用50μg/ml潮霉素b(hygromycin b)筛选获得存活的胚胎干细胞克隆，对这些克隆使用常规pcr方式检测获得成功产生cre重组酶介导的大片段敲除的胚胎干细胞克隆，这些小鼠胚胎干细胞克隆的其中一条染色体上缺失了第6号染色体67536984至70723924这两个位置之间的小鼠内源性序列；在此步骤中，ace002-k1和ace002-k2可依次按任意顺序导入小鼠胚胎干细胞。该步骤中，对同源重组打靶载体敲入小鼠胚胎干细胞采用同源臂区域外正向和反向引物pcr的
鉴定方法(如图17所示)，引物的设计和pcr实验的具体操作步骤为本领域普通技术人员所熟悉。
[0157]
实施例3:小鼠内源性lambda轻链免疫球蛋白可变区基因座的敲除
[0158]
小鼠内源性lambda轻链免疫球蛋白基因座敲除的整体策略可参考图7所示。具体步骤描述为：
[0159]
步骤1，构建ace003-l1,ace003-l2两个打靶载体，打靶载体的构建为本领域普通技术人源所熟悉。
[0160]
ace003-l1载体如图7所示，具有如下特征1)包含作为同源臂的小鼠第16号染色体19065020和19059018之间的序列(lc arm)，并且在19061523位置插入了一个独特的线性化酶切位点fsei；2)包含一个新霉素筛选基因表达元件pgk-neo-polya，其中新霉素neo编码基因翻译初始密码子atg前插入了一个重组酶识别位点loxp；
[0161]
ace003-l2载体如图7所示，具有如下特征1)包含作为同源臂的小鼠第16号染色体19265943和19260701之间的序列(lv arm)，并且在19263393位置插入了一个独特的线性化酶切位点noti；2)包含一个具有完整表达功能的嘌呤霉素抗性基因表达元件cag-puro-polya；3)包含一个不具有启动子的潮霉素b抗性基因编码区和polya，并且在该元件两端分别携带一个重组酶识别位点frt和loxp；在ace003-l1和ace003-l2载体中，frt和loxp的方向采用箭头所表示。
[0162]
步骤2，依次将ace003-l1,ace003-l2载体导入小鼠胚胎干细胞，分别用225μg/ml新霉素(neomycin)或1.25μg/ml嘌呤霉素(puromycin)筛选获得存活的胚胎干细胞克隆，对这些克隆使用常规pcr方式检测获得两个载体均敲入正确小鼠胚胎干细胞基因组位置的胚胎干细胞克隆；然后在这些胚胎干细胞克隆中引入表达cre重组酶的载体，使用50μg/ml潮霉素b(hygromycin b)筛选获得存活的胚胎干细胞克隆，对这些克隆使用常规pcr方式检测获得成功产生cre重组酶介导的大片段敲除的胚胎干细胞克隆，这些小鼠胚胎干细胞克隆的其中一条染色体上缺失了第16号染色体19065021至19260700这两个位置之间的小鼠内源性序列；在此步骤中，ace003-l1和ace003-l2可依次按任意顺序导入小鼠胚胎干细胞。该步骤中对同源重组打靶载体敲入小鼠胚胎干细胞的常规pcr方式采用同源臂区域外正向和反向引物pcr的鉴定方法(如图17所示)，引物的设计和pcr实验的具体操作步骤为本领域普通技术人员所熟悉。
[0163]
实施例4:人免疫球蛋白可变区中假性基因和开放读码框的敲除和鉴定
[0164]
人重链可变区dna片段来源于第14号染色体105863198和106879844位置之间，人kappa轻链可变区dna片段来源于第2号染色体88860568和90235398位置之间，人lambda轻链可变区dna片段来源于第22号染色体22023114和22922913位置之间。如图1所示，这些源自人类基因组的dna片段分段插入至含有非人dna片段的载体如细菌人工染色体(bac)，合适的bac可以通过ensembl查询，本发明使用的bac载体购自供应商source bioscience或者英潍捷基(上海)贸易有限公司。
[0165]
从包含原始状态的人免疫球蛋白可变区基因片段的bac中将不需要的假性基因和开放读码框dna区段去除的过程在大肠杆菌中完成，示例性敲除过程如图8所示，具体步骤描述为：
[0166]
步骤1，1.1)准备包含人免疫球蛋白可变区dna区段的细菌人工染色体bac1(携带
氯霉素抗性)，该bac1已经预先转入基因工程宿主大肠杆菌dh10b(供应商：source bioscience)；1.2)准备重组酶表达载体，例如pkd46(供应商：奥诺基因，货号：hg-vjc0521，参考文献datsenko,ka,bl wanner 2000.one-step inactivation of chromosomal genes in escherichia coli k-12using pcr products.proc.natl.acad.sci.u.s.a.97(12):6640-5.)，该载体包含阿拉伯糖诱导重组酶(例如来源于大肠杆菌λ噬菌体redα/redβ/redγ蛋白)表达元件，温度敏感的质粒载体复制子元件以及氨苄青霉素抗性基因；1.3)将pkd46用常规电穿孔转染的方法导入包含bac1的dh10b宿主大肠杆菌，并将大肠杆菌接种在含有氯霉素和氨苄青霉素的lb固体培养基(供应商：青岛海博，货号：hb0129)平板上30摄氏度培养过夜；2)第二天挑取大肠杆菌单克隆在含有氯霉素(供应商：生工生物，货号：a100230)和氨苄青霉素(供应商：生工生物，货号：a100339)的液态lb培养基(供应商：青岛海博，货号：hb0128)中在30摄氏度培养条件下摇菌16小时，所得菌株命名为大肠杆菌甲。
[0167]
步骤2，2.1)pcr模板rpsl/teta序列可参看seq id no:1，设计并合成如图8a所示的正向引物和反向引物(供应商：生工生物)，正向引物包含50bp的待敲除区域5’端同源臂区域ha1和rpsl/teta的5’端引物区，反向引物包含50bp的待敲除区域3’端同源臂区域ha2和rpsl/teta的3’端引物区，引物的设计原则为本领域技术人员所熟悉；2.2)利用上述正向引物和反向引物采用聚合酶链式反应技术(pcr)获得两端各有50bp同源臂和rpsl/teta表达元件的dna片段(图示8a)；2.3)按照终浓度为od600＝0.1的浓度在3毫升含有氯霉素和氨苄青霉素的液态lb培养基中重新接种步骤1.3)所获得的大肠杆菌甲菌液，加入45微升浓度为10％的l( )阿拉伯糖(供应商：生工生物，货号：a610071)在37摄氏度摇床中培养3-5个小时诱导表达重组酶，直到菌液od600＝0.6；2.4)采用电穿孔转染的方式将步骤2.2)所获得的rpsl/teta片段导入2.3)步骤中的大肠杆菌甲，重组酶介导的同源重组将rpsl/teta定点替换待敲除的dna片段(图示8b)，在含有氯霉素和四环素(供应商：生工生物，货号：a100422)的lb固体培养基平板上37摄氏度培养过夜；2.5)挑取步骤2.4)所获得的菌落克隆在含有氯霉素和四环素的lb液态培养基中37摄氏度培养，使用图示8c中的筛选引物1和2采用pcr鉴定和pcr产物测序的方法鉴定含有正确敲除了待敲除区域bac1的大肠杆菌克隆，命名为大肠杆菌乙；
[0168]
步骤3，3.1)按照步骤1.3)所述方法将pkd46载体导入步骤2.5)所获的含有正确敲除了待敲除片段bac1的大肠杆菌乙克隆，命名为大肠杆菌丙；3.2)设计和合成按顺序连接的50bp同源臂ha1和50bp同源臂ha2的双链dna片段ha1-ha2；3.3)将步骤3.2)中所述dna片段采用电穿孔转染的方式导入步骤3.1)所获得的大肠杆菌丙，导入步骤可参考步骤2.3)-2.4)所述方法，重组酶介导的同源重组将ha1-ha2片段定点替换敲除bac1中待敲除区域时所插入的rpsl/teta片段(图示8d)，在含有氯霉素和链霉素(供应商：生工生物，货号：a100382)的lb固体培养基平板上37摄氏度培养过夜；3.4)挑取步骤3.3)所获得的菌落克隆在含有氯霉素和链霉素的lb液态培养基中37摄氏度培养，使用图示8e中的筛选引物1和2采用pcr鉴定和pcr产物测序的方法鉴定含有正确敲除了rpsl/teta区域bac1的大肠杆菌克隆；
[0169]
步骤4，如果bac1中含有多个待敲除的假性基因或开放读码框区域，重复步骤1至步骤3即可分别敲除各个待敲除区域直到所有目标假性基因或开放读码框区域在bac1中均被敲除。当分段的人免疫球蛋白可变区dna分别插入不同的bac载体中时，假性基因和开放
读码框区域的敲除可以在不同的bac载体中分别独立实施敲除步骤，最终保留的dna片段可以按照公开文献“assisted large fragment insertion by red/et-recombination(alfire)—an alternative and enhanced method for large fragment recombineering”中的步骤拼接起来。
[0170]
在本发明的具体实施方式中，一般，对于“部分或全部敲除”或“部分或全部缺失”，10-100％(优选15-95％，20-90％,例如25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、72％、75％、78％、80％、83％、85％或88％)的假性基因和/或开放读码框基因被敲除或缺失,该百分比基于人免疫球蛋白可变区基因的假性基因和开放读码框基因的总数量。
[0171]
例如，本发明的具体实施方式中，至少有80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的假性基因和/或开放读码框被敲除。
[0172]
例如，在一个实施方式中，敲除或缺失10-25个假性v基因和/或开放读码框基因；在另一个实施方式中，敲除或缺失10、15或25个假性v基因和/或开放读码框基因。
[0173]
在敲除人免疫球蛋白基因簇区域中的假性基因和/或开放读码框过程中，保留的功能性基因片段的调控区域，基因编码区域和抗体基因重组信号序列可以是源自同一个免疫球蛋白可变区基因的连续片段，也可以是源自不同免疫球蛋白基因的调控区域，基因编码区和抗体基因重组信号的重新组合，例如调控区域来源于人va基因的5’端调控区域，编码序列来源于vb基因，抗体基因重组信号序列来源于vc基因(如图9所示)。
[0174]
在其中一个实施方式中，构建了如图10的重链打靶载体1，按照上述步骤敲除了表1中人免疫球蛋白重链v区中的h2，h4，h9，h11，h13，h15，h19，h21，h23，h17这10个包含假性vh区基因或者开放读码框vh区基因的dna片段，保留了h1，h3，h5，h6，h7，h8，h10，h12，h14，h16，h18，h20，h22，h24包含了功能性人重链vh区基因ighv6-1，ighv1-2，ighv1-3，ighv4-4，ighv7-4-1，ighv2-5，ighv3-7，ighv1-8，ighv3-9，ighv3-11，ighv3-13，ighv3-15，ighv1-18，ighv3-20，ighv3-21，ighv3-23，和来源于人第14号染色体105863198和105939714之间的包含人免疫球蛋白重链dh基因区和jh基因区序列，以及在113426008位点插入了独特线性化酶切位点noti的来源于鼠12号染色体113428513和113423504之间的序列按图10所示按顺序连接；该重链打靶载体1携带有新霉素抗性表达元件pgk-neo-polya，重组酶识别位点frt以及pbace3.6细菌人工染色体质粒骨架。该载体构建结束后采用了两种不同的方式鉴定其dna片段是否有dna片段的缺失。第一种鉴定方式为用sali或agei酶切后通过脉冲电泳来判断其酶切图谱是否符合预期，如图11所示，两组不同的酶对来源于两个不同菌落克隆a和b的重链打靶载体1进行酶切后各片段大小均符合预期，说明这两个克隆来源的重链打靶载体1缺失大片段dna的风险较低；第二种鉴定方式如图12所示，在重链打靶载体1中随机设计24对引物cargo1-cargo24(如表2所示)，每对引物在载体中的距离大约为10kb，然后以两个不同菌落克隆a和b来源的重链打靶载体1进行这24对引物的pcr扩增，通过产物的大小以及产物是否存在可以说明这两个克隆来源的重链打靶载体1缺失大片段dna的风险较低。
[0175]
表2.人免疫球蛋白基因片段特异性引物对cargo1-24(表中seq id no:一列，偶数对应正向引物，奇数对应反向引物)
[0176][0177][0178]
在另一个实施例中，构建了如图10的重链打靶载体2，其具体特征为，第14号人染色体106879844和106268567之间的序列中，按照前述步骤在大肠杆菌中敲除了如表1所述序列编号h26，h28，h35，h39，h41，h43，h46，h49，h51，h53，h57，h59，h61，h64，h68这15个包含假性vh基因或者开放读码框vh区基因的dna片段，保留了如表1所述序列编号h25，h27，h29，h31，h33，h36，h38，h40，h42，h44，h45，h47，h48，h50，h52，h54，h55，h56，h58，h60，h62，h63，h65，h66，h67这25个包含功能性vh区基因的片段和如表1所述序列编号h30，h32，h34，h37这几个假性vh区基因片段以及h35基因片段，以及作为同源臂的第14号人染色体106276506和106268567之间的序列，其中同源臂的106273423位点插入了独特线性化酶切位点pmei，这些dna片段按照图10所示按顺序连接；该重链打靶载体2携带有嘌呤霉素抗性表达元件cagpuro-polya，重组酶识别位点frt以及pbace3.6细菌人工染色体质粒骨架。重链打靶载体2的用途是在重链打靶载体1定向导入小鼠12号染色体113428513和113423504位置后，以重链打靶载体1中携带进入的第14号人染色体106276506和106268567之间的序列为同源臂将重链打靶载体2上的更多v区基因片段导入小鼠胚胎干细胞第12号染色体。
[0179]
在另一个实施例中，构建了如图13所示的kappa轻链打靶载体，其具体特征为，第2号人染色体89333431和88860568之间的序列中，按照前述步骤在大肠杆菌中敲除了如表1所述序列编号k3，k6，k9，k12，k16，k19，k21，k24，k26，k28这10个包含假性基因或开放读码框的区域，保留了如表1所述序列编号k1，k2，k4，k5，k7，k8，k10，k11，k13，k14，k15，k17，k18，k20，k22，k23，k25，k27，k29，k30这20个包含功能性人kappa轻链v
l
区基因和第2号人染色体88861967和88860568之间的人免疫球蛋白kappa轻链j
l
基因区，连同作为同源臂的小
鼠6号染色体70723924和70729434之间的序列，其中该同源臂在第70726623位点插入独特线性化酶切位点noti，该kappa轻链打靶载体携带有新霉素抗性表达元件pgk-neo-polya，重组酶识别位点frt以及pbace3.6细菌人工染色体质粒骨架。
[0180]
在另一个实施例中，构建了如图14所示的lambda轻链打靶载体1和2，lambda轻链打靶载体1包含来源于人第22号染色体中的22881432和22922913之间的包含人免疫球蛋白lambda轻链j-c基因区序列，按照前述步骤在大肠杆菌中敲除了如表1所述序列编号l2，l4，l10，l12，l14，l17，l19，l21，l23，l25，l28，l30这12个包含假性基因或开放读码框的区域，保留了如表1所述序列编号l1，l3，l5，l6，l7，l8，l9，l11，l13，l15，l16，l18，l20，l22，l24，l26，l27，l29，l31这19个包含功能性人lambda轻链v
l
区基因的区域，以及作为同源臂的小鼠6号染色体70726758和70731223之间的序列，其中同源臂在第70729051位点插入独特线性化酶切位点fsei，该lambda轻链打靶载体1携带有新霉素抗性表达元件pgk-neo-polya，重组酶识别位点frt以及pbace3.6细菌人工染色体质粒骨架；lambda轻链打靶载体2则按照前述步骤在大肠杆菌中敲除了如表1所述序列编号l36，l38，l41，l43，l45，l48，l50这7个包含假性基因或开放读码框的区域，保留了包含如表1所述序列编号l32，l33，l34，l35，l37，l39，l40，l42，l44，l46，l47，l49这12个包含功能性人lambda轻链v
l
区基因的区域，以及作为同源臂的人22号染色体22381387和22387465之间的序列，其中该同源臂在第22383529位点插入线性化酶切位点noti，该lambda轻链打靶载体2携带有嘌呤霉素抗性表达元件cagpuro-polya，重组酶识别位点frt以及pbace3.6细菌人工染色体质粒骨架。其用途是在lambda轻链打靶载体1定向导入小鼠6号染色体70726758和70731223位置后，以lambda轻链打靶载体1中携带进入的第22号染色体22381387和22387465之间的序列为同源臂将lambda轻链打靶载体2上更多的v区基因片段导入小鼠胚胎干细胞第6号染色体。
[0181]
所述重链打靶载体2，kappa轻链打靶载体和lambda轻链打靶载体1和2的dna完整性鉴定方法采用与重链打靶载体1类似的载体限制性内切酶酶切片段脉冲电泳和随机小片段pcr鉴定方法。
[0182]
实施例5:通过同源重组将打靶载体定向导入小鼠胚胎干细胞
[0183]
在其中一个实施例中，目标细胞为实施例1中通过2步基因打靶和重组酶cre敲除了小鼠第12号染色体113428530至116027502之间区域的小鼠胚胎干细胞，所采用的打靶载体为重链打靶载体1(图10所示)，定向导入的过程可参考图15和图16所示，具体步骤为：
[0184]
步骤1，将1-2
×
107目标小鼠胚胎细胞用50μg线性化的重链打靶载体1通过电穿孔(240v,250uf，bio-rad gene pulser)进行转染，其中电穿孔转染的方法为本领域普通技术人员所熟悉。根据打靶载体上所携带的抗性基因，转染后的细胞在24-48小时内用225μg/ml新霉素选择成功转染的细胞克隆，进行7天。挑取抗生素抗性细胞克隆至96孔培养板中进行扩大培养和基因型鉴定。
[0185]
步骤2，取部分步骤1中所获得的抗生素抗性细胞提取其基因组dna后按照图17所示设计同源臂区域外正向和反向引物进行常规pcr扩增，1)引物p1和p2分别设计在野生型等位基因目标同源臂5’端和3’端，两个引物的序列均处于同源臂区域以外；2)引物p3和p4分别设计在打靶载体同源臂5’端和3’端，两个引物的序列均处于同源臂区域以外；3)当线性化的打靶载体通过同源重组插入野生型等位基因目标同源臂位点时，使用p1和p4，p3和p2引物分别可pcr扩增出片段大小大于同源臂区段大小的dna片段p1p4和p3p2，而分别使用
p1和p4，p3和p2引物均无法在仅有野生型等位基因模板或打靶载体模板的pcr体系中扩增出片段大小大于同源臂区段大小的dna片段。通过分析p1p4和p3p2这两个pcr产物的片段大小和序列即可判断方案中的打靶载体是否通过同源重组精准插入野生型等位基因目标同源臂区域。如图18所示，在重链打靶载体1定向导入目标小鼠胚胎干细胞后，p1p4产物大小为5.3kb，p3p2产物大小为5.4kb，该结果显示，本次定向导入获得了多个按照预期成功导入至小鼠胚胎干细胞目标区域的细胞克隆。p1p4和p3p2扩增产物可以通过测序的方式进一步确认。
[0186]
导入小鼠胚胎干细胞的人重链打靶载体1中的人免疫球蛋白可变区基因的完整性鉴定可以通过以这些成功靶向导入的细胞基因组为模板通过pcr鉴定，如表2所示cargo1至cargo24为引物进行pcr扩增鉴定，选用cargo1-24均能获得预期大小的pcr产物，表明小鼠胚胎干细胞克隆为成功导入人免疫球蛋白可变区基因座且无重大dna片段缺失风险的克隆。
[0187]
在其中一个实施例中，如图15和16所示，人免疫球蛋白重链可变区16个人vh功能性基因和27个人dh基因及6个人jh基因通过重链打靶载体1导入完成了实施例1中所示所有步骤后的小鼠胚胎干细胞，该胚胎干细胞克隆进一步通过重链打靶载体2导入另外的25个的人vh功能性基因。
[0188]
在其中一个实施例中，如图19和20所示，人免疫球蛋白kappa轻链可变区20个人kappa v
l
功能性基因和5个kappa j
l
基因通过kappa轻链打靶载体导入完成了实施例2中所示所有步骤后的小鼠胚胎干细胞。
[0189]
在其中一个实施例中，如图21和22所示，人免疫球蛋白lambda轻链可变区19个人lambda v
l
功能性基因和全部7个lambda j
l
基因及lambda c
l
基因通过lambda轻链打靶载体1导入完成了实施例3中所示所有步骤后的小鼠胚胎干细胞，该胚胎干细胞克隆进一步通过lambda打靶载体2导入另外12个人lambda v
l
功能性基因。在lambda轻链打靶载体1导入完成后向细胞导入flp表达，允许两个frt位点之间产生重组而敲除两个frt之间的序列从而去除残留的源于lambda轻链打靶载体的非人源dna序列和小鼠内源性kappa c
l
编码序列。
[0190]
在图15-16，19-20，21-22所示实施例中的包含人免疫球蛋白可变区基因导入小鼠胚胎干细胞之前，这些人免疫球蛋白可变区v区基因中的部分或全部假性v区基因和/或开放读码框v区基因被敲除，因此最终导入小鼠胚胎干细胞的v区基因区域的片段大小仅占ensembl grch38.p13版本的人类基因组数据库中人免疫球蛋白v区域大小的一部分，其百分比总结如下表3所示：
[0191]
表3.完成实施例5中各打靶步骤后导入细胞的v区基因片段占对应v区总长的百分比
[0192][0193]
注释：(1)计算人重链v区总长时，按照ensembl grch38.p13第14号染色体位置105939715和106879844之间计算，总长940130bp；(2)计算人kappa轻链近端v区总长时，按照ensembl grch38.p13第2号染色体88861968和89333431之间计算，总长471464bp；(3)计算人lambda轻链v区总长时，按照ensembl grch38.p13第22号染色体22023114和22881431之间计算，总长858318bp。
[0194]
实施例6:小鼠胚胎干细胞的转化(conversion)和繁殖
[0195]
由基因编辑后的小鼠胚胎干细胞转化(conversion)成为转基因小鼠的技术为本领域普通技术人员所熟悉。当基因型鉴定合格的小鼠胚胎干细胞克隆通过核型检测确定其染色体数目无增加或者减少后，该克隆的小鼠胚胎干细胞处理稀释为注射密度并注射入约50枚2.5-3.5日龄的囊胚腔中，然后将显微注射的囊胚回送到代孕鼠输卵管或子宫中，待小鼠出生后，通过鼠尾dna为模板，利用基因编辑特异性的引物即可pcr鉴定子代嵌合体的基因型确定基因编辑后的小鼠胚胎干细胞是否贡献到了嵌合体子代小鼠的体细胞中。将子代嵌合体小鼠与野生型不同性别的小鼠进行合笼繁殖后获得子一代小鼠(f1)，用同样的pcr方法鉴定f1代小鼠的基因型，即可判断该基因编辑的小鼠胚胎干细胞是否能够实现种系传递(germline transmission)，f0代和f1代小鼠基因型鉴定的引物设计原则和实施方案为本领域普通技术人员所熟悉。
[0196]
在其中一个实施例中，按照上述方法，实施例5所获得的成功导入人免疫球蛋白重链可变区基因座且通过了如表2所示的cargo1-24的pcr扩增鉴定和核型检测的小鼠胚胎干细胞被注射入2.5-3.5日龄小鼠胚胎囊胚腔中并最终获得了f1代小鼠；在另一个实施例中，按照图示19和图示20方案将图13所示kappa轻链打靶载体导入小鼠胚胎干细胞同样获得了f1代小鼠，这两种f1代小鼠通过杂交的方式繁殖成为了重链打靶载体1所在位点和kappa轻链打靶载体所在位点均为纯合子的小鼠；在另一个实施例中，按照图示21和图示22方案将图14所示lambda轻链打靶载体1和2导入小鼠胚胎干细胞同样获得了f1代小鼠。表4显示了
本发明所获得的几种转基因小鼠的特征。
[0197]
表4.本发明获得的转基因小鼠的特征
[0198]
[0199][0200]
表4中涉及的可变区v基因的序列参见表1。
[0201]
实施例7:转基因鼠的b细胞发育测试
[0202]
在大多数哺乳动物中，脾脏是b细胞含量丰富的器官，对脾脏中b细胞的分析可以判断该动物的b细胞发育是否正常。获取(实施例6中获得的转基因)小鼠脾脏并分离脾脏细胞，以及对脾脏来源的细胞进行流式细胞分析技术为本领域普通技术人员所熟悉。将实施例6中转基因小鼠1组(在图23中为纯合子转基因鼠组)在未免疫的情况下取其脾脏并分离脾脏细胞，并且与杂合型转基因小鼠和野生型同窝对照小鼠来源的脾脏细胞进行流式细胞分析对比，选取b220
阳性
/igm
高
/igd
低
细胞为非成熟型的b细胞，b220
阳性
/igm
低至中等
/igd
高
为成熟
型b细胞，如图23所示，野生型同窝对照小鼠，杂合子转基因小鼠和纯合子转基因鼠组在成熟型和非成熟型b细胞的比例方面没有统计学差异，说明本发明获得的转基因小鼠1组的b细胞发育是正常的。相似地，转基因小鼠2组和转基因小鼠3组在成熟型和非成熟型b细胞的比例方面与野生型同窝对照小鼠、杂合子转基因小鼠均没有统计学差异，b细胞发育正常。
[0203]
实施例8:转基因小鼠的免疫测试
[0204]
本发明的目的之一是获得表达可变区编码基因来源于人的抗体的转基因动物，并且这种转基因动物在抗原刺激下可正常产生抗原特异性免疫反应。对实施例6所获得的转基因小鼠1组和2组以及对照组野生型balb/c小鼠进行了同样剂量，相同免疫方案的卵清蛋白(ova，供应商：sigma-aldrich，货号：a5503)免疫。在免疫第三次加强后，取小鼠血清进行ova特异性的酶联免疫反应(elisa)，其中抗原特异性的酶联免疫反应方法为本领域普通技术人员所熟悉。结果如图24所示，转基因小鼠1组和转基因小鼠2组均能够产生优于野生型balb/c小鼠的抗原特异性免疫反应。
[0205]
实施例9.转基因小鼠在全人源候选抗体药物发现中的应用实例
[0206]
由于可产生可变区编码基因来自于人免疫球蛋白可变区重排的抗体，本发明的小鼠模型重要用途之一是用于全人源候选抗体药物的发现。采用特定抗原分阶段刺激转基因小鼠使其产生针对该特定抗原的特异性免疫反应，并且取小鼠脾脏和/或淋巴结进行细胞融合获得永生化且可持续分泌抗体的杂交瘤的技术为本领域技术人员所熟悉。
[0207]
针对免疫球蛋白编码基因簇的基因编辑对小鼠的b细胞发育产生了重要的负面影响，其中所能客观反映的可能现象之一是小鼠针对抗原的特异性免疫反应仅能产生亲和力低下的抗体。利用本发明实施例6所获得的转基因小鼠1组，2组和3组的小鼠模型，采用杂交瘤技术针对人bcma,galectin-10或tgfb1三个不同的靶点分别获得了12，12和20株不同的抗原特异性单克隆抗体。采用biacore t200(ge healthcare)测定这些抗体的亲和力水平(图25)可以得出，这些从本发明的小鼠模型获得的针对三个不同靶点均能获得在pm范围的高亲和力水平抗体，测定的亲和力水平区间分别在10pm-1nm，1pm-10nm，1pm-10nm范围内。
[0208]
采用本发明的方法制备的转基因小鼠不论是在b细胞的发育水平，还是对抗原特异性免疫反应以及抗体的亲和力水平方面都显示出了令人惊讶的效果，这些效果是本领域技术人员预料不到的。
[0209]
前述公开的特定实施方式不应限制本发明和权利要求的范围，因为这些实施方式是为了举例说明本发明的几个方面。任何等价实施方案都应该属于本发明范畴。通过前面的描述，除了本文已经描述的修饰，本领域技术人员对本发明进行多种其他修饰，这些修饰也应该属于本发明的范畴。