一种源于双歧杆菌的β-半乳糖苷酶及其应用的制作方法

一种源于双歧杆菌的
β
‑
半乳糖苷酶及其应用
技术领域
1.本发明属于蛋白酶技术领域，具体涉及一种来源于双歧杆菌的β
‑
半乳糖苷酶及其应用。


背景技术：

2.β
‑
半乳糖苷酶参与催化β
‑
d
‑
半乳糖苷中末端β
‑
1,4
‑
d
‑
半乳糖残基的水解过程，如乳糖的水解。同时它也可参与转糖基化反应生成低聚半乳糖和低聚果糖。在碳水化合物活性酶数据库中，根据它们的序列、活性和结构将其分为五个不同的家族(gh1、gh2、gh35、gh42和gh59)。β
‑
半乳糖苷酶在食品工业中广泛用于改善乳制品和焙烤制品的风味。它也可以将乳清转化为有用的产品，如乙醇和甜糖浆，或者通过将乳清转化为乳酸从而解决乳清加工的问题。此外，它在化学反应中产生有色产物的能力使其在分子生物学中越来越重要。
3.对于人类而言，β
‑
半乳糖苷酶是人体内的一种重要糖苷水解酶，它负责水解饮食中的乳糖以产生半乳糖和葡萄糖。部分人群的肠道中可以正常产生β
‑
半乳糖苷酶，因此他们可以正常消化利用乳糖。而一些特殊的人群，特别是食物主要来自母乳和富含乳糖的配方奶粉的婴儿，一旦他们的肠道中缺乏β
‑
半乳糖苷酶不仅会引起乳糖不耐受，同时也不利于婴儿的生长和发育。此外据报道，欧洲和美国的乳糖不耐受人群在2％至70％之间。而全球乳糖不耐受人群的不断增加，导致市场对无乳糖乳制品的需求也随之增加。此外市场仍需要具有更宽范围的热稳定性和酸碱度稳定性的β
‑
半乳糖苷酶以适应工业下游工艺。尽管从微生物中生产β
‑
半乳糖苷酶的研究已经很普遍，但其中许多不能直接用于食品行业。而来自益生微生物的β
‑
半乳糖苷酶对人类使用是安全的，因此，挖掘来源于益生菌的β
‑
半乳糖苷酶是本领域技术人员亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种β
‑
半乳糖苷酶，该酶来源于双歧杆菌，具有较高的酶活性。
5.本发明采用以下技术方案实现本发明的目的：
6.第一个目的在于本发明提供了一种β
‑
半乳糖苷酶，所述β
‑
半乳糖苷酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。
7.本发明中的β
‑
半乳糖苷酶来自双歧杆菌，该酶的一级结构由719个氨基酸组成。其中，e161与e321是关键催化位点，r122和n160可能是结合位点，y170可能是金属结合位点，n332可能是催化点。本发明的β
‑
半乳糖苷酶具有良好的ph耐受性，在ph＝4.0～9.0的范围内均都能保持80％及以上的活性，其酶活比活力可达3826.28u/mg。经试验验证本发明的β半乳糖苷酶在牛乳中降解乳糖的比活力为2.34
±
0.19u/mg，在酸性乳清的比活力为4.84
±
0.78u/mg。表明本发明的β
‑
半乳糖苷酶的酶学性质优良。
8.优选地，所述编辑如seq id no:1所示的基酸序列的基因，其核苷酸序列如seq id no:2所示。
9.本发明的第二个目的在于提供一个基因，所述基因的核苷酸序列如seq id no:2所示。
10.本发明的第三个目的在于提供一种重组表达载体，所述载体含有如seq id no:2所示的核苷酸序列。
11.本发明的第四个目的在于提供一种重组菌，所述重组菌含有如上所述的重组表达载体。
12.本发明的第五个目的在于提供一种酶制剂，所述酶制剂含有本发明的β
‑
半乳糖苷酶。本发明β
‑
半乳糖苷酶不仅能分解乳制品中的β
‑
1,4
‑
d
‑
半乳糖残基化合物，还能分解酸性乳清中的β
‑
1,4
‑
d
‑
半乳糖残基化合物，具有一定的耐酸性。
13.本发明的第六个目的在于提供本发明β
‑
半乳糖苷酶在分解乳制品或酸性乳清中β
‑
1,4
‑
d
‑
半乳糖残基化合物中的应用。
14.本发明的有益效果为：本发明的β
‑
半乳糖苷酶最适温度为45℃，最适ph＝5.5，在35～50℃都能具有良好的酶活性，良好的ph耐受性，特别是在ph＝4.0～9.0的范围内几乎都能保持80％及以上的活性。水解onpg的比活力为3826.28
±
137.56u/mg，km为1.75
±
0.2mmol/l，kcat为5127
±
183s
‑
1，kcat/km为2928mm
·
s
‑
1。本发明的β
‑
半乳糖苷酶b17_2在牛乳中降解乳糖的比活力为2.34
±
0.19u/mg，在酸性乳清的比活力为4.84
±
0.78u/mg。
附图说明
15.图1重组蛋白b17_2表达电泳图，其中m：蛋白分子量marker
16.图2b17_2蛋白序列在ncbi数据库中序列比对结果图和保守结构域图
17.图3b17_2与双歧杆菌已知的双歧杆菌β
‑
半乳糖苷酶序列比对中存在保守氨基酸残基位置图
18.图4b17_2与thermus thermophiles的β
‑
半乳糖苷酶序列比对的关键氨基酸残基位置图
19.图5重组β半乳糖苷酶b17_2对onpg的水解活性曲线图
20.图6重组β半乳糖苷酶b17_2的酶动力学拟合曲线图
具体实施方式
21.为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案。如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
22.实施例1：获得β半乳糖苷酶(本发明中称为：b17_2)
23.1、β半乳糖苷酶b17_2的重组表达载体的构建：
24.根据基因和表达载体pet28a的序列特点，采用在线软件nebcutter v2.0和genscrip进行引物设计：
25.primerf：aaaaaacatatgactactcgtagaacgttcagg
26.primerr：gtggtgctcgagttagcaggacgttttagcg
27.以双歧杆菌b.longum020402菌株的基因组为模板，使用high
‑
fidelity dna polymeras(new england biolabs)通过pcr扩增获得b17_2的dna片段，该片
段的核苷酸序列如seq id no:2所示，pcr体系如下：
28.表1
[0029][0030]
pcr反应条件为95℃预变性5min，95℃解链30s，72℃退火2min，72℃延伸10min，32个循环。
[0031]
将质粒pet28a与纯化后的pcr产物同时双酶切。酶切体系为：pcr纯化产物/质粒20μl，内切酶ndei 2μl，内切酶xhoi 2μl，buffer 5μl，无菌水21μl。酶切条件为37℃/1.5h。将酶切后的质粒和pcr产物纯化后用t4连接酶进行连接，连接条件为室温2h。将连接产物用热激法转化dh5α质粒构建重组菌株，涂布于lb(含卡那霉素)平板，过夜培养后，挑取阳性菌落，经pcr检测后送测序验证(上海生工生物有限公司)与基因核苷酸序列对比。选取无突变的重组质粒用热激法转化bl21表达菌株。
[0032]
2、重组β半乳糖苷酶b17_2的制备：
[0033]
将含有重组质粒的bl21表达菌株接种于含有卡那霉素的sb液体培养基中，37℃震荡培养4～6h，随后将摇床温度降至18℃，继续培养30min后加入200μl浓度为1mol/l的iptg，再继续培养48～72h。培养好的菌液低温高速(9000
×
g，4℃，20min)离心收集菌体，然后用35ml裂解液(1mol/l nacl,50mmol/lnah2po4,70mmol/l na2hpo
4 and 50mmol/l咪唑,ph＝7.6～7.8)重悬于50ml离心管中，再加入0.2g溶菌酶进行裂解，随后放入
‑
80℃冰箱冻存。冻存12h后从
‑
80℃冰箱取出菌悬液自然解冻后，用超声破碎仪进行间歇破碎(600w，40～50min)至菌液不再浑浊。将破碎后的液体转移至高速离心管中进行低温高速离心(4℃，24000
×
g，30min)，之后小心将上清液吸出并用0.8μm的滤膜进行过滤。取出在4℃条件下冷藏保存的蛋白纯化镍柱，首先用裂解液(约50ml)平衡柱子。再将过滤后的蛋白溶液以速度为3ml/min进行上柱，上柱完成后以速度为5ml/min进裂解液除去柱缝隙间的杂蛋白。之后将洗涤液换成洗脱液(150mmol/l nacl,150mmol/l nah2po4,50mmol/l na2hpo
4 and 200mmol/limidazole,ph＝7)，速度可保持不变。纯化的酶用交换液(100mmol/l nacl,100mmol/l nah2po
4 and 50mmol/l na2hpo4,ph＝7.2)透析。蛋白经sds
‑
page检测样品分子量为75kda，纯度大于90％(图1)。
[0034]
实施例2：重组β半乳糖苷酶b17_2的序列分析
[0035]
经分析后发现本发明重组β半乳糖苷酶b17_2的一级结构由719个氨基酸组成，其具体氨基酸序列如seq id no:1所示。将其与ncbiblastp中的序列比较表明数据库中已经存在该酶的序列，但没有相关的表征。蛋白质保守结构域的比较表明酶b17_2的结构由属于gh42家族的β
‑
半乳糖苷酶(氨基酸序列25
‑
398)和β
‑
半乳糖苷酶形成几种聚合物的结构域(氨基酸序列411
‑
622)组成(图2)。
[0036]
将b17_2的一级序列与gh42家族的其他β
‑
半乳糖苷酶的一级序列进行比较(图3)，后者的序列属于碳水化合物数据库的gh42家族且属于双歧杆菌。比对结果显示存在一系列保守的氨基酸残基，p28、d39、a46、g47、n49、w58、d75、d78、t93、p97、w99、p106、g114、g120、r122、p130、n160、e161、n193、a195、w201、p214、f235、d238、t262、d288、y290、w329、g339、a350、g352、d354、e369、g393、w424、d457、p460、y468、p474、g494、g495、d507、p518、g530、a601、g610、l619和g658，它们是100％保守的。在这些绝对保守的氨基酸残基中，e161是关键催化位点，e321也是关键催化位点。此外，与abi35985.1(来自嗜热栖热菌thermus thermophiles的β
‑
半乳糖苷酶)相比表明r122和n160可能是结合位点，y170可能是金属结合位点，n332可能是催化点(图4)，同时abe95118.1与b17_2的相似度为86.90％。
[0037]
实施例3：重组β半乳糖苷酶b17_2水解活性
[0038]
将1min内水解onpg(邻硝基苯β
‑
d
‑
半乳吡喃糖苷，作为β
‑
半乳糖苷酶的底物)释放1μmol onp(邻硝基酚)的酶量作为一个活力单位1u。组β半乳糖苷酶b17_2和商业β
‑
半乳糖苷酶(diamond，china)，酶浓度分别为0.87μg/ml和0.044mg/ml，加入含2mmol/l onpg的pbs缓冲溶液反应体系中，于不同温度下反应，测定温度对酶活力的影响。重组β
‑
半乳糖苷酶b17_2和商业β
‑
半乳糖苷酶，加入含2mmol/l不同ph值的onpg的缓冲溶液反应体系中，于最适温度下反应，测定ph值对酶活力的影响。在最适ph条件下，重组β半乳糖苷酶b17_2和商业β
‑
半乳糖苷酶在不同温度下保温不同时间后，加入含2mmol/l的onpg溶液反应体系中，于最适温度下测定酶的温度稳定性。在最适温度条件下，重组β
‑
半乳糖苷酶b17_2和商业β
‑
半乳糖苷酶加入不同ph缓冲溶液保温30min后，加入含2mmol/l onpg的各自最适ph缓冲溶液反应体系中，测定酶的酸碱耐受性。以pbs缓冲液中onp的410nm处的吸光度制作标准曲线。
[0039]
结果表明β
‑
半乳糖苷酶b17_2的最适温度为45℃，最适ph＝5.5(图5a，b)，有良好的ph耐受性(将酶原液与不同ph值的缓冲溶液37℃保温30min后测定残留酶活)，特别是在ph＝4.0～9.0的范围内几乎都能保持80％及以上的活性(图5e)。β
‑
半乳糖苷酶b17_2水解onpg(图6a)，比活力为3826.28
±
137.56u/mg，km为1.75
±
0.2mmol/l，kcat为5127
±
183s
‑
1，kcat/km为2928mm
·
s
‑
1。而商业β
‑
半乳糖苷酶最适温度为45℃，最适ph＝7.0(图5a，b)，对酶反应温度敏感(图5c)且对ph不耐受。商业β
‑
半乳糖苷酶水解onpg(图6b)，比活力57.02
±
1.50u/mg，km为0.34
±
0.04mmol/l。
[0040]
实施例4：重组β半乳糖苷酶b17_2对牛乳和酸性乳清中的乳糖降解率
[0041]
重组β半乳糖苷酶b17_2，加入牛乳或酸性乳清，在45℃下反应10min。采用3，5
‑
二硝基水杨酸dns法测定酶活力。将1min水解乳糖产生1μmol还原糖的酶量作为一个活力单位1u。
[0042]
结果表明重组β半乳糖苷酶b17_2在牛乳中降解乳糖的比活力为2.34
±
0.19u/mg，在酸性乳清(ph＝3.6)中的比活力为4.84
±
0.78u/mg。
[0043]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。