一种人乳内源性的抗菌肽及其应用

1.本发明涉及一种来源于人乳的内源性抗菌多肽tldggfiyeaglapyklrpv及其应用。


背景技术：

2.抗生素是能抵抗致病微生物的药物，是抗菌消炎药中最大的一类。抗生素是由细菌、真菌或其他微生物在生活过程中所产生的物质，具有抑制或杀灭细菌、真菌等致病微生物的作用，因此作为抗感染药物广泛地应用于各种感染性疾病。抗生素在治疗感染中的显著效果也导致了细菌耐药性，使部分感染性疾病的治疗变得愈加困难。抗菌肽作为一种新型的抗生素，具有广谱的抗菌活性，不会轻易使微生物产生耐药性，具有广阔的应用前景。
3.抗菌肽在自然界中广泛分布，作为被广泛关注的一种新型抗生素，越来越多的抗菌肽在微生物、动植物体内被发现。目前解析的抗菌肽构效关系中有两个较清晰的特征，分别是“带正电荷的阳离子”和“两亲性序列结构”。然而抗菌肽作为抗菌药物仍然面临许多待解决的问题：部分阳离子抗菌肽可以对哺乳动物的细胞产生较大的毒性作用；两亲性结构则要求氨基酸序列中有一定数量的碱性氨基酸，而碱性氨基酸易被蛋白酶水解的特性使得其作为药物进入人体后发挥效果大大受限。因此，开发安全、稳定、低细胞毒性的抗菌肽具有重要意义。
4.母乳作为婴儿最佳的天然食物，是丰富的蛋白质和多肽资源，兼顾抗菌肽的优势及人乳优质安全的蛋白来源两个特质。人乳腺中的内源性酶对蛋白质有较强的水解作用，而来源于人乳中稳定存在的内源性抗菌肽，其本身的存在就解决了抗菌肽进入人体后易被进一步水解的问题，作为抗菌药物具有良好的潜质。因此，从人乳内源性多肽出发进一步寻找具有抑菌活性的肽会为临床上对婴幼儿抗感染的治疗提供新的治疗手段。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种内源性抗菌多肽tldggfiyeaglapyklrpv，在制备预防和/或降低由大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起的肠道感染疾病的药物和/或保健品或者新型婴儿配方食品中的应用。
6.为实现上述目的，本发明以所述多肽tldggfiyeaglapyklrpv为抑制微生物生长活性的有效成份。
7.其具有序列表seq id no：1中氨基酸序列；多肽tldggfiyeaglapyklrpv为抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌药物的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。
8.具有对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑制活性的多肽化合物tldggfiyeaglapyklrpv的氨基酸序列为thr-leu-asp-gly-gly-phe-ile-tyr-glu-ala-gly-leu-ala-pro-tyr-lys-leu-arg-pro-val。分子量2180.49da，白色粉末状，易溶于水，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有很强的抑制作用。
9.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
10.本发明从人乳中获得并确定了上述多肽的结构，首次验证了上述多肽具有较好的
96)，肽段等电点为5.73，分子质量为2180.49da，具有20个氨基酸，较短的序列及较低的相对分子质量，结合质谱鉴定结果表明该序列可以稳定存在不易继续被蛋白酶酶解。通过在线工具获取seq id no：1所示氨基酸序列的生物学信息表示，该肽段的不稳定系数为46.18，脂肪族氨基酸指数和亲水性分别为102.50和0.170，表现为疏水性。
23.seq id no.1的信息
24.(a)序列特征
25.*长度：20氨基酸
26.*类型：氨基酸
27.*链型：单链
28.(b)分子类型：蛋白
29.序列描述：
30.seq id no.1
31.tldggfiyeaglapyklrpv
32.实施例2多肽的抗菌活性
33.委托上海杰肽生物科技有限公司通过固相法合成多肽tldggfiyeaglapyklrpv，纯度为98.20％。以革兰氏阴性菌大肠杆菌、革兰氏阳性菌金色葡萄球菌为靶标菌种，考察多肽tldggfiyeaglapyklrpv的抗菌活性。
34.(1)菌株及复苏
35.大肠杆菌(escherichia coli k12)和金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)均以甘油保藏法保存于-80℃，实验前将两种菌分别接种到液体lb培养基和tsb培养基中，于37℃条件下培养12h使菌种复苏，重复上述复苏操作2-3次，使菌株恢复活力。
36.(2)培养基
37.抗菌实验使用直径为90mm的圆形培养皿。双层培养基，下层以15ml2％(m/v，g/ml)的琼脂水溶液做支撑，上层分别加入5ml含0.7％(m/v，g/ml)琼脂、菌浓度为1
×
10
^5
cfu/ml的lb培养基和tsb培养基，将制备好的两种培养基密封后于4℃保存。
38.(3)抗菌实验
39.在平板上层制作出直径2μm的孔，各孔间距约3.5cm。合成的标肽分装成5mg/支，每支加入50μl无菌水，完全溶解后向孔中加入标肽水溶液35μl，每孔实际加入标肽量3.5mg。以水作空白对照，加样体积与标肽样品同为35μl，样品设置两个平行孔。加样后的平板于4℃冰箱中静置3h，待孔中样液完全吸收扩散后取出，在37℃恒温培养箱中倒置培养12h，观察是否有抑菌圈出现，测量抑菌圈大小并记录。
40.(4)实验结果
41.对大肠杆菌和金黄葡萄球菌的抑菌结果见表1和图1，表中列出了目标肽段和空白对照的抑菌圈直径，两个平行孔抑菌结果分别记作“1”和“2”。结果表明多肽tldggfiyeaglapyklrpv对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有生长抑制活性，对金黄色葡萄球菌的生长抑制效果要优于大肠杆菌。
42.表1多肽tldggfiyeaglapyklrpv的抑菌结果
[0043][0044]
“‑”
表示没有抑菌活性。


技术特征：
1.人乳内源性的抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽为多肽tldggfiyeaglapyklrpv，具有序列表seq id no：1中氨基酸序列；该多肽的氨基酸序列具体为，thr-leu-asp-gly-gly-phe-ile-tyr-glu-ala-gly-leu-ala-pro-tyr-lys-leu-arg-pro-val。2.一种权利要求1所述抗菌肽在制备微生物生长抑制剂或抗感染药物中的应用。3.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述微生物生长抑制剂或抗感染药物是以多肽tldggfiyeaglapyklrpv为活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。4.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抗菌肽在制备预防和/或降低由大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌引起的肠道感染疾病的药物和/或保健品或者婴儿配方食品中的应用。5.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述微生物为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的一种或二种以上。6.按照权利要求2所述的应用，其特征在于：所述感染为由大肠杆菌和/或金黄色葡萄球菌引起的肠道感染。

技术总结
本发明涉及一种来自人乳内源性的具有微生物抑制活性的多肽化合物TLDGGFIYEAGLAPYKLRPV，其氨基酸序列为Thr-Leu-Asp-Gly-Gly-Phe-Ile-Tyr-Glu-Ala-Gly-Leu-Ala-Pro-Tyr-Lys-Leu-Arg-Pro-Val。多肽TLDGGFIYEAGLAPYKLRPV具有对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广泛抑制活性，作为预防和/或降低新生儿由微生物引起的肠道感染疾病的药物和/或保健品或者新型婴儿配方食品的添加剂具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。具有良好的应用前景。


技术研发人员：靳艳 于文皓
受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所
技术研发日：2021.01.14
技术公布日：2022/7/18