一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法

1.本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法。


背景技术：

2.巴戟天（morinda officinalis how）为茜草科巴戟天属多年生藤本植物，以根入药，具有补肾阳、抗骨质疏松、抗抑郁、抗炎镇痛和祛风除湿的作用。临床上，常用巴戟天配伍其他药物治疗肾虚、骨质疏松症和风湿痹痛，例如金刚丸、巴戟丸、二仙汤、仙藤汤和三藤汤等。
3.发根农杆菌（agrobacterium rhizogenes）是根瘤菌科农杆属的一种革兰氏阴性土壤细菌，能够侵染大多数双子叶植物、少数单子叶植物以及个别裸子植物。发根农杆菌中起关键作用的是其携带的ri质粒，含有负责发根自主性生长和冠瘿碱合成的基因。ri质粒在结构上与ti质粒类似，主要有致毒区（vir），t-dna区以及冠瘿碱合成功能区等。根据合成冠瘿碱的不同，ri质粒分为4种类型：1）甘露碱型；2）黄瓜碱型；3）农杆碱型；4）米奇矛型。发根农杆菌菌株atcc15834来源于american type culture collection (atcc)，为发根农杆菌原始菌株。atcc15834菌株含pri15834农杆碱型ri质粒，ri质粒上含有诱导发根的rolc基因，侵染植物后导致大量毛根形成。发根农杆菌atcc15834具有广泛的宿主范围（禾本科，豆科，烟草等），在植物遗传转化中有着广阔的应用前景，特别适合对紫杉醇，青蒿等药用植物毛状根的诱导。
4.pbi121质粒是一个高效的植物双元表达载体，来源于pb221和bin19载体。pbi121载体含有从cole1来源的ori复制元件，从camv中来源的prok1元件，新霉素磷酸转移酶ii基因（neomycin phosphotransferase ii gene, nptii），新霉素抗性基因（neomycin resistant gene, neor）等元件。该载体携带卡那霉素抗性基因kan筛选标记，在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作为筛选的标记基因，即只有含卡那霉素抗性基因的转化转植株才能在卡那霉素培养基上生长。
5.毛状根又称发状根，是发根农杆菌侵染植物后诱导细胞产生的一种病理状态，具有多分枝和失去向地性等特点，同时还具有激素自主性、生长周期短、稳定遗传和次生代谢物质积累能力强等优点。因此，毛状根遗传转化体系是研究基因功能以及利用合成生物学构建高效定向生物合成药效单体的重要技术手段，尤其适用于以根入药的中药材。毛状根遗传转化技术在人参、丹参、三七等药用植物中的研究已经非常成熟，被广泛应用于功能基因组学和天然药物成分的开发利用的研究中。然而，目前仅有郑传进等报道以幼芽为外植体对南药巴戟天毛状根诱导的条件进行了研究，关于巴戟天的毛状根遗传转化体系的研究目前尚未见报道，严重制约了巴戟天功能基因组学的研究及其应用。


技术实现要素：

6.本发明针对现有技术的不足，提供一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，
优化出具有较高转化效率的发根农杆菌、外植体及处理方法等，为后续的基因功能研究及利用基因工程手段提高巴戟天药效活性成分的含量提供较好的技术支撑。
7.为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，包括如下步骤：（1）外植体的预培养以巴戟天无菌组培苗的幼嫩茎段作为外植体，置于含有80～120 μm乙酰丁香酮的ms固体培养基中，22～28℃暗培养2～3 d；（2）侵染液配制：将含有目的基因的植物表达载体转化至发根农杆菌atcc15834，并且制备成侵染液；（3）发根农杆菌的侵染将预培养后的茎段转移到步骤（2）得到的侵染液中，25～30℃、50～100 r/min震荡10～30 min，使预培养的外植体与发根农杆菌之间充分接触；（4）共培养侵染结束后，用无菌滤纸将外植体表面的菌液吸干，然后转接到含有80～120 μm 乙酰丁香酮的ms 固体培养基中，22～28 ℃暗培养条件下共培养2～3 d；（5）洗菌将在共培养过程中形成菌斑的外植体用含有250～350 mg/l头孢噻肟钠和150～250 mg/l特美汀的无菌水清洗2～3 次，然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分；（6）毛状根的诱导将清洗完的外植体转接到含有250～350 mg/l 头孢噻肟钠、150～250 mg/l 特美汀和80～120 μm 乙酰丁香酮的1/2 ms 固体培养基上，置于28℃的恒温培养箱中；每隔一周继代培养一次，逐渐降低除菌抗生素的浓度，直至外植体周围的菌斑完全消失；（7）阳性毛状根的筛选当诱导出来的毛状根长到 2～3 cm左右时，将毛状根剪下并转移到含有筛选抗生素的1/2 ms 固体培养基上，25～30 ℃暗培养，筛选出具有卡那霉素抗性且生长速度快、分支较多的毛状根发根系。
8.优选的，步骤（1）所述外植体来自巴戟天的无菌组培苗，幼嫩茎段为组培苗植株上部2～3片叶以上的茎段，沿幼嫩茎段斜下30度角轻轻划伤茎段表层，不要划断茎段。
9.优选的，步骤（2）所述的侵染液配制方法如下：a. 通过冻融法将含目的基因的植物表达载体转化至发根农杆菌atcc15834；b. 在无菌操作台中，用接种环挑取上述转化后的发根农杆菌atcc15834，划线到含40～60 mg/l 卡那霉素的yep 固体培养基，于25～30 ℃倒置培养48～72 h；c. 挑取单个菌落，接种到1.5 ml含40～60 mg/l 卡那霉素的yeb液体培养基中，200～250 r/min、25～30℃过夜培养16～18 h；d. 按照0.5%-1%的接种量，接入到 50 ml含40～60 mg/l 卡那霉素的 yeb 的液体培养基中，25～30 ℃，200～250 r/min振荡培养；e. 当菌液浓度达到od
600
约为 0.6～0.8时，离心后倒掉上清液收集菌体；f. 加入等体积新鲜的ms液体培养基重悬农杆菌，离心后倒掉上清液收集菌体；
dl2000。
具体实施方式
20.下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。
21.实施例1. 巴戟天无菌组培苗的获得挑选生长健壮的巴戟天植株枝条，去掉叶片，先用70％的酒精消毒20～30 s，接着置于3%的次氯酸钠溶液中浸泡20～30 min，最后用无菌水冲洗5～6次；根据腋芽位置切成1 cm左右的茎段，扦插到含0.5 mg/l 6-ba的ms固体培养基中，置于光照培养箱中培养（28℃，16 h光照/8 h黑暗），当腋芽长至4～5 cm时，即可用于切取外植体侵染（图1）。
22.实施例2. 最适外植体和发根菌株的筛选（1）外植体的选择以巴戟天无菌组培苗的叶片和幼嫩茎段作为外植体，幼嫩茎段为组培苗植株上部2～3片叶以上部位的茎段。
23.（2）发根农杆菌选择msu440（链霉素抗性）、ar.qual（链霉素和氯霉素抗性）、c58c1（链霉素和利福平抗性）、k599（链霉素抗性）和atcc15834作为侵染菌株。
24.（3）侵染液配制：a. 在无菌操作台中，用接种环挑取上述的发根农杆菌，划线到含相应抗生素的yep 固体培养基，28 ℃倒置培养48～72 h；b. 挑取单个菌落，接种到1.5 ml yeb液体培养基中（含相应抗生素），220 r/min、28℃培养16～18 h；c. 按照0.5%～1%的接种量，接入到 50 ml 的 yeb 的液体培养基中（含相应抗生素），28℃，220 r/min；d. 当菌液浓度达到od600约为 0.6～0.8时，5000 rpm，离心5 min，倒掉上清液;e. 加入等体积新鲜的ms液体培养基，重悬农杆菌，5000 rpm离心5min，收集菌体；f. 加入等体积新鲜的ms液体培养基重悬农杆菌，并加入100 μm 乙酰丁香酮，常温放置1～2 h（用于诱导农杆菌vir区基因的活化，提高侵染力），即为侵染液。
25.（4）毛状根诱导a. 外植体的预培养以巴戟天无菌组培苗的叶片和幼嫩茎段作为外植体，用手术刀沿幼嫩茎段斜下30度角轻轻划伤茎段表层，沿垂直叶脉的方向轻轻划伤叶片（图2），划伤后置于含100 μm 乙酰丁香酮的ms固体培养基中，25℃暗培养2 d；b. 发根农杆菌的侵染将预培养后的外植体转移到制备好的发根农杆菌侵染液中，置于摇床，90 r/min，28 ℃震荡10～30 min，使预培养的外植体与发根农杆菌之间能够充分的接触；每个处理组分别侵染30个外植体。
26.c.共培养侵染结束后，用无菌滤纸将外植体表面的菌液吸干，然后再转接到含有100 μm 乙酰丁香酮的ms 固体培养基中，25 ℃暗培养条件下进行共培养2～3 d。
r/min、28℃培养16～18 h；d. 按照0.5%～1%的接种量，接入到 50 ml 的 yeb 的液体培养基中（含50 mg/l 卡那霉素），28℃，220r/min；e. 当菌液浓度达到od
600
约为 0.6～0.8时，5000 rpm，离心5 min，倒掉上清液;f. 加入等体积新鲜的ms液体培养基，重悬农杆菌，5000 rpm离心5 min收集菌体；g. 用等体积新鲜的ms液体培养基重悬菌后，加入100 μm 乙酰丁香酮，室温放置1～2 h，即为侵染液；（3）发根农杆菌的侵染a. 将预培养后的茎段转移到制备好的侵染液中，置于摇床，90 r/min，28 ℃震荡10～30 min，使预培养的茎段与发根农杆菌之间能够充分的接触；（4）共培养侵染结束后，用无菌滤纸将茎段表面的菌液吸干，然后再转接到含有100 μm 乙酰丁香酮的ms 固体培养基中，25 ℃暗培养2～3 d。共培养基中加乙酰丁香酮可持续诱导发根农杆菌vir区基因的活化，促进外源基因的整合，提高转化效率。
32.（5）洗菌将在共培养过程中形成菌斑的外植体用无菌水（含300 mg/l 头孢噻肟钠和200 mg/l 特美汀）清洗2～3次，然后再用无菌滤纸吸干茎段表面的水分。
33.（6）毛状根的诱导将外植体转接到1/2 ms 固体培养基（含300 mg/l 头孢噻肟钠、200 mg/l 特美汀和100 μm 乙酰丁香酮），28℃，长日照（14 h光照/10 h黑暗）条件下培养，每隔一周继代培养一次，并逐渐的降低除菌抗生素的浓度直至茎段周围的菌斑完全消失，以防农杆菌的繁殖导致外植体死亡（图4）。采用发根农杆菌atcc15834侵染巴戟天茎段，侵染后培养10 d，茎段的伤口处有发根系长出，呈现多绒毛和负向地性等典型特点（图5 a）；培养至20 d，诱导的毛状根发根系在培养基表明迅速伸长、变粗，具有典型的负向地性（图5 b）。
34.（7）阳性毛状根的筛选当诱导出来的毛状根长到 2～3 cm左右时，将毛状根剪下，并转移到含有筛选抗生素（30 mg/l 卡那霉素）的 1/2 ms 固体培养基上，28℃暗培养，培养过程中筛选得到具有卡那霉素抗性的生长速度较快、分支较多的转基因毛状根发根系。如图6所示，筛选得到的发根系，呈现多分枝、生长迅速、负向地性（根系匍匐在培养基表面）等典型特点。
35.（8）阳性毛状根的检测和转化效率随机挑取8个本实施例步骤（7）筛选得到具有卡那霉素抗性、且生长速度较快、分支较多的转基因毛状根发根系作为检测对象，以组培苗的根作为阴性对照，以ddh2o作为空白对照。根据发根农杆菌atcc15834中pri15834质粒上的rolc基因鉴别毛状根，通过35s启动子和目的基因bhlh25之间设计引物，检测目的基因bhlh25，检测引物如表2所示。pcr反应体系为：2
×
taq master mix 25 μl，上下游引物各2 μl，模板dna 1 μl，ddh2o 20 μl。反应程序为：95℃ 3 min；95℃ 30 s, 60℃ 30 s，72℃ 60 s，33个循环；72℃ 10 min。
36.pcr检测结果表明：8个诱导发根系中有5个能够检测到rolc基因，效率为62.5%；而组培苗的根和ddh2o均未检测到条带，发根系中能够检测到rolc基因说明该发根系为发根农杆菌atcc15834诱导产生的毛状根（图7 a）。目的基因检测结果发现其中4个毛状根株系
中能够检测到目的基因bhlh25，表明外源目的基因bhlh25成功通过发根农杆菌atcc15834介导整合到巴戟天毛状根中，转化效率约为50%（图7 b）。
37.表2. 阳性毛状根 pcr 检测引物实施例4一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，包括如下步骤：（1）外植体的预培养以巴戟天无菌组培苗的幼嫩茎段作为外植体，置于含有100 μm乙酰丁香酮的ms固体培养基中，25℃暗培养2 d；（2）侵染液配制：将含有目的基因的植物表达载体pbi121-bhlh25转化至发根农杆菌atcc15834，并且制备成侵染液；（3）发根农杆菌的侵染将预培养后的茎段转移到步骤（2）得到的侵染液中，28℃、90 r/min震荡10～30 min，使预培养的外植体与发根农杆菌之间充分接触；（4）共培养侵染结束后，用无菌滤纸将外植体表面的菌液吸干，然后转接到含有100 μm 乙酰丁香酮的ms 固体培养基中，25 ℃暗培养条件下共培养2～3 d；（5）洗菌将在共培养过程中形成菌斑的外植体用含有300 mg/l头孢噻肟钠和200 mg/l特美汀的无菌水清洗2～3 次，然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分；（6）毛状根的诱导将清洗完的外植体转接到含有300 mg/l 头孢噻肟钠、200 mg/l 特美汀和100 μm 乙酰丁香酮的1/2 ms 固体培养基上，置于28℃的恒温培养箱中；每隔一周继代培养一次，逐渐降低除菌抗生素的浓度，直至外植体周围的菌斑完全消失；所述继代培养的条件如下：培养温度为28℃，光照条件为每天14 h光照、10 h黑暗。
38.（7）阳性毛状根的筛选当诱导出来的毛状根长到 2～3 cm左右时，将毛状根剪下并转移到含有筛选抗生素30 mg/l卡那霉素的1/2 ms 固体培养基上，28 ℃暗培养，筛选出具有卡那霉素抗性且生长速度快、分支较多的毛状根发根系。
39.步骤（1）所述外植体来自巴戟天的无菌组培苗，幼嫩茎段为组培苗植株上部2～3片叶以上的茎段，沿幼嫩茎段斜下30度角轻轻划伤茎段表层，不要划断茎段。
40.步骤（2）所述的侵染液配制方法如下：
a. 通过冻融法将含目的基因的植物表达载体pbi121-bhlh25转化至发根农杆菌atcc15834；b. 在无菌操作台中，用接种环挑取上述转化后的发根农杆菌atcc15834，划线到含50 mg/l 卡那霉素的yep 固体培养基，于28 ℃倒置培养48～72 h；c. 挑取单个菌落，接种到1.5 ml含50 mg/l 卡那霉素的yeb液体培养基中，220 r/min、28℃过夜培养16～18 h；d. 按照0.5%～1%的接种量，接入到 50 ml含50 mg/l 卡那霉素的 yeb 的液体培养基中，28℃，220 r/min振荡培养；e. 当菌液浓度达到od
600
约为 0.6～0.8时，5000 rpm离心5 min，倒掉上清液收集菌体；f. 加入等体积新鲜的ms液体培养基重悬农杆菌，5000 rpm离心5min，倒掉上清液收集菌体；g. 加入等体积新鲜的ms液体培养基重悬农杆菌，并加入100 μm 乙酰丁香酮，常温放置1～2 h，即为侵染液。
41.实施例5一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，包括如下步骤：（1）外植体的预培养以巴戟天无菌组培苗的幼嫩茎段作为外植体，置于含有120 μm乙酰丁香酮的ms固体培养基中，28℃暗培养3 d；（2）侵染液配制：将含有目的基因的植物表达载体pbi121-bhlh25转化至发根农杆菌atcc15834，并且制备成侵染液；（3）发根农杆菌的侵染将预培养后的茎段转移到步骤（2）得到的侵染液中，30℃、100 r/min震荡30 min，使预培养的外植体与发根农杆菌之间充分接触；（4）共培养侵染结束后，用无菌滤纸将外植体表面的菌液吸干，然后转接到含有120 μm 乙酰丁香酮的ms 固体培养基中，28 ℃暗培养条件下共培养3 d；（5）洗菌将在共培养过程中形成菌斑的外植体用含有350 mg/l头孢噻肟钠和250 mg/l特美汀的无菌水清洗3 次，然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分；（6）毛状根的诱导将清洗完的外植体转接到含有350 mg/l 头孢噻肟钠、250 mg/l 特美汀 和120 μm 乙酰丁香酮的1/2 ms 固体培养基上，置于28℃的恒温培养箱中；每隔一周继代培养一次，逐渐降低除菌抗生素的浓度，直至外植体周围的菌斑完全消失；（7）阳性毛状根的筛选当诱导出来的毛状根长到 3 cm左右时，将毛状根剪下并转移到含有筛选抗生素32 mg/l卡那霉素1/2 ms 固体培养基上，30 ℃暗培养，筛选出具有卡那霉素抗性且生长速度快、分支较多的毛状根发根系。
42.步骤（1）所述外植体来自巴戟天的无菌组培苗，幼嫩茎段为组培苗植株上部3片叶以上的茎段，沿幼嫩茎段斜下30度角轻轻划伤茎段表层，不要划断茎段。
43.步骤（2）所述的侵染液配制方法如下：a. 通过冻融法将含目的基因的植物表达载体pbi121-bhlh25转化至发根农杆菌atcc15834；b. 在无菌操作台中，用接种环挑取上述转化后的发根农杆菌atcc15834，划线到含60 mg/l 卡那霉素的yep 固体培养基，于30 ℃倒置培养48～72 h；c. 挑取单个菌落，接种到1.5 ml含60 mg/l 卡那霉素的yeb液体培养基中， 250 r/min、30℃过夜培养18 h；d. 按照0.5%～1%的接种量，接入到 50 ml含60 mg/l卡那霉素的 yeb 的液体培养基中，30 ℃，250 r/min振荡培养；e. 当菌液浓度达到od
600
约为 0.6～0.8时，离心后倒掉上清液收集菌体；f. 加入等体积新鲜的ms液体培养基重悬农杆菌，离心后倒掉上清液收集菌体；g. 加入等体积新鲜的ms液体培养基重悬农杆菌，并加入120 μm 乙酰丁香酮，常温放置2 h，即为侵染液。
44.步骤（6）所述继代培养的条件如下：培养温度为30 ℃，光照条件为每天14 h光照、10 h黑暗。
45.实施例6一种巴戟天毛状根遗传转化体系的建立方法，包括如下步骤：（1）外植体的预培养以巴戟天无菌组培苗的幼嫩茎段作为外植体，置于含有80 μm乙酰丁香酮的ms固体培养基中，30℃暗培养2 d；（2）侵染液配制：将含有目的基因的植物表达载体pbi121-bhlh25转化至发根农杆菌atcc15834，并且制备成侵染液；（3）发根农杆菌的侵染将预培养后的茎段转移到步骤（2）得到的侵染液中，25℃、50 r/min震荡10 min，使预培养的外植体与发根农杆菌之间充分接触；（4）共培养侵染结束后，用无菌滤纸将外植体表面的菌液吸干，然后转接到含有80 μm 乙酰丁香酮的ms 固体培养基中，22 ℃暗培养条件下共培养2 d；（5）洗菌将在共培养过程中形成菌斑的外植体用含有250 mg/l头孢噻肟钠和150 mg/l特美汀的无菌水清洗2次，然后用无菌滤纸吸干外植体表面的水分；（6）毛状根的诱导将清洗完的外植体转接到含有250 mg/l 头孢噻肟钠、150 mg/l 特美汀和80 μm 乙酰丁香酮的1/2 ms 固体培养基上，置于28℃的恒温培养箱中；每隔一周继代培养一次，逐渐降低除菌抗生素的浓度，直至外植体周围的菌斑完全消失；（7）阳性毛状根的筛选
当诱导出来的毛状根长到 2 cm左右时，将毛状根剪下并转移到含有筛选抗生素28 mg/l卡那霉素1/2 ms 固体培养基上，25 ℃暗培养，筛选出具有卡那霉素抗性且生长速度快、分支较多的毛状根发根系。
46.步骤（1）所述外植体来自巴戟天的无菌组培苗，幼嫩茎段为组培苗植株上部2～3片叶以上的茎段，沿幼嫩茎段斜下30度角轻轻划伤茎段表层，不要划断茎段。
47.步骤（2）所述的侵染液配制方法如下：a. 通过冻融法将含目的基因的植物表达载体pbi121-bhlh25转化至发根农杆菌atcc15834；b. 在无菌操作台中，用接种环挑取上述转化后的发根农杆菌atcc15834，划线到含40 mg/l 卡那霉素的yep 固体培养基，于25 ℃倒置培养48～72 h；c. 挑取单个菌落，接种到1.5 ml含40 mg/l 卡那霉素的yeb液体培养基中，200 r/min、25～30℃过夜培养16～18 h；d. 按照0.5%～1%的接种量，接入到 50 ml含40 mg/l卡那霉素的 yeb 的液体培养基中，25 ℃，200 r/min振荡培养；e. 当菌液浓度达到od
600
约为 0.6～0.8时，离心后倒掉上清液收集菌体；f. 加入等体积新鲜的ms液体培养基重悬农杆菌，离心后倒掉上清液收集菌体；g. 加入等体积新鲜的ms液体培养基重悬农杆菌，并加入80 μm 乙酰丁香酮，常温放置1～2 h，即为侵染液。
48.步骤（6）所述继代培养的条件如下：培养温度为25℃，光照条件为每天14 h光照、10 h黑暗。