转化微生物、以及使用了该微生物的聚羟基烷酸酯的制造方法与流程

1.本发明涉及转化微生物、以及使用了该微生物的聚羟基烷酸酯的制造方法。


背景技术：

2.在对环境问题、粮食问题、健康及安全的意识增高、天然或自然意愿增高等的背景下，利用微生物的物质制造(发酵生产、生物转化等)的意义及重要性日益增加，蛋白质医药品、基因治疗用的核酸等的制造也应用了基于微生物的物质生产。例如，利用了酵母、细菌等微生物的乙醇、乙酸、医疗用蛋白质的生产等在工业上得到了积极地应用。
3.作为其一例，可以举出聚羟基烷酸酯(以下也称为pha)的基于微生物的生产，所述聚羟基烷酸酯被期待作为生物降解性塑料而进行工业利用(参照非专利文献1)。pha是在多个微生物种类的细胞中作为能量储存物质而产生、蓄积的热塑性聚酯，具有生物降解性。目前，随着环保意识的提高，来源于非石油的塑料备受关注，特别是微生物在菌体内产生并蓄积的pha会被纳入自然界的碳循环过程，因此预计对生态系统的不良影响小，迫切希望它的实用化。在利用微生物的pha生产中，已知例如对贪铜菌属细菌给予作为碳源的糖、植物油脂、脂肪酸，使pha在细胞内蓄积，从而生产pha(参照非专利文献2及3)。
4.然而，在利用了微生物的物质生产中，存在微生物细胞、目标产物的分离回收工序繁杂、生产成本增高成为问题的情况。因此，提高分离回收效率是降低生产成本的一大课题。
5.已知，在生产pha的微生物中的细胞的大型化中，例如，通过使抑制细胞分裂的蛋白质mincd过表达、或者破坏作为肽聚糖合成酶之一的单功能性肽聚糖糖基转移酶，从而使生产pha的微生物细胞大型化(参照非专利文献4及专利文献1)。然而，关于肽聚糖的水解酶与生产pha的微生物的细胞形态的关联性至今未见报道。
6.现有技术文献
7.非专利文献
8.非专利文献1：anderson aj.,et al.,int.j.biol.macromol.,12,201-105(1990)
9.非专利文献2：sato s.,et al.,j.biosci.bioeng.,120(3),246-251(2015)
10.非专利文献3：insomphun c.,et al.,metab.eng.,27,38-45(2015)
11.非专利文献4：shen r.,et al.,metab.eng.,54,117-126(2019)
12.专利文献1：国际公开第2016/194771号


技术实现要素：

13.发明要解决的课题
14.pha蓄积在微生物细胞内。为了将微生物细胞内蓄积的pha用作生物降解性塑料，首先从培养液中分离回收微生物细胞。在微生物细胞的分离回收时，可以使用离心分离机、分离膜等，分离回收的容易程度、效率取决于微生物细胞的大小。即，微生物细胞越大，越能
够容易效率良好地实施使用了离心分离机、分离膜等的分离回收，使生产成本降低。
15.鉴于上述现状，本发明的目的在于提供蓄积pha、且能够大型化的转化微生物、以及使用了该转化微生物的pha的制造方法。
16.解决课题的方法
17.本发明人等发现，通过降低被推定为贪铜菌属细菌中肽聚糖的水解酶的a0302基因、a0597基因、a1386基因、a2272基因、a2405基因中的任意基因的表达，结果会使a1386基因或a2405基因的表达降低，由此可以在保持工业上希望的pha蓄积量的同时使微生物细胞大型化，从而完成了本发明。进一步发现，通过除了使上述a1386基因或a2405基因的表达降低以外，还增加minc基因及mind基因的表达，由此能够使微生物细胞更加大型化，从而完成了本发明。
18.即，本发明涉及具有聚羟基烷酸酯合成酶基因、且降低了a1386基因和/或a2405基因的表达的转化微生物。优选a1386基因是编码相对于序列号1所述的氨基酸序列具有85％以上序列同源性的氨基酸序列的基因，a2405基因是编码相对于序列号2所述的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因。该转化微生物可以还增强了minc基因及mind基因的表达。优选上述minc基因是编码相对于序列号3所述的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因，上述mind基因是编码相对于序列号4所述的氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列的基因。上述转化微生物优选属于贪铜菌属，更优选为钩虫贪铜菌的转化微生物。此外，本发明也涉及聚羟基烷酸酯的制造方法，该方法包括：在碳源的存在下对上述转化微生物进行培养的工序。上述聚羟基烷酸酯优选为2种以上的羟基烷酸的共聚物，更优选为含有3-羟基己酸作为单体单元的共聚物，进一步优选为3-羟基丁酸与3-羟基己酸的共聚物。
19.发明的效果
20.根据本发明，可以提供蓄积pha且能够大型化的转化微生物、以及使用了该转化微生物的pha的制造方法。根据本发明，由于蓄积pha的微生物细胞大型化，因此，从培养液中分离回收微生物细胞变得容易，能够实现生产成本的降低。
附图说明
21.图1是拍摄培养后的knk-005株(比较例1)得到的显微镜照片(照片中的比例尺表示10μm。图2～11相同。)
22.图2是拍摄培养后的a0597缺失破坏株(比较例2)得到的显微镜照片
23.图3是拍摄培养后的a0302缺失破坏株(比较例3)得到的显微镜照片
24.图4是拍摄培养后的a2272插入破坏株(比较例4)得到的显微镜照片
25.图5是拍摄培养后的a1386缺失破坏株(实施例1)得到的显微镜照片
26.图6是拍摄培养后的a2405插入破坏株(实施例2)得到的显微镜照片
27.图7是拍摄培养后的a2405缺失破坏株(实施例3)得到的显微镜照片
28.图8是拍摄培养后的a1386/a2405双重破坏株(实施例4)得到的显微镜照片
29.图9是拍摄培养后的mincd表达a1386破坏株(实施例5)得到的显微镜照片
30.图10是拍摄培养后的mincd表达a2405破坏株(实施例6)得到的显微镜照片
31.图11是拍摄培养后的mincd表达a2405
·
a1386破坏株(实施例7)得到的显微镜照
片
具体实施方式
32.以下，对本发明的实施方式详细地进行说明。
33.本实施方式的转化微生物是具有pha合成酶基因、且降低了a1386基因和/或a2405基因的表达的转化微生物。该转化生物可以还增强了minc基因及mind基因的表达。
34.(微生物)
35.本实施方式的转化微生物可以是以具有pha合成酶基因且降低了a1386基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有pha合成酶基因且降低了a2405基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有pha合成酶基因、且降低a1386基因的表达而增强minc基因及mind基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有pha合成酶基因、且降低a2405基因的表达而增强minc基因及mind基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有pha合成酶基因、且降低了a1386基因及a2405基因的表达的方式进行了转化的微生物。另外，可以是以具有pha合成酶基因、且降低a1386基因及a2405基因的表达而增强minc基因及mind基因的表达的方式进行了转化的微生物。
36.本实施方式的转化微生物的宿主没有特别限定，优选为具有a1386基因、a2405基因、minc基因或mind基因的细菌。作为该细菌，可以列举属于例如罗尔斯通氏菌(ralstonia)属、贪铜菌(cupriavidus)属、沃特斯氏菌(wautersia)属、伯克氏菌(burkholderia)属等伯克氏菌(burkholderiaceae)科的细菌类作为优选的例子。从安全性及pha生产性的观点考虑，更优选为属于罗尔斯通氏菌属、贪铜菌属的细菌，进一步优选为属于贪铜菌属的细菌，特别优选为钩虫贪铜菌(cupriavidus necator)。
37.本实施方式的转化微生物的宿主可以是原本具有pha合成酶基因的野生株，也可以是将这样的野生株人工进行突变处理而得到的突变株、或者通过基因工程方法导入了外来的pha合成酶基因的菌株。导入外来的pha合成酶基因的方法没有特别限定，可以选择在宿主的染色体上直接插入或置换基因的方法、在宿主所保有的巨大质粒上直接插入或置换基因的方法、或在质粒、噬菌体、噬菌粒等载体上配置基因并导入的方法等，也可以组合使用这些方法中的2种以上。考虑到导入基因的稳定性，优选为在宿主的染色体上或宿主所保有的巨大质粒上直接插入或置换基因的方法，更优选为在宿主的染色体上直接插入或置换基因的方法。
38.(pha合成酶基因)
39.作为pha合成酶基因，没有特别限定，可以列举属于罗尔斯通氏菌属、贪铜菌属、沃特斯氏菌属、产碱杆菌属、气单胞菌属、假单胞菌属、诺卡菌属、色素杆菌属的生物来源的pha合成酶基因、它们的变体等。作为上述变体，可以使用编码1个以上的氨基酸残基发生了缺失、添加、插入或置换的pha合成酶的碱基序列等。可以列举例如：具有编码序列号5～9中任一项所述的氨基酸序列所示的多肽的碱基序列的基因、以及具有编码相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示且具有pha合成酶活性的多肽的碱基序列的基因等。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。
40.(pha)
41.作为本实施方式的转化微生物生产的pha的种类，只要是微生物能够生产的pha即可，没有特别限定，优选为选自碳原子数4～16的3-羟基烷酸的1种单体的均聚物、选自碳原子数4～16的3-羟基烷酸的1种单体与其它羟基烷酸(例如，碳原子数4～16的2-羟基烷酸、4-羟基烷酸、5-羟基烷酸、6-羟基烷酸等)的共聚物、以及选自碳原子数4～16的3-羟基烷酸的2种以上单体的共聚物。可以列举例如：作为3-羟基丁酸(简称：3hb)的均聚物的p(3hb)、3hb与3-羟基戊酸(简称：3hv)的共聚物p(3hb-共-3hv)、3hb与3-羟基己酸(简称：3hh)的共聚物p(3hb-共-3hh)(简称：phbh)、3hb与4-羟基丁酸(简称：4hb)的共聚物p(3hb-共-4hb)、包含乳酸(简称：la)作为构成成分的pha、例如3hb与la的共聚物p(la-共-3hb)等，但并不限定于此。其中，从作为聚合物的应用范围广的观点考虑，优选为phbh。需要说明的是，根据目的，生产的pha的种类可以通过待使用的微生物所保有或另行导入的pha合成酶基因的种类、与其合成相关的代谢体系的基因的种类、培养条件等而适当选择。
42.(肽聚糖)
43.肽聚糖是主要构成细菌的细胞壁的包含肽和糖的高分子化合物的一种。肽聚糖的结构因菌种而不同，作为代表性的例子，在大肠杆菌中，由以n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)和n-乙酰胞壁酸(murnac)这2种氨基糖的交替重复作为单元的糖链和l-丙氨酸(l-ala)-γ-d-谷氨酸(glu)-间二氨基庚二酸(m-dap)-d-丙氨酸(d-ala)-d-ala的五肽构成。五肽的l-ala通过肽键键合于糖链的murnac。从五肽中去除d-ala，成为四肽后，四肽的m-dap与其它糖链的四肽的d-ala键合，2个糖链发生交联，由此形成牢固的结构。
44.(肽聚糖水解酶)
45.多数细菌具有n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶、d-丙氨酰-d-丙氨酸-内肽酶、d-丙氨酰-d-丙氨酸-羧肽酶等多种肽聚糖水解酶。n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶切断肽聚糖的murnac与l-ala的n末端的键。d-丙氨酰-d-丙氨酸-内肽酶切断四肽彼此的交联部分中存在的m-dap与d-ala的键等。d-丙氨酰-d-丙氨酸-羧肽酶切断五肽的d-ala与d-ala的键，去除末端的d-ala。
46.在uniprotkb数据库中，编码钩虫贪铜菌的a0597基因(uniprotkb id q0kew8)的蛋白质推定为n-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶。
47.在uniprotkb数据库中，编码钩虫贪铜菌的a0302基因(uniprotkb id q0ke26)及a1386基因(uniprotkb id q0kbu9)的蛋白质推定为d-丙氨酰-d-丙氨酸-羧肽酶。
48.在uniprotkb数据库中，钩虫贪铜菌的a2272基因及a2405基因被推定编码与细胞壁相关的水解酶，但没有报告详细的功能。
49.上述a1386基因是具有编码以下多肽的碱基序列的基因，所述多肽为序列号1所述的氨基酸序列所示的多肽、或者相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示的多肽。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。需要说明的是，序列号1所述的氨基酸序列与a0302基因所编码的蛋白质的氨基酸序列的序列同源性为约30％。
50.上述a2405基因是具有编码以下多肽的碱基序列的基因，所述多肽为序列号2所述的氨基酸序列所示的多肽、或者相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示的多肽。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。需要说明的是，序列号2所述的氨基酸序列与a2272基因
所编码的蛋白质的氨基酸序列的序列同源性为约40％。
51.(minc基因、mind基因)
52.minc基因、mind基因及mine基因所编码的蛋白质minc、mind及mine是在细菌中具有协调并控制细胞分裂的功能的蛋白质(mincde系统)。例如，已知在大肠杆菌细胞内中，mind以atp依赖性的方式形成聚合物，进一步与minc形成复合体，从细胞的一极至另一极快速振动。minc具有已知细胞分裂时的隔膜形成的作用。另外，已知mine和minc竞争性地与mind结合，具有调节为仅在细胞中央发生隔膜形成的作用。
53.本发明中的minc基因是具有编码以下多肽的碱基序列的基因，所述多肽为序列号3所述的氨基酸序列所示的多肽(uniprotkb id q0kfi3)、或者相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示的多肽。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。
54.本发明中的mind基因是具有编码以下多肽的碱基序列的基因，所述多肽为序列号4所述的氨基酸序列所示的多肽(uniprotkb id q0kfi4)、或者相对于该氨基酸序列具有85％以上的序列同源性的氨基酸序列所示的多肽。作为上述序列同源性，优选为90％以上、更优选为95％以上、进一步优选为97％以上、特别优选为99％以上。
55.(基因表达的降低)
56.本发明中的“基因表达的降低”是指，与未使对象基因的表达降低的菌株相比，对象基因的转录量或对象基因所编码的多肽的表达量减少的状态。该减少量没有特别限定，相对于未使对象基因的表达降低的菌株的表达量，只要少于1倍即可，优选为0.8倍以下、更优选为0.5倍以下、进一步优选为0.3倍以下、更进一步优选为0.2倍以下。对象基因的转录量或对象基因所编码的多肽的表达量可以为零。另外，通过修饰对象基因的碱基序列等而使该基因所编码的多肽不显示原本的功能的情况也可以视为该基因表达降低。另外，通过对具有pha合成酶基因的微生物进行基因修饰，以使其生产抑制该多肽的功能的代谢产物、蛋白质，由此也可以使对象基因的表达降低。
57.在本实施方式中，使基因的表达降低的方法没有特别限定，可以列举：使对象基因的一部分或全长缺失的方法、对与对象基因的表达相关的“基因表达调节序列”进行修饰的方法、通过对对象基因和/或其周边的碱基序列进行修饰而使转录的信使rna的稳定性降低的方法等。修饰碱基序列的方法没有特别限定，可以通过对象基因和/或其周边的碱基序列的至少一部分的置换、缺失、插入和/或添加等而实施，可以通过本领域技术人员公知的方法进行。此外，通过对具有pha合成酶基因的转化微生物使用反义rna、rna干扰法(rnai)、crispr干扰法(crispri)等，也可以在不修饰对象基因和/或其周边的碱基序列的情况下使对象基因的表达降低。
58.(基因表达增强)
59.本发明中的基因表达的增强是指，与未增强对象基因的表达的菌株相比，对象基因的转录量或对象基因所编码的多肽的表达量增加的状态。该增加量没有特别限定，与未增强对象基因的表达的菌株相比，只要超过1倍即可，优选为1.1倍以上、更优选为1.2倍以上、进一步优选为1.5倍以上、更进一步优选为2倍以上的增加。
60.在本实施方式中，增强minc基因及mind基因的表达的方法没有特别限定，可以选择将对象基因导入宿主的方法、增强宿主在基因组dna上原本具有的对象基因的表达量的
方法、或者这两者。
61.作为将对象基因导入宿主的方法，没有特别限定，可以选择在宿主的染色体上直接插入或置换对象基因的方法、在宿主所保有的巨大质粒上直接插入或置换对象基因的方法、或者在质粒、噬菌体、噬菌粒等载体上配置对象基因并导入的方法等，也可以组合使用这些方法中的2种以上。
62.考虑到导入基因的稳定性，优选为在宿主的染色体上或宿主所保有的巨大质粒上直接插入或置换对象基因的方法，更优选为在宿主的染色体上直接插入或置换对象基因的方法。为了使导入的基因可靠地表达，优选以对象基因位于宿主原本具有的“基因表达调节序列”的下游的方式导入、或者以对象基因位于外来的“基因表达调节序列”的下游的形式导入。本发明中的“基因表达调节序列”是指包含控制该基因的转录量的碱基序列(例如启动子序列)、和/或调节由该基因转录的信使rna的翻译量的碱基序列(例如shine-dalgarno序列)的dna序列。作为“基因表达调节序列”，可以利用自然界存在的任意的碱基序列，也可以利用人工构建或修饰的碱基序列。
63.另外，作为增强宿主在基因组dna上原本具有的对象基因的表达量的方法，没有特别限定，可以列举：修饰位于对象基因的上游的“基因表达调节序列”的方法、在对象基因的上游导入外来的“基因表达调节序列”的方法、或者通过修饰对象基因和/或其周边的碱基序列而使转录的信使rna的稳定性提高的方法等。
64.作为“基因表达调节序列”中包含的启动子序列、shine-dalgarno序列，可以列举例如：序列号10～16中任一项所示的碱基序列、或包含这些碱基序列的一部分的碱基序列等，没有特别限定。
65.基因组dna的至少一部分的置换、缺失、插入和/或添加可以通过本领域技术人员公知的方法进行。作为代表性的方法，有利用与转位子同源重组的机制的方法(ohman et al.,j.bacteriol.,162:1068-1074(1985))、以由同源重组的机制引起的位点特异性的引入和由第二阶段的同源重组所致的脱落作为原理的方法(noti et al.,methods enzymol.,154:197-217(1987))等。另外，也可以利用使来自于枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)的sacb基因共存，并通过第二阶段的同源重组将基因脱落的微生物株作为蔗糖抗性菌株而容易地分离的方法(schweizer,mol.microbiol.,6:1195-1204(1992)、lenz et al.,j.bacteriol.,176:4385-4393(1994))。此外，作为其它方法，也可以利用用于修饰靶dna的基于crispr/cas9系统的基因组编辑技术(y.wang et al.,acs synth biol.2016,5(7):721-732)。在crispr/cas9系统中，向导rna(grna)具有能够与待修饰的基因组dna的碱基序列的一部分结合的序列，具有将cas9运送至靶点的作用。
66.作为向细胞导入载体的方法，没有特别限定，可以列举例如：氯化钙法、电穿孔法、聚乙二醇法、原生质球法等。
67.通过培养本实施方式的转化微生物，可以使pha蓄积在菌体内。作为培养本实施方式的转化微生物的方法，可以依照通常的微生物培养法，只要在存在适当碳源的培养基中进行培养即可。培养基组成、碳源的添加方法、培养规模、通气搅拌条件、培养温度、培养时间等没有特别限定。碳源优选连续或间歇地添加于培养基。
68.作为培养时的碳源，只要本实施方式的转化微生物能够同化即可，可以使用任意碳源。可以列举：葡萄糖、果糖、蔗糖等糖类；棕榈油、棕榈仁油(也包括作为将它们分离而得
到的低熔点级分的棕榈油精、棕榈双油精、棕榈仁油精等)、玉米油、椰子油、橄榄油、大豆油、菜籽油、麻疯树油(jatropha oil)等油脂、其分离油类、或其纯化副产物；月桂酸、油酸、硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等脂肪酸、其衍生物、或甘油等，没有特别限定。另外，在本实施方式的转化微生物能够利用二氧化碳、一氧化碳、甲烷、甲醇、乙醇等气体、醇类的情况下，也可以使用它们作为碳源。
69.在本实施方式的pha的制造中，优选使用包含作为上述碳源、碳源以外的营养源的氮源、无机盐类、其它有机营养源的培养基对上述微生物进行培养。作为氮源，可以列举例如：氨；氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐；蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等，但并不限定于此。作为无机盐类，可以列举例如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。作为其它有机营养源，可以列举例如：甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸、维生素b1、维生素b12、维生素c等维生素等。
70.在进行适当时间的培养而使pha蓄积在菌体内后，使用公知的方法从菌体中回收pha。对于回收方法，没有特别限定，例如，可以在培养结束后，用离心分离机、分离膜等将菌体从培养液中分离，使其干燥后，使用氯仿等有机溶剂从干燥菌体中提取pha，通过过滤等从包含该pha的有机溶剂溶液中除去细胞成分，向其滤液中加入甲醇、己烷等不良溶剂而使pha沉淀，通过过滤、离心分离将上清液除去，使其干燥，回收pha。另外，也可以使用表面活性剂、碱、酶等使pha以外的细胞成分溶解于水后，通过过滤、离心分离将pha粒子与水相分离，使其干燥并回收。
71.根据本实施方式，可以得到蓄积有pha的大粒径的微生物细胞，因此能够容易效率良好地实施从培养液中分离微生物细胞。
72.实施例
73.以下，通过实施例对本发明更具体地进行说明。但是，本发明并不受这些实施例的限定。需要说明的是，全部基因操作例如可以如molecular cloning(cold spring harbor laboratory press(1989))中记载的那样进行。另外，基因操作所使用的酶、克隆宿主等可以从市场的供应商购入，按照其说明使用。需要说明的是，作为酶，只要能够用于基因操作即可，没有特别限定。
74.(制造例1)a0597缺失破坏株的制备
75.首先，进行了基因缺失用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚dna的pcr，得到了具有a0597结构基因的上游及下游的碱基序列的dna片段(序列号17)。用限制性内切酶swai消化该dna片段，将得到的dna片段与同样经swai消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pns2x-sacb和dna连接酶(ligation high(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有a0597结构基因的上游及下游的碱基序列的基因缺失用质粒载体pns2x-sacb a0597ud。
76.接下来，使用基因缺失破坏用质粒载体pns2x-sacb a0597ud，如下所述进行了a0597缺失破坏株的制备。
77.用基因插入破坏用质粒载体pns2x-sacb a0597ud对大肠杆菌s17-1株(atcc47055)进行转化，将由此得到的转化微生物和knk-005株在nutrient agar培养基(difco公司制)上进行混合培养，进行了接合转移(conjugation transfer)。knk-005株是在钩虫贪铜菌h16株的染色体上导入了豚鼠气单胞菌来源的pha合成酶基因(编码具有序列
a2272-indel导入knk-005株。进一步，通过基于pcr及dna测序仪的分析，分离出了通过在染色体上的a2272结构基因序列内插入质粒而将a2272基因破坏的1个菌株。将该a2272基因破坏株命名为a2272插入破坏株。
88.(制造例5)a2405插入破坏株的制备
89.首先，进行了a2405基因插入破坏用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚dna的pcr，得到了具有a2405结构基因的第7～204位碱基序列的dna片段(序列号21)。用限制性内切酶swai消化得到的dna片段。将该dna片段与同样经swai消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pns2x-sacb和dna连接酶(ligation high(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有a2405结构基因的第7～204位碱基序列的a2405基因插入破坏用质粒载体pns2x-sacb-a2405-indel。
90.接下来，通过与制造例1相同的方法将基因插入破坏用质粒载体pns2x-sacb-a2405-indel导入knk-005株。进一步，通过基于pcr及dna测序仪的分析，分离出了通过在染色体上的a2405结构基因序列内插入质粒而将a2405基因破坏的1个菌株。将该a2405基因破坏株命名为a2405插入破坏株。
91.(制造例6)a2405缺失破坏株的制备
92.首先，进行了基因缺失用质粒的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚dna的pcr，得到了具有a2405结构基因的上游及下游的碱基序列的dna片段(序列号22)。用限制性内切酶swai消化该dna片段，将得到的dna片段与同样经swai消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pns2x-sacb和dna连接酶(ligation high(东洋纺株式会社制))连接，制备了具有a2405结构基因的上游及下游的碱基序列的基因缺失用质粒载体pns2x-sacb a2405ud。
93.接下来，通过与制造例1相同的方法将a2405基因缺失用质粒载体pns2x-sacb a2405ud导入knk-005株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了将染色体上的a2405结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该a2405基因缺失株命名为a2405缺失破坏株。
94.(制造例8)a1386/a2405双重破坏株的制备
95.通过与制造例1相同的方法将a2405基因缺失用质粒载体pns2x-sacb a2405ud导入a1386缺失破坏株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了将染色体上的a2405结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该缺失了a1386基因及a2405基因的菌株命名为a1386/a2405双重破坏株。
96.(制造例9)mincd表达a1386缺失破坏株的制备
97.进行了mincd基因表达用质粒载体pns2x-sacb-pa-mincd的制备。如下所述进行了制备。通过使用了合成寡聚dna的pcr，得到了具有启动子序列和mincd基因序列及基因组上的引入区域的碱基序列的dna片段(序列号23)。用限制性内切酶swai消化该dna片段，将得到的dna片段与同样经swai消化的日本特开2007-259708号公报中记载的载体pns2x-sacb和dna连接酶(ligation high(东洋纺株式会社制))连接，制备了mincd基因表达用质粒载体pns2x-pa-mincd。
98.接下来，通过与制造例1相同的方法将mincd基因表达用质粒载体pns2x-sacb-pa-mincd导入a1386缺失破坏株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了在染色体上插
入有启动子序列和mincd基因序列的1个菌株。将该mincd基因表达a1386缺失株命名为mincd表达a1386破坏株。
99.(制造例10)mincd表达a2405破坏株的制备
100.通过与制造例1相同的方法将mincd基因表达用质粒载体pns2x-sacb-pa-mincd导入a2405缺失破坏株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了在染色体上插入有启动子序列和mincd基因序列的1个菌株。将该mincd基因表达a2405缺失株命名为mincd表达a2405破坏株。
101.(制造例11)mincd表达a2405/a1386破坏株的制备
102.通过与制造例1相同的方法将a1386基因缺失用质粒载体pns2x-sacb a1386ud导入mincd表达a2405破坏株。进一步，通过与制造例1相同的方法，分离出了将染色体上的a1386结构基因的起始密码子至终止密码子缺失的1个菌株。将该mincd基因表达a2405/a1386缺失株命名为mincd表达a2405/a1386破坏株。
103.(比较例1)基于knk-005株进行的pha生产
104.在下述的条件下进行了使用knk-005株的培养研究。
105.(培养基)
106.种子培养基的组成设为1w/v％肉提取物、1w/v％细菌用胰蛋白胨(bacto-tryptone)、0.2w/v％酵母提取物、0.9w/v％na2hpo4·
12h2o、0.15w/v％kh2po4、(ph6.8)。
107.前培养培养基的组成设为1.1w/v％na2hpo4·
12h2o、0.19w/v％kh2po4、1.29w/v％(nh4)2so4、0.1w/v％mgso4·
7h2o、2.5w/v％棕榈油精油、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1n盐酸中溶有1.6w/v％fecl3·
6h2o、1w/v％cacl2·
2h2o、0.02w/v％cocl2·
6h2o、0.016w/v％cuso4·
5h2o、0.012w/v％nicl2·
6h2o)。作为碳源，以10g/l的浓度一次性添加了棕榈油精油。
108.pha生产培养基的组成设为0.385w/v％na2hpo4·
12h2o、0.067w/v％kh2po4、0.291w/v％(nh4)2so4、0.1w/v％mgso4·
7h2o、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1n盐酸中溶有1.6w/v％fecl3·
6h2o、1w/v％cacl2·
2h2o、0.02w/v％cocl2·
6h2o、0.016w/v％cuso4·
5h2o、0.012w/v％nicl2·
6h2o)。
109.(pha蓄积量相对于干燥菌体的比例的测定方法)
110.如下所述测定了pha蓄积量相对于干燥菌体的比例。通过离心分离，从培养液中回收菌体，用乙醇进行清洗，冷冻干燥，得到了干燥菌体。向得到的干燥菌体1g中加入100ml的氯仿，在室温下搅拌一昼夜，提取出菌体内的pha。滤去菌体残渣后，用蒸发器浓缩至总容量为30ml后，逐渐加入90ml的己烷，一边缓慢搅拌，一边放置1小时。将析出的pha滤去后，在50℃下真空干燥3小时。测定干燥pha的重量，计算出菌体内的pha蓄积量相对于干燥菌体的比例。
111.(细胞直径的测定方法)
112.如下所述测定了细胞直径。将培养结束后的培养液在65℃下处理60分钟，使菌体细胞失活后，通过激光衍射/散射式粒径分布测定装置(microtracbel公司制microtrac mt3300exii)进行分析，测定了细胞的体积平均直径(mv)。测定在标准设定(粒子透过性：透过，粒子折射率：1.81，粒子形状：非球形，溶剂折射率：1.333)下进行。
113.(细胞的显微镜观察)
114.如下所述进行了细胞的显微镜观察。将培养结束后的培养液适当稀释，置于载玻片使其干燥后，用品红进行了染色。通过光学显微镜观察了染色后的细胞。
115.(pha生产培养)
116.如下所述进行了pha生产培养。首先，将knk-005株的甘油原液(50μl)接种于种子培养基(10ml)，培养24小时，进行了种子培养。接下来，将种子培养液以1.0v/v％接种于加入有1.8l前培养培养基的3l发酵罐(jar fermentor)(marubishi bioengineering公司制mdl-300型)。运行条件设为培养温度33℃、搅拌速度500rpm、通气量1.8l/min，在将ph控制为6.7～6.8之间的同时培养28小时，进行了前培养。ph控制使用了14％氢氧化铵水溶液。
117.接下来，将前培养液以5.0v/v％接种于加入有2.5l的pha生产培养基的5l发酵罐(marubishi bioengineering公司制mds-u50型)。运行条件设为培养温度33℃、搅拌速度420rpm、通气量2.1l/min，将ph控制为6.7～6.8之间。ph控制使用了25％氢氧化铵水溶液。间断地添加了碳源。作为碳源，使用了棕榈油精油。培养进行至pha蓄积量达到90％左右。如上所述测定了pha蓄积量的比例及细胞直径。将结果示于表1。另外，将如上所述进行细胞的显微镜观察时拍摄的照片示于图1。
118.(比较例2)基于a0597缺失破坏株进行的pha生产
119.在与比较例1相同的条件下进行了使用a0597缺失破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图2。
120.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的a0597缺失破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株减少了10％以上。pha的生产性与knk-005株相同。
121.(比较例3)基于a0302缺失破坏株进行的pha生产
122.在与比较例1相同的条件下进行了使用a0302缺失破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图3。
123.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的a0302缺失破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株减少了10％以上。pha的生产性与knk-005株相同。
124.(比较例4)基于a2272插入破坏株进行的pha生产
125.在与比较例1相同的条件下进行了使用a2272插入破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图4。
126.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的a2272插入破坏株的细胞直径与作为亲本菌株的knk-005株相同。pha的生产性与knk-005株相同。
127.(实施例1)基于a1386缺失破坏株进行的pha生产
128.在与比较例1相同的条件下进行了使用a1386缺失破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图5。
129.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的a1386缺失破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株增大了20％以上。pha的生产性与knk-005株相同。
130.(实施例2)基于a2405插入破坏株进行的pha生产
131.在与比较例1相同的条件下进行了使用a2405插入破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图6。
132.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的a2405插入破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株增大了20％以上。pha的生产性与knk-005株相同。
133.(实施例3)基于a2405缺失破坏株进行的pha生产
134.在与比较例1相同的条件下进行了使用a2405缺失破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图7。
135.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的a2405缺失破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株增大了20％以上。pha的生产性与knk-005株相同。
136.(实施例4)基于a1386/a2405双重破坏株进行的pha生产
137.在与比较例1相同的条件下进行了使用a1386/a2405双重破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图8。
138.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的a1386/a2405双重破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株增大了40％以上。即，a1386破坏和a2405破坏对细胞直径增大具有协同效果或叠加效果。pha的生产性与knk-005株相同。
139.(实施例5)基于mincd表达a1386破坏株进行的pha生产
140.在与比较例1相同的条件下进行了使用mincd表达a1386破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图9。
141.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的mincd表达a1386破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株增大了20％以上。pha的生产性与knk-005株相同。
142.(实施例6)基于mincd表达a2405破坏株进行的pha生产
143.在与比较例1相同的条件下进行了使用mincd表达a2405破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图10。
144.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的mincd表达a2405破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株增大40％以上。即，a2405破坏和mincd表达对细胞直径增大具有协同效果或叠加效果。pha的生产性与knk-005株相同。
145.(实施例7)基于mincd表达a2405/a1386破坏株进行的pha生产
146.在与比较例1相同的条件下进行了使用mincd表达a2405/a1386破坏株的培养研究。将pha蓄积量的比例及细胞直径的测定结果示于表1。另外，将如上所述进行的细胞的显微镜观察的照片示于图11。
147.培养研究的结果是，在上述的条件下测得的mincd表达a2405/a1386破坏株的细胞直径比作为亲本菌株的knk-005株增大了50％以上。即，a1386破坏、a2405破坏及mincd表达对细胞直径增大具有协同效果或叠加效果。pha的生产性与knk-005株相同。
148.需要说明的是，通过hplc分析确认了比较例及实施例的培养研究所生产的pha为
phbh。
149.[表1]
[0150]