一种钩凝菜多糖及其在制备提高猪肉品质的制剂中的应用的制作方法

1.本发明属于生物多糖技术领域，尤其涉及一种钩凝菜多糖及其在制备提高猪肉品质的制剂中的应用。


背景技术：

2.猪是中国最主要的家畜品种之一，而且猪肉也是中国人民获取蛋白质等营养物质的最主要来源，在过去的十年，随着人们生活水平的不断提高，人民对猪肉的消费观念也在发生较大的改变，并且对优质、安全的猪肉产品的需求也大大增加。因此，有效的提高猪肉的品质，生产出满足人们需要的猪肉，是养殖工作中需要解决的问题。
3.在猪的生长发育中，骨骼肌的生长发育直接影响着动物肉类的数量和质量。研究表明肌肉纤维含量与肌肉肉色、ph值、保水性能、肌内脂肪含量和肌肉嫩度等呈现出显著的正相关。肌纤维的形成与肌卫星细胞的生长和分化息息相关，因此有效的促进肌卫星细胞的生长和分化可以有效的促进肌纤维的形成，从而有效的提高猪肉的品质。
4.钩凝菜，也被称之为牛毛石花菜、钩仙菜，其是一种仙菜科植物，主要生长在我国沿海低潮岩石上。钩凝菜制成的中药具有清热，通便的作用。目前，关于钩凝菜制备的多糖在猪肌肉生长中的作用尚无报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种钩凝菜多糖及其在制备提高猪肉品质的制剂中的应用。
6.为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种用于提高猪肉品质的钩凝菜多糖，所述钩凝菜多糖的制备方法包括如下步骤：（1）将干燥的钩凝菜使用清水清洗干净，使用烘干机烘干至重量不在变化，使用粉碎机粉碎为粉末；（2）加入20倍量的双蒸水，95℃浸提温度下浸提2h；（3）离心收集上清，65℃旋转蒸发至原体积的1/5，室温冷却后，得到钩凝菜浸提液；（4）加入3倍量的无水乙醇静置24h，离心得到沉淀；（5）加入10倍量的水溶解沉淀，使用sevage法脱蛋白，将上清液浓缩冷冻干燥后，得到脱除蛋白的钩凝菜粗多糖；（6）将所述钩凝菜粗多糖配置成0.1g/ml的钩凝菜粗多糖水溶液，使用150kda的超滤膜进行过滤，保留滤过液；（7）将滤过液冷冻干燥后，得到钩凝菜多糖。
7.优选地，所述钩凝菜多糖提高饲养猪的猪肉中瘦肉含量。
8.钩凝菜多糖在制备提高猪肉品质的生物制剂中的应用。
9.钩凝菜多糖在制备通过提高猪肉瘦肉含量来提高猪肉品质的生物制剂中的应用。
10.钩凝菜多糖在制备促进猪骨骼肌卫星细胞增殖的制剂中的应用。
11.钩凝菜多糖在制备促进猪骨骼肌卫星细胞成肌分化制剂中的应用。
12.钩凝菜多糖在制备促进猪骨骼肌卫星细胞中细胞周期促进蛋白表达促进剂中的应用，其特征在于，所述细胞周期促进蛋白为cyclin-d1和cdk-1。
13.钩凝菜多糖在促进猪骨骼肌卫星细胞中肌分化标志基因的蛋白表达的促进剂中的应用，其特征在于，所述肌分化标志基因为myod，myog和myhc。
14.本发明的有益效果是：本发明提供了一种钩凝菜多糖，该钩凝菜多糖能够有效的促进猪骨骼肌卫星细胞的增殖，并且可以有效的促进细胞周期促进蛋白cyclin-d1和cdk-1的蛋白表达，并且可以有效的降低细胞周期抑制蛋白p21的蛋白表达。
15.而且，本发明所提供的钩凝菜多糖能够有效的促进猪骨骼肌卫星细胞的成肌分化基因myod，myog，myhc的蛋白表达，从而可以有效的促进细胞的成肌分化。
16.总的来说，本发明所提供的钩凝菜多糖能够有效的猪骨骼肌卫星细胞的增殖和成肌分化，从而可以有效的使更多的细胞向着肌肉细胞发育，使猪肉的瘦肉含量得到增加，提高猪肉的肉质。
附图说明
17.图1为不同浓度的钩凝菜多糖对于猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响；图2为5mg/ml钩凝菜多糖对于猪骨骼肌卫星细胞增殖速率影响的生长曲线；图3为5mg/ml钩凝菜多糖对于猪骨骼肌卫星细胞的周期蛋白的蛋白表达的影响；图4为5mg/ml钩凝菜多糖对于猪骨骼肌卫星细胞的肌分化基因的蛋白表达的影响。
具体实施方式
18.所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
19.实施例1（1）将100g干燥的钩凝菜使用清水清洗干净，使用烘干机烘干至重量不在变化，使用粉碎机粉碎为粉末；（2）加入2000ml的双蒸水，95℃浸提温度下浸提2h；（3）离心收集上清，65℃旋转蒸发至400ml，室温冷却后，得到钩凝菜浸提液；（4）加入1200ml的无水乙醇静置24h，离心得到沉淀；（5）取1g沉淀加入10ml的水溶解沉淀，使用sevage法脱蛋白，将上清液浓缩冷冻干燥后，得到脱除蛋白的钩凝菜粗多糖；（6）将钩凝菜粗多糖配置成0.1g/ml的钩凝菜粗多糖水溶液，使用150kda的超滤膜进行过滤，保留滤过液；（7）将滤过液冷冻干燥后，得到钩凝菜多糖。
20.实施例2（1）选取小于7日龄的仔猪，颈动脉处死后，75%消毒酒精擦拭全身进行消毒；（2）在超净工作台内快速剪取仔猪后腿的肌肉，并将其放入到pbs中漂洗2-3遍；（3）快速的将肌肉表面的筋膜剔除，同时使用剪刀将肌肉组织剪碎成肉糜；（4）将肉糜转移到细胞培养瓶中，室温静置5-10min，去除上清；（5）按照2:1的体积比加入2型胶原酶，37℃水浴摇床震荡消化2.5h，至组织变成黄色粘稠液体；（6）充分消化后，加入等胶原酶体积的终止消化液，震荡均衡后，经100目细胞筛过滤后，转移过筛溶液至50ml离心管中，室温2500rpm离心15min；（7）去除上清后，pbs重悬细胞，再依次经200目和400目细胞筛过滤后，转移过筛溶液至15ml离心管中，室温2000rpm离心10min；（8）去除上清后，加入培养基重悬细胞，将溶液转移至10cm培养皿中，37℃，5% co2贴壁培养2.5h，将上清转移到新培养皿中继续培养，从而得到猪骨骼肌卫星细胞。
21.实施例3通过cck-8实验检测钩凝菜多糖是否能够促进猪骨骼肌卫星细胞增殖（1）将猪骨骼肌卫星细胞接种于96孔板中，每孔100μl，5000个细胞；（2）细胞贴壁后，更换为含有0μg/ml（a组）， 500μg/ml（b组），1mg/ml（c组），2.5mg/ml（d组）,5mg/ml（e组），10mg/ml（f组）钩凝菜多糖的培养基对细胞进行培养，每组设置3个重复；（3）将细胞培养48h之后，每孔加入10μl cck-8,37℃孵育2h后，检测450nm od值，实验结果如图1。
22.各组的od值如下：表1 不同细胞处理组的od值
分组a组b组c组d组e组f组od值0.442
±
0.0320.455
±
0.0300.520
±
0.0300.561
±
0.0190.644
±
0.0310.653
±
0.042
可以看出，当钩凝菜多糖的浓度大于1mg/ml的时候，钩凝菜多糖对于猪骨骼肌卫星细胞具有促进作用，当钩凝菜多糖的浓度大于5mg/ml的时候，达到最适浓度。
23.实施例4通过cck-8检测5mg/ml钩凝菜多糖对于细胞增殖速率的影响（1）将猪骨骼肌卫星细胞接种于96孔板中，每孔100μl，5000个细胞；（2）细胞贴壁后，更换为含有0mg/ml和5mg/ml钩凝菜多糖的培养基对细胞进行培养；（3）分别在12h，24h，36h，48h，每孔加入10μl cck-8,37摄氏度孵育2h后，检测450nm od值，实验结果如图2所示。
24.从图2可以看出，使用5mg钩凝菜多糖处理后，细胞增殖速率更快，因此使用钩凝菜多糖处理猪骨骼肌卫星细胞后，能够有效的促进细胞的增殖速率。
25.实施例5western blot检测钩凝菜多糖对于猪骨骼肌卫星细胞中细胞周期蛋白表达的调控
（1）将猪骨骼肌卫星细胞接种于6孔培养板中，待细胞密度达到75%以上的时候，分别将培养基更换为含有0mg/ml和5mg/ml钩凝菜多糖的培养基，置于细胞培养箱中进行培养；（2）培养48h之后，使用pbs洗涤细胞，每孔加入100μl的蛋白裂解液并使用细胞刮刀将细胞刮下，之后使用移液枪将细胞和细胞裂解液的混合转移到离心管中；（3）冰上裂解30min，每10分钟进行一次涡旋震荡，裂解结束后，将离心管放置在离心机中，调整参数为4℃，12000rpm/min，10min进行离心；（4）离心结束后，将上清转移到新的离心管中，吸取上清检测蛋白浓度，之后根据各样品的浓度加入上样缓冲液，沸水煮5min后，得到蛋白样品；（5）配置5%的上层胶和12%的下层胶，组装电泳架进行点样，点样结束后加入电泳液，打开电源开始电泳；（6）电泳结束后，按照三明治模型组装电转夹进行电转，电转结束后，将膜取出放入到5%的脱脂奶粉中，室温封闭1h；（7）使用tbst洗膜之后孵育cyclin-d1，cdk-1，p21和β-actin的一抗，4℃封闭过夜；（8）一抗孵育结束后，孵育相应的二抗，室温下置于摇床上孵育1h；（9）使用tbst洗膜后，暗室中进行显影曝光，实验得到的结果如图3所示。
26.从图中，可以看出，使用钩凝菜多糖处理细胞后，细胞中促进增殖的细胞周期促进蛋白cyclin-d1和cdk-1的蛋白表达量升高，而抑制增殖的细胞周期抑制蛋白p21的蛋白表达量降低，说明钩凝菜多糖能够通过调控细胞周期蛋白来调控猪骨骼肌卫星细胞的增殖。
27.实施例6（1）将猪骨骼肌卫星细胞接种于6孔培养板中，待细胞密度达到75%以上的时候，分别将培养基更换为含有0mg/ml和5mg/ml钩凝菜多糖的成肌分化培养基，置于细胞培养箱中进行培养；（2）培养48h之后，使用pbs洗涤细胞，每孔加入100μl的蛋白裂解液并使用细胞刮刀将细胞刮下，之后使用移液枪将细胞和细胞裂解液的混合转移到离心管中；（3）冰上裂解30min，每10分钟进行一次涡旋震荡，裂解结束后，将离心管放置在离心机中，调整参数为4℃，12000rpm/min，10min进行离心；（4）离心结束后，将上清转移到新的离心管中，吸取上清检测蛋白浓度，之后根据各样品的浓度加入上样缓冲液，沸水煮5min后，得到蛋白样品；（5）配置5%的上层胶和12%的下层胶，组装电泳架进行点样，点样结束后加入电泳液，打开电源开始电泳；（6）电泳结束后，按照三明治模型组装电转夹进行电转，电转结束后，将膜取出放入到5%的脱脂奶粉中，室温封闭1h；（7）使用tbst洗膜之后孵育肌分化标志基因myod，myog，myhc和β-actin的一抗，4℃封闭过夜；（8）一抗孵育结束后，孵育相应的二抗，室温下置于摇床上孵育1h；（9）使用tbst洗膜后，暗室中进行显影曝光，实验得到的结果如图4所示。
28.可以看出，使用钩凝菜多糖处理后，可以有效的促进肌分化标志基因myod，myog，
myhc的蛋白表达，从而可以促进猪骨骼肌卫星细胞的成肌分化。
29.最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。