引起番茄抗坏血酸合成差异的SNP位点、筛选方法及鉴别方法

引起番茄抗坏血酸合成差异的snp位点、筛选方法及鉴别方法
1.本技术为申请日为2021年07月15日的中国发明专利申请：icl 基因在调控番茄抗坏血酸积累中的应用(申请号cn202110802319.6) 的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及番茄抗坏血酸合成snp检测技术领域，尤其涉及引起番茄抗坏血酸合成差异的snp位点、筛选方法及鉴别方法。


背景技术：

3.在植物体内，抗坏血酸可以作为一些酶的辅酶，调控植物体内的酶促反应，提高细胞应对逆境抗性；保护植物光合作用；延缓衰老；抗坏血酸还可以作为植物生长调节因子。抗坏血酸通过调控氧化还原水平协调茉莉酸和乙烯途径诱导系统抗病性；抗坏血酸通过调节氧化 /抗氧化平衡影响番茄果实的成熟。目前，已报道的抗坏血酸生物合成途径主要有甘露糖/半乳糖合成途径，asa合成途径、asa合成的半乳糖醛酸途径，asa生物合成的古洛糖途径、asa生物合成的肌醇途径。抗坏血酸合成后由apx和ao催化酶等氧化降解，通过 dhar还原再生系统再生。
4.异柠檬酸裂解酶又称异柠檬酸裂合酶(isocitrate lyase，icl)，催化异柠檬酸裂解成乙醛酸和琥珀酸，其中乙醛酸进入乙醛酸循环，琥珀酸通过一系列反应合成葡萄糖。异柠檬酸裂解酶是乙醛酸循环途径中的关键酶(kamal et al.，2021)，但是至今icl在植物中研究较少，尤其是番茄中研究较少。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在探寻icl基因在番茄的相关代谢途径，以期为番茄的生长发育以及增产提质提供帮助。
6.第一方面，本发明实施例公开了4个引起番茄抗坏血酸合成差异的snp位点，分别位于异柠檬酸裂解酶编码基因的起始密码子上游 286bp、847bp、1193bp和1981bp处，所述基因位于番茄7号染色体sl2.50ch07:60973492..60970926，该基因序列ncbi序列号为 nm_001246949.2，sgn基因索列号为solyc07g052480.2。
7.第二方面，本发明还公开了一种引起番茄抗坏血酸合成差异的 snp位点的筛选方法，包括以下步骤：
8.选取maf》0.05及最小等位基因品种≧6的5.5m高质量的snp 进行全基因组关联分析；
9.通过tassel 4.0中压缩混合线性模型对抗坏血酸含量进行 gwas关联分析，阈值为p≦1.8
×
10-7
(p＝1/n；n＝总snp数)，显著相关snp位点上下游50kb范围内的基因为可能的候选基因；
10.根据番茄核心种质资源重测序数据和一代测序分析所述候选基因在不同番茄材料中的snp位点，作为候选snp位点；
11.排除所述候选基因编码取的snp位点，即可得到引起番茄抗坏血酸合成差异的所述snp位点；
12.其中，所述候选基因为于番茄7号染色体sl2.50ch07: 60973492..60970926，该基因序列ncbi序列号为nm_001246949.2， sgn基因索列号为solyc07g052480.2；
13.引起番茄抗坏血酸合成差异的所述snp位点分别位于所述候选基因的起始密码子上游286bp、847bp、1193bp和1981bp处。
14.第三方面，本发明还公开了一种一种高含量抗坏血酸番茄种质资源的鉴别或辅助鉴别方法，包括：
15.检测位于异柠檬酸裂解酶编码基因的起始密码子上游286bp、 847bp、1193bp和1981bp处的snp位点，所述基因位于番茄7号染色体sl2.50ch07:60973492..60970926，该基因序列ncbi序列号为 nm_001246949.2，sgn基因索列号为solyc07g052480.2；
16.若所述基因在286bp、847bp、1193bp和1981bp处的4个snp 位点核苷酸碱基依次为a、t、g、c，则判断该番茄材料为单倍型高含量抗坏血酸番茄种质资源。
17.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
18.本发明实施例通过筛选方方法确定了番茄候选基因中的4个引起其抗坏血酸合成差异的snp位点，该snp位点能够为鉴定或辅助鉴定高含量抗坏血酸番茄种植资源提供了技术支持。
附图说明
19.图1为本发明实施例提供的番茄自然群体中抗坏血酸含量分布结果图；图1a为不同自然群体中抗坏血酸含量分布图；图1b为不同自然群体中抗坏血酸含量正态分布图；图1c为抗坏血酸含量在不同群体分类图。
20.图2为本发明实施例提供的番茄自然群体红熟果实抗坏血酸相对含量mgwas关联图；2013年抗坏血酸gwas关联结果曼哈顿图 (a)和qq plot图(b)；2016年抗坏血酸gwas关联结果曼哈顿图(c)和 qq plot图(d)；图2中最下方一分图为最高点chr07:60983724 131 kb 区间内snp位点图。
21.图3为本发明实施例提供的各番茄与其他物种icl氨基酸序列比对结果图；图中；方框分别表示过氧化物酶体靶向信号(pts)的arm 三肽(ala-arg-met)，lkp基序(leu-169、lys-170、pro-171)和tkk 基序(thr-210、lys-211、lys-212)；番茄：solyc07g052480.2.1，烟草： xp_016500530.1、xp_009615982.1、xp_009790446.1、xp_019249474.1，可可：xp_007045605.2，扁桃：xp_034206574.1，山杏：aiu64852.1，甜樱桃：xp_021822841.1，罂粟：xp_026435746.1，雷公藤： xp_038705040.1，苹果：xp_008379623.2，木薯：xp_021630157.1、 xp_031103078.1、xp_019192878.1、aag44479.1，梅：xp_008230083.1，马铃薯：xp_006367277.1，辣椒：kaf3674797.1、kaf3680818.1。
22.图4为本发明实施例提供的番茄自然群体中icl单倍型分析和抗坏血酸含量分析结果图；图4a为在自然群体中icl序列单倍型分析结果；根图4b为icl单倍型对应的抗坏血酸含量；图4c为icl启动子上游286bp处snp位点(chr07:60973535)所代表的不同番茄基因型及其抗坏血酸含量；图4a中，粗长方体代表外显子，外显子之间为内含子，最左方外显子之前为启动子区，最右方外显子外侧为5’utr区；四个基因型的snp位点均位于启动子区，右
方方框内分别表示四种基因型在本发明实施例中不同品种番茄中的数量和总体数量。
23.图5为本发明实施例提供的自然群体中各品种在icl单倍型中的分布图。
24.图6为本发明实施例提供的自然群体抗坏血酸极端材料抗坏血酸含量(a)和icl表达量(b)，以虚线为分界线，左边是极端低材料，右边是极端高材料。
25.图7为本发明实施例提供的基于gus载体的检测结果图，第一泳道为pros1icl
(ac)
::gus，第二泳道为pros1icl
(ts158)
::gus。
26.图8为本发明实施例提供的ts158番茄和ac番茄材料启动子 gus染色和gus表达结果图；图8a为烟草中ts158和ac材料启动子gus染色图；图8b为烟草中ts158和ac材料启动子gus基因表达量结果图；图8c为ts158和ac材料启动子转基因材料幼苗 gus染色图。
27.图9为本发明实施例提供的35s::icl-yfp融合表达载体检测结果图；从图中左至右，第1至10泳道为35s::icl-yfp融合表达载体 pcr检测条带，第11泳道为marker(marker条带大小从上往下为 5000bp、3000bp、2000、1500bp、750bp、500bp、300bp、200bp、100bp)。
28.图10为本发明实施例提供的icl亚细胞定位结果图； 35s::icl-yfp用绿光激发；mtbr是线粒体marker显示红光。
29.图11为本发明实施例提供的icl-pro35s-oe载体检测结果图；图中从左至右，第1泳道为marker(marker条带大小从上往下为 5000bp、3000bp、2000、1500bp、750bp、500bp、300bp、200bp、100bp)，第2至9泳道为icl-pro35s-oe超量表达载体pcr检测条带。
30.图12为本发明实施例提供的icl-pro158-oe载体检测结果图；图中从左至右，第1至10泳道为icl-pro158-oe自身启动子超量表达载体pcr检测条带，第11泳道为marker(marker条带大小从上往下为5000bp、3000bp、2000、1500bp、750bp、500bp、300bp、200bp、 100bp)。
31.图13为本发明实施例提供的icl crispr敲除靶点示意图(图 13a)和靶点敲除序列分析(图13b，图13c)。
32.图14为本发明实施例提供的不同启动子驱动icl超量转基因植株中icl表达分析结果图；图14a为camv35s启动子驱动超量转基因材料icl表达量；图14b为ts158自启动子超量转基因材料icl 表达量；图14c为ac自启动子超量转基因材料icl表达量。
33.图15为本发明实施例提供的icl超量转基因材料抗坏血酸含量结果图；图15a-15d依次为camv35s、ts158、camv35s、ts158 启动子驱动超量转基因材料叶片抗坏血酸含量结果图。
34.图16为本发明实施例提供的icl crispr敲除转基因材料抗坏血酸含量结果图；图16a-16b是依次为以ac和ts158为背景iclcrispr敲除转基因叶片抗坏血酸含量；图16c-16d是依次以ac和 ts158为背景icl crispr敲除转基因红熟果实抗坏血酸含量。
35.图17为本发明实施例提供的以ts158为背景的敲除转基因材料红熟果实gc-ms分析结果图，相关成分包括甘露糖、肌醇、半乳糖醛酸、半乳糖、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸、苹果酸。
36.图18为本发明实施例提供的icl超量转基因材料红熟果实 gc-ms分析结果图，相关成分包括苹果酸、半乳糖、葡萄糖、柠檬酸、半乳糖、肌醇、蔗糖。
具体实施方式
37.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明
进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
38.本发明实施例通过分析番茄自然群体中抗坏血酸含量的相关基因，并且经过分析定位于icl基因，并充分研究了icl基因在番茄抗坏血酸合成代谢中的作用，结果发现过表达或超表达该基因，能够促使番茄获得高含量的抗坏血酸，为提升番茄品质、获得优质番茄种植资源提供了技术支持。下方将详细介绍本发明实施过程。
39.本发明涉及的菌株及载体来源为：大肠杆菌菌株trans t1(百奥莱博)，c58、gv2260根癌农杆菌菌株(北京华越洋人生物)；遗传转化使用的载体有超量表达载体phelles gate8(biovector ntcc典型培养物保藏中心)、crispr敲除载体ptx(汉恒生物)，gus表达载体pmv2(赛默飞)、亚细胞定位载体101-yfp(赛默飞)。其他未尽详细说明和补充的均为可用商业途径购买的相关实验材料和试剂。
40.实施例1、番茄自然群体中抗坏血酸含量的分布
41.根据本实施例根据2013年360多份番茄自然群体红熟果实gc-ms测定结果，对抗坏血酸含量进行分析。
42.本发明实施例利用的番茄核心种质资源红熟果实进行抗坏血酸含量的全基因组关联分析，番茄材料分别来自于美国农业部(usda)，番茄遗传资源中心(tgrc)，法国国家农业研究所(inra)，欧盟茄科项目(eu-sol)和中国农业科学院蔬菜花卉研究所(ivf-caas)。其中包括166份大果番茄(big)；17份f1现代商业品种(big)； 112份樱桃番茄(cer)；53份醋栗番茄(pim)；10份野生番茄。这些材料的品种信息和测序结果见(lin et al.，2014)。利用gc-ms对红熟果实的代谢物进行测定，2013年种植360份于华中农业大学实验田，2016年500多份种植于武汉市蔬菜研究所北部园区，做两次生物学重复，对其中抗坏血酸含量进行mgwas关联分析。选择其中的高抗坏血酸含量ts158和低抗坏血酸含量ts9(ac)作为遗传转化背景材料进行基因功能鉴定。
43.番茄样品准备：番茄样品均取自红熟期的第二花序以上的果实，取样时保证果实成熟期，果实大小等均一致，在同一系的多棵植株进行取样。用液氮将果实果肉部分进行速冻，放入-80℃冰箱保存。对所有转基因材料的取样方法同上，保证生物学时期一致。用液氮将保存的样品研磨成粉末状进行后续测定。
44.番茄红熟果实中抗坏血酸的gc-ms测定：
45.1、样品预处理
46.取液氮研磨后的样品，每个样品称取0.2g左右，并记录称取的重量；加入750μl 100％色谱级甲醇进行提取，混匀后涡旋15s；加入31.5μl浓度为0.2m
ɡ
/ml的核糖醇作为内标，涡旋混匀；30℃摇床震荡15min，14000r/min离心10min；离心后，将600μl上清液加入新的2ml离心管中，加入402μl色谱级氯仿，再加入803.23μlddh2o；上述混合物涡旋15s，4000r/min离心15min；取上清液200 μl真空干燥2h，成胶状；加入90μl 20mg/ml的甲氧氨基盐酸盐吡啶溶液，37℃培养箱反应90min；加入90μl衍生化试剂n-n-n三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺(mstfa)，37℃培养箱反应90min；14000 r/min离心10min，将100μl上清液加入含内插管的进样瓶中，上机检测。
47.2、gc-ms：
48.使用气相色谱-质谱联用(thermo finnigan，manchester，uk) 测定代谢物含量，
气相色谱柱为hp-5ms毛细管柱(100％二甲基聚硅氧烷，30mm
×
0.25mm i.d.
×
0.25μm膜厚)(安捷伦，美国)，ei离子源(70ev)，扫描范围50-600m/z，离子源温度280℃，进样口温度为230℃，界面温度为250℃，载气为氦气，流量为1.2ml/min；升温程序为：70℃保持5min，然后以5℃/min升温至300℃，保持 3min。最后在70℃下平衡1min，再进下一个样品；分流比为50：1；每次进样1μl，一个样品需要60min，自动进样。
49.根据抗坏血酸的相对含量在自然群体中的分布显示，抗坏血酸含量在自然群体中差异比较显著，且符合正态分布(图1a，图1b)，本实施例进一步根据360份材料的品种分类(pim：醋栗番茄，cer：樱桃番茄，big：大果番茄，f1)，对这4个番茄品种的相对抗坏血酸含量进行分析，结果显示pim番茄的抗坏血酸含量显著高于cer， big和f1；cer次之，f1最低。这一结果符合番茄进化结果，pim 进化到cer，再到big，说明抗坏血酸含量是逐步减少的。
50.实施例2、番茄抗坏血酸含量全基因组关联分析
51.由于抗坏血酸在自然群体中差异较大，且由微效多基因控制。本实施例中所用的番茄基因型数据为已发表论文中的重测序数据(linet al.，2014nature genetics)，选取maf》0.05及最小等位基因品种≧6的5.5m高质量的snp进行全基因组关联分析。通过tassel 4.0 中压缩混合线性模型(cmlm)对抗坏血酸含量进行gwas关联分析，阈值为p≦1.8
×
10-7
(p＝1/n；n＝总snp数)，显著相关snp位点上下游50kb范围内的基因为可能的候选基因。
52.根据gwas关联结果，本实施例发现在7号染色体和9号染色体上均存在一个超过阈值的snp位点，由于9号染色体snp位点已经被鉴定，该位点为bhlh59转录因子，它可以结合slpmm、slgmp2、 slgmp3基因的启动子调控番茄抗坏血酸的含量(ye et al.，2019)。因此，本实施关注了7号染色体上的位点，且该位点在两次gwas 关联中均可以得到(图2)。现该位点的lead snp为ch07_60983724， p值为4.56
×
10-10
(图2)。
53.根据关联分析的结果，本实施例进一步对该snp位点上下游50 kb区域内的基因进行分析，发现该区域内有12个基因，根据这些基因的注释信息、启动子及编码区序列分析、极端材料中基因表达量测定等，初步将solyc07g052480作为候选基因。这个候选基因的基因注释为异柠檬酸裂解酶(isocitrate lyase:icl)，该基因距离主效snp 只有10232bp(如表1)。
54.表1 asa mgwas分析得到7号染色体主效snp上下游50kb范围内基因
55.基因与主效snp的距离基因注释solyc07g05242047690chromosome 15 contig 1 dna sequencesolyc07g05243042493transmembrane protein 97solyc07g05244040800transmembrane protein 97solyc07g05245038198phosphate translocatorsolyc07g05246031879genomic dna chromosome 3 p1 clonesolyc07g05247012741syntaxinsolyc07g05248010232isocitrate lyasesolyc07g052490-20510myb family transcription factorsolyc07g052500-27593polyubiquitinsolyc07g052510-38188peroxidasesolyc07g052520-44465unknown protein
solyc07g052530-47682peroxidase
56.实施例3、icl基因序列分析
57.由此上述实施例可知，番茄icl基因位于7号染色体上，该基因序列ncbi序列号为nm_001246949.2，sgn基因索列号为 solyc07g052480.2。利用sgn网对其序列进行分析，它在染色体上位于sl2.50ch07:60973492..60970926。icl的全长gdna有2022bp，包含3个外显子和2个内含子，共编码575个氨基酸。对icl的氨基酸序列进行分析，发现在27-575个氨基酸之间的区域是保守的icl 结构域。
58.进一步分析发现icl编码的蛋白质含有leu-169、lys-170、pro-171(lkp)和thr-210、lys-211、lys-212(tkk)基序，具有已报道的底物结合域功能，以及推测的过氧化物酶体靶向信号(pts) ala-arg-met(arm)三肽。lkp和tkk基序构成了推测的底物结合域，arm是推测的过氧化物酶体靶向信号(图3)。
59.根据番茄核心种质资源重测序数据和一代测序结果显示icl在不同材料中存在多个snp位点(详细基因组序列信息见 https://solgenomics.net/search/locus)，根据这些snp位点，可将icl 分成4种单倍型(hapⅰ、hapⅱ、hapⅲ、hapⅳ)。
60.结果如图4所示，其中在编码区存在一个t/c突变，这个突变位点位于第二个外显子上，距离起始密码子1299bp处，这个snp的差异会引起ctg-ttg的密码子差异，产生一个亮氨酸的同义突变，说明外显子的snp差异没有引起氨基酸的变化，这个snp的差异在三个品种中均有分布且差异不显著(图4a)。因此，本实施例在排除编码区的snp差异引起抗坏血酸含量的差异后；进一步对icl的2kb 启动子片段进行序列分析，结果显示存在4个差异显著的snp，分别位于起始密码子上游286bp(snp ch07_60973535)、847bp(snpch07_60974096)、1193bp(snp ch07_60974395)和1981bp(snpch07_60975230)处(图4a)。
61.本实施例进一步对这4种单倍型在番茄自然群体中的分布进行统计，根据snp位点变异和其分布特点，在排除编码区的差异后，发现hapiii和hapiv启动子相同，且pim(醋栗番茄)要集中为hapi 单倍型，而cer(樱桃番茄)和big(大果番茄)主要集中为hapiii 和hapⅳ单倍型，因此，可以推测hapi与hapiii、hapiv单倍型的启动子差异可能是引起抗坏血酸含量在自然群体中产生变化的主要原因。
62.为了进一步验证icl对抗坏血酸含量的影响，本实施例还对自然群体中不同单倍型的抗坏血酸相对含量进行统计，结果显示(图4b) 单倍型hapⅰ抗坏血酸含量高于其他表型。这些结果均表明启动子不同的单倍型会引起抗坏血酸含量的差异。
63.进一步利用plantcare(参见 http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和 plantpan3.0(plantpan.itps.ncku.edu..tw)对icl基因的启动子进行预测，结果显示在启动子上游286bp处的差异，可能会引起一个顺式元件的差异(caatca/caaaca)，而这个顺式元件的差异可能会产生一个hd-zip转录因子的差异(拟南芥中的at3g60390:hat3)；对拟南芥的这个hd-zip转录因子进行分析，发现其在番茄中同源性最高的基因为solyc08g078300.2(homeobox-leucine zipper protein hb2-like)。在拟南芥中hat3可以控制顶端胚胎发育和分生组织功能(turchi etal.，2013)；控制拟南芥叶片发育(bou-torrent et al.，2012)。这个 hd-zip转录因子对icl的调控还需进一步验证。进一步对286bp处 snp位点抗坏血酸含量进行统计，结果显示碱基a(包含完整顺式元件)抗坏血酸含量高于碱基g(没有顺式元件)，说明286bp处snp 差异可能会引起抗坏血酸的差异(图
4c)。
64.为进一步分析icl在自然群体中的单倍型分布与pim、cer和big之间的关系，并统计自然群体中pim、cer、big在不同icl单倍型中的占比。结果如图5显示，在hapⅰ中，pim、cer、big均有分布，其中pim占48％，cer占25％，big占28％；hapⅱ中只有 pim和cer，分别占比38％和62％；hapiii和hapiv中，均只有cer 和big，hapiii中big占82％，cer占18％，单倍型iv中big占39％， cer占61％。
65.因此，通过分析自然群体中icl基因单倍型，能够获知其是否为高含量抗坏血酸种质资源，为番茄高含量抗坏血酸种质资源提供帮助。
66.实施例4、icl在抗坏血酸高含量和低含量材料中的表达分析
67.为进一步验证icl基因起始密码子上游第286bp处的snp差异引起表型抗坏血酸含量的差异，本实施例在抗坏血酸极端材料中对 icl的表达量进行测定。挑选了抗坏血酸含量高、低极端材料各6份，对抗坏血酸含量进行确定，结果如图6显示，极端高材料抗坏血酸含量高于极端低材料抗坏血酸含量(图6a)；对极端材料中icl的表达量进行测定，结果显示极端高材料中icl的表达量显著高于极端低材料中icl的表达量(图6b)，说明自然群体中抗坏血酸含量的差异是由icl的启动子差异引起。
68.实施例5、icl差异启动子gus染色分析
69.为进一步探究icl启动子的功能，本实施例利用primer premier 5 设计引物扩增icl 2k启动子片段，引物序列为fw(如seq id no.1 所示)和rv(如seq id no.2所示)。
70.以高抗坏血酸材料ts158和低抗坏血酸材料ts9(ac)的gdna 为模板，扩增得到了icl 2kb启动子片段，通过同源重组连接到pmv2 (包含gus报告基因)表达载体，转入大肠杆菌trans t1；分别得到proicl(ts158)::gus和proicl(ac)::gus两个表达载体，将阳性检测正确的大肠杆菌单克隆送天一辉远公司测序。其中ts158启动子类型属于单倍型ⅰ，ac(ts9)启动子类型属于单倍型ⅳ。载体电泳检测结果如图7所示。
71.将测序结果正确的proicl(ts158)::gus和proicl(ac)::gus载体质粒通过农杆菌介导的方法转入烟草叶片中进行瞬时表达，农杆菌介导和瞬时表达的方法参照(宋建文，华中农业大学博士学位论文， 2019)进行。经注射后的烟草叶片中包含proicl(ts158)::gus和 proicl(ac)::gus表达载体，在gus染液中染色12h(gus染液包含：0.1mol磷酸缓冲液，ph7.0；0.5mmol k3[fe(cn6]，0.5mmolk4[fe(cn)6]
·
3h2o，10mmol edta-na22h2o，0.1％triton x-100，2％ x-gluc，可以不同程度染上蓝色，通过95％(v/v)乙醇脱去叶绿素后，观察烟草叶片上是否染上蓝色以及颜色的范围和深浅；对农杆菌介导后的烟草叶片进行取样，提取rna(invitrogen ambion rna试剂盒，赛默飞)，反转录成cdna后进行qpcr检测，测定叶片中gus 基因的表达量，rna提取，反转录cdna和qpcr检测方法参照(刘根忠，华中农业大学博士学位论文，2020)进行。
[0072]
结果如图8显示，proicl(ts158)::gus表达载体注射后的烟草叶片蓝色显著深于proicl(ac)::gus表达载体注射过的烟草叶片，且蓝色范围较广(图8a)；烟草叶片表达量分析结果也显示proicl(ts158)::gus中gus基因的表达量显著高于 proicl(ac)::gus(图8b)。
[0073]
随后，将两个表达载体以ac为背景材料进行遗传转化，获得 proicl(ts158)::gus和proicl(ac)::gus转基因材料。提取转基因番茄材料的gdna，经阳性检测后，将阳性植株
幼苗进行gus染色12 h，通过95％(v/v)乙醇脱去叶绿素后，观察烟草叶片上是否染上蓝色以及颜色的范围和深浅。结果显示，两种表达载体均在叶片和茎中表达，但是proicl(ts158)::gus转基因幼苗蓝色显著高于 proicl(ac)::gus转基因幼苗，且在跟中也有表达(图8c)。这些结果均说明icl的启动子在ts158中的活性显著高于ac材料，其具有促进抗坏血酸合成代谢的调控作用。
[0074]
实施例6、icl亚细胞定位
[0075]
为了研究icl与抗坏血酸含量之间的关系，将icl的氨基酸序列通过psi网站(http://bis.zju.edu.cn/psi/)对其亚细胞定位进行分析，结果表明icl可能定位于叶绿体和线粒体。为验证icl的定位，利用primer premier 5设计扩增去掉icl终止密码子的引物，并在正向引物前加上重组序列(如seq id no.6所示)和反向引物前加上重组序列(如seq id no.7所示)，以ac材料cdna为模板扩增片段，通过同源重组连接到101-yfp载体(北诺生命科技)上。将同源重组片段转入大肠杆菌trans t1感受态细胞中，单克隆进行菌落pcr 鉴定阳性克隆，检测阳性的菌落直接送天一辉远公司测序。将测序正确的菌落活化后提取质粒，将质粒通过电击转化转入农杆菌菌株gv2260中，单克隆进行pcr阳性检测，得到的35s::icl-yfp融合表达载体检测如图9所示。
[0076]
将camv35s启动子驱动构建35s::icl-yfp融合表达载体，在烟草叶片中进行瞬时表达。利用转基因材料的叶片提取植物组dna。对于camv35s强启动子超量，用camv35s引物和目的基因反向引物；对于ts158和ac自启动子超量，用基因自启动子超量正向引物和phelles gate8反向引物；cpispr敲除材料在t0代时先用ptx载体(由中国科学院遗传发育研究所馈赠)引物检测，剔除无载体插入的植株，利用包含两点靶点的总片段为600～800bp长的片段设计片段检测引物，再用片段检测引物进行检测，随后将检测引物扩增的 pcr产物送天一辉远公司测序，分析靶点敲除情况，保留有大片段缺失或者插入的植株进行后续研究。
[0077]
通过共聚焦显微镜进行亚细胞定位观察，以线粒体marker基因 mtbr作为定位对照(叶绿体自发荧光)，结果显示icl定位于线粒体中(图10)，而抗坏血酸生物合成途径的关键基因l-半乳糖-1,4
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内酯脱氢酶存在于线粒体(bartoli et al 2000)，说明icl和抗坏血酸空间位置上是一致的。
[0078]
实施例7、icl转基因番茄基因表达和抗坏血酸含量
[0079]
超量表达载体构建：
[0080]
为了进一步验证icl与抗坏血酸含量的关系，本实施例利用 primer premier 5设计扩增候选基因的全长开放阅读框，在正向引物前加上重组序列(如seq id no.3所示)并加上xhoi的酶切位点，反向引物前加上重组序列(如seq id no.4所示)，并加上xbai的酶切位点。以ac材料的gdna为模板扩增片段，利用同源重组的方法，将片段连接到phells gate8载体上，构建了camv35s启动子超量表达载体icl-pro35s-oe，载体检测结果如图1。
[0081]
利用primer premier 5设计引物扩增候选基因全长orf和2kb启动子片段，在正向引物前加上重组序列(如seq id no.5所示)并加上saci的酶切位点，反向引物前加上重组序列(如seq id no.4所示)，并加上xbai的酶切位点，分别以ts158和ac材料gdna为模板，进行片段扩增，分别构建了ts158和ac(ts9)自启动超量表达载体icl-pro158-oe、icl-proac-oe，载体检测结果如图12。
[0082]
遗传转化：利用农杆菌介导的方法将上述载体进行遗传转化，具体转化步骤方法参见(欧阳波，2003，华中农业大学博士学位论文)。所用到的遗传转化受体材料有ts158和ac(从美国番茄遗传资源中心引进，并由华中农业大学番茄课题组保存)；对候选基因的序列进行分析，利用sgn网站分析基因序列结构。
[0083]
crispr敲除载体构建：对候选基因的序列进行分析，利用sgn 网站分析基因序列结构，利用crispr敲除引物设计网站 (http://crispr.dbcls.jp/？tdsourcetag＝s_pcqq_aiomsg)设计引物，以043 质粒(中国科学院遗传发育研究所馈赠)为模板进行片段扩增，获得一段680bp扩增片段，通过同源重组技术连接到ptx载体转入大肠杆菌trans t1中，菌液阳性检测后送天一辉远公司测序(图13)。将测序结果正确的载体质粒转入农杆菌菌株c58中。
[0084]
进一步对camv35s启动子超量转基因材料和ts158和ac(ts9) 自启动超量转基因材料中icl的表达量进行测定，结果如图14所示， icl-pro35s-oe-11-2，icl-pro35s-oe-18-7，icl-pro35s-oe-21-3转基因系的表达水平分别是26.6、23.2、39.3；icl-pro158-oe-2-2， icl-pro158-oe-3-7，icl-pro158-oe-5-7转基因系的表达水平分别是 10.1、6.3、5.2；icl-proac-oe-1-4、icl-proac-oe-3-2、 icl-proac-oe-11-9转基因系的表达水平分别为6.2、7.3、14.5。
[0085]
随后，本实施例还对转基因番茄叶片和红熟果实的抗坏血酸含量进行检测，结果如图15显示，超量转基因系叶片和红熟果实抗坏血酸含量显著增加。在叶片中，icl-pro35s-oe三个转基因株系抗坏血酸含量分别增加36％、17％、44％(图15a)，icl-pro158-oe三个转基因株系抗坏血酸含量分别增加了38％、16％、22％(图15b)；在果实中，icl-pro35s-oe两个转基因株系抗坏血酸含量分别增加32％、 24％(图15c)，icl-pro158-oe三个转基因株系抗坏血酸含量分别增加了35％、35％、30％(图15d)。
[0086]
对icl敲除的转基因材料叶片和果实的抗坏血酸含量进行测定，结果显示以ts158和ac为背景料进行crispr敲除的转基因材料抗坏血酸含量均降低。在叶片中，以ac材料为背景的转基因敲除系 icl-cr-10-2、icl-cr-14-6和icl-cr-16-5抗坏血酸含量分别减少 31％、24％、9％(图16a)，果实中抗坏血酸含量分别减少35％、21％、 32％(图16c)；而以ts158为背景的转基因敲除系icl-cr-6-1、 icl-cr-20-4、icl-cr-50-6叶片中抗坏血酸含量分别减少25％、38％、24％(图16b)，在果实中分别减少17％、26％、27％(图16d)。
[0087]
综合转基因材料中icl的表达量和抗坏血酸含量，本实施例发现用camv35s启动子超量转基因材料中icl的相对表达量均大于23， ts158自启动子超量转基因材料中icl的相对表达量仅有5倍以上，但是ts158自启动子超量材料中抗坏血酸的含量增加百分比略微高于camv35s启动子超量材料的抗坏血酸含量。尽管ts158中icl启动子的表达水平只有5倍，但是其抗坏血酸含量高于35s启动子驱动下的抗坏血酸含量，说明ts158启动子的驱动效率更高。同时以 ts158为背景的敲除转基因系中的抗坏血酸含量减少的百分比高于 ac为背景材料的敲除转基因系。由此表明高抗坏血酸材料ts158启动子的单倍型在自然群体中代表高抗坏血酸含量，可以利用这个单倍型的差异，设计标记，应用于分子育种筛选高抗坏血酸材料。
[0088]
实施例8、icl转基因系抗坏血酸途径代谢分析
[0089]
转录因子可以直接调控生物合成途径的基因来达到调控抗坏血酸含量的目的，而
icl是异柠檬酸裂解酶，其可能会影响抗坏血酸生物合成途径中的特定底物或中间产物。为分析icl对抗坏血酸生物合成途径的底物是否产生影响，本实施例进一步对转基因红熟番茄果实 (第二穗的红熟果实)进行gc-ms测定，对抗坏血酸合成中间代谢产物进行分析，gc-ms测定和代谢产物分析方法参照实施例1。
[0090]
如图17所示，以ts158为背景的两个敲除转基因系红熟果实中，与抗坏血酸合成相关的甘露糖、肌醇、半乳糖醛酸含量分别只有对照的15％-18％、61％-69％、90％-93％，而半乳糖含量是对照的1.4-2.1 倍，一些其他的底物如葡萄糖、蔗糖、柠檬酸含量分别是对照的 73％-95％、52％-58％、65％-75％，苹果酸含量增加1.3-1.5倍。
[0091]
如图18所示，在icl超量转基因材料种出现相反的结果，超量转基因红熟果实中与抗坏血酸相关的肌醇、半乳糖醛酸含量增加，而半乳糖含量减少，葡萄糖、蔗糖、柠檬酸含量增加，苹果酸含量减少。由此表明，slicl对抗坏血酸生物合成底物产生影响，可能催化特定步骤，影响中间产物含量，进而对抗坏血酸积累水平产生影响。
[0092]
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。