一种褐藻胶裂解酶ALyI1及其应用

一种褐藻胶裂解酶alyi1及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种褐藻胶裂解酶及其应用。


背景技术：

2.绿脓杆菌是一种革兰氏阴性细菌，可引起植物和动物的机会性感染。除了在住院患者中引起医院获得性肺炎和呼吸机相关性肺炎外，铜绿假单胞菌在呼吸系统受损的囊性纤维化患者中尤其严重。由于铜绿假单胞菌精细的适应机制，包括生物膜形成、对抗生素产生的抗性、基因组可塑性、超突变性以及在感染的不同阶段产生各种毒性阶段，因此在感染后从囊性纤维化患者的肺中根除铜绿假单胞菌非常困难。铜绿假单胞菌的生物膜包含胞外多糖、pel、psl和褐藻胶。pel由n-乙酰半乳糖胺和n-乙酰氨基葡萄糖组成。psl由半乳糖和甘露糖组成。
3.褐藻胶是一种线性酸性多糖，是褐藻(如褐藻科)细胞壁和细胞内物质的重要组成部分。在结构上，它由α-l-古洛糖醛酸盐(g)和β-d-甘露糖醛酸盐(m)组成，通过1，4-糖苷键连接，这两种糖单元可以按照三种模式进行组合:聚古洛糖醛酸(polyg)、聚甘露糖醛酸(polym)和杂聚物嵌段(poly mg)。
4.褐藻胶裂解酶具有多种来源，包括海洋和陆地细菌、真菌、病毒、褐藻、海洋软体动物和棘皮动物。在过去的几年里，已经鉴定了许多来自细菌的褐藻胶裂解酶。根据碳水化合物活性酶(cazy)数据库，已对14个多糖裂解酶(pl)家族(pl5、6、7、8、14、15、17、18、31、32、34、36、39和41)进行了分类，最大的褐藻胶裂解酶家族为pl7家族。
5.褐藻胶裂解酶是通过β-消除反应降解褐藻胶，产生不饱和产物的酶。按催化方式进行分类，褐藻胶裂解酶可分为内切型和外切型。褐藻胶裂解酶可用于研究褐藻胶的精细结构，生产特定长度的polym和polyg嵌段或褐藻胶寡糖，用于农业、生物技术和医学工业中的特定应用，以及生产用于生物燃料生产的单糖。褐藻胶裂解酶也被探索作为囊性纤维化的生物治疗剂，因为它们可以通过清除生物膜基质中的褐藻胶来增加抗生素的效率。
6.本研究从海洋细菌tamlanasp.i1中分离纯化了一种新的褐藻胶裂解酶。报道了其相关生化特性和对铜绿假单胞菌生物膜的作用能力。该酶具有良好的耐盐性。


技术实现要素：

7.一方面，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列与seqidno.2相比，具有至少95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
8.在一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶来源于海洋细菌tamlanasp.，例如，海洋细菌tamlanasp.i1。
9.在一个实施方式中，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列与seqidno.2相比具有至少99％的序列同一性，并且来源于海洋细菌tamlanasp.i1。
10.在优选的实施方式中，所述褐藻胶裂解酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
11.另一方面，本发明还提供了褐藻胶裂解酶的编码基因，优选的，所述基因的序列如
seq id no.1所示。
12.另一方面，本发明还提供了包含上述编码基因的重组载体，所述重组载体优选为重组表达载体，如pet系列的载体，例如pet-22b；又如，prsfduet-1载体。
13.另一方面，本发明还提供了包含上述重组载体的重组菌株，优选的，所述重组菌株为大肠杆菌，如，大肠杆菌bl21。
14.另一方面，本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在降解褐藻胶中的应用。
15.在一个实施方式中，所述褐藻胶包括海藻酸钠。
16.另一方面，本发明还提供了一种降解褐藻胶的方法，所述方法包括利用上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株对褐藻胶进行处理的步骤。
17.在一个实施方式中，所述处理的温度为30℃-60℃，如，35℃、40℃或50℃；ph为5-11，如，ph为6、7、8、8.6、9、10或11。
18.在一个实施方式中，所述处理的盐浓度为10mm-5000mm，例如，1000mm、2000mm、2500mm、3000mm或4000mm；优选的，所述盐浓度为nacl浓度。
19.另一方面，本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在抑制微生物生物膜中的用途。优选的，所述生物膜为微生物以褐藻胶为基质形成的生物膜。
20.另一方面，本发明还提供了一种抑制微生物生物膜的制剂，所述制剂包括上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株。
21.另一方面，本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在制备用于抑制微生物生物膜的制剂中的用途。
22.在一个实施方式中，所述微生物为铜绿假单胞菌。
23.另一方面，本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在抑制铜绿假单胞菌中的应用，或在制备用于抑制铜绿假单胞菌的制剂中的用途。
24.在一个实施方式中，本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株在制备用于治疗或缓解由铜绿假单胞菌引起的疾病的药物中的用途。
25.另一方面，本发明还提供了一种处理铜绿假单胞菌生物膜的方法，所述方法包括利用上述褐藻胶裂解酶、基因、载体或菌株对所述生物膜进行处理的步骤。
26.在一个实施方式中，所述处理的温度为30℃-60℃，如，35℃、40℃或50℃；ph为5-11，如，ph为6、7、8、8.6、9、10或11。
27.在一个实施方式中，所述处理的盐浓度为10mm-5000mm，例如，1000mm、2000mm、2500mm、3000mm或4000mm；优选的，所述盐浓度为nacl浓度。
附图说明
28.图1为ralyi1的表达、纯化。(a)褐藻胶裂解酶活性的检测。(1)纯化蛋白，(2)诱导组蛋白，(3)空载体对照，(4)非诱导对照；(b)重组ralyi1表达和纯化的sds-page分析。泳道m，蛋白质标记；泳道1，重组蛋白；泳道2，纯化的ralyi1。
29.图2为ralyi1的生化特征。(a)ralyi1在不同温度(4-70℃)下的相对活性。(b)ralyi1的热稳定性。(c)最佳反应ph(d)ph稳定性。(e)金属离子的影响。(f)nacl的影响。数据显示为平均值
±
标准偏差，n＝3。
30.图3为分析底物特异性和最终产物。(a)ralyi1的底物特异性。(b)tlc分析的最终产品。泳道1-3，纯化的单糖、二糖和三糖标准品；泳道4-6，褐藻胶、pm、pg的降解产物。(c)以褐藻胶为底物对酶水解产物进行24小时的esi-ms分析。dp2和dp3峰分别代表二糖和三糖。dp2二糖m/z375和dp3(三糖m/z 527 na -h：m/z 549)。
31.图4为褐藻胶裂解酶ralyi1对铜绿假单胞菌产生的生物膜的影响。(a)防止ralyi1的生物膜形成。(b)ralyi1的生物膜破坏活性。(c)结晶紫染色后抑制生物膜形成的空白对照。(d)结晶紫染色后ralyi1抑制生物膜形成。(e)结晶紫染色后破坏生物膜的空白对照。(f)结晶紫染色后ralyi1破坏生物膜。
具体实施方式
32.下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。
33.实施例1.材料和方法
34.1.1菌株、质粒和试剂
35.tamlanasp.i1是从威海金沙滩石鳖中分离并保存于本实验室的菌株，从菌株tamlanasp.i1克隆了alyi1基因。对ralyi1菌株的基因组dna进行测序，并存储到genbank数据库，genbank号为prgan656350。使用大肠杆菌dh5α和载体puc19(中国上海sangon biotech)进行基因克隆。使用大肠杆菌bl21(de3)(中国北京索拉博)和载体prsfduet-1(美国invitrogen)进行蛋白表达。大肠杆菌菌株均在luria-bertani(lb)培养基中生长。海藻酸钠(m/g比:1.66)，购自青岛明月海藻集团有限公司(中国青岛)。标准褐藻胶单糖、二糖、三糖、四糖苷、polyg(m/g比1.8/98.2，纯度:99％)和polym(m/g比97.3/2.7，纯度:99％)购自青岛bz oligo biotechnology ltd.(青岛，中国)。本研究中使用的其他化学品和试剂属于分析级。除非另有说明，否则其他试剂均为分析级或更高级别的试剂，且均为市售。
36.1.2 ralyi1的克隆、表达及纯化
37.使用分别含有bamh i和hind iii限制性位点(带下划线)的引物alyi1-f(5'-tactcaggatccgacacaatcgaag-3')和alyi1-r(5'-tactcaaagctttaaaaatgttccgtct-3')扩增褐藻胶裂解酶基因alyi1，所述基因的核酸序列如seq id no.1所示，所述基因编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。pcr片段经bamh i和hind iii消化后，将纯化片段克隆到prsfduet-1表达载体中，最终转化到大肠杆菌bl21(de3)中。携带prsfduet-1-alyi1的重组细胞在添加卡那霉素(50μg/ml)的luria-bertani培养基中于37℃和180rpm下生长，直至600nm处的od值达到0.6左右，然后在20℃和110rpm下用最终浓度为1mm的异丙基-1-硫代-β-d-半乳糖苷(iptg)诱导20h。然后，通过在4℃和8000rpm下离心10min收获细胞，再悬浮在50mm磷酸盐缓冲液(0以12,000rpm转速在4℃下离心10min两次后，将上清液加载到镍-次氮基三乙酸(ni-ida)亲和柱(sangon biotech，shanghai，china)上。收集纯化组分，使用经济型生物技术膜(sangon biotech，上海，中国)脱盐，并使用10％sds-page系统(bio-rad，hercules，ca，usa)进一步分析。蛋白marker购自takara(中国北京)。使用bradford法测定蛋白质浓度。(bradford 1976)以牛血清白蛋白(bsa)为对照品。
38.为了快速、灵敏地鉴定褐藻胶裂解酶的活性，改进了革兰氏染色法(sawant et al.2015)。含有1.0％褐藻胶的0.9％琼脂糖凝胶，在褐藻胶孵育3小时后用四倍稀释的革兰氏碘溶液染色。淹没琼脂糖凝胶后1-2min内，褐藻胶裂解酶周围的透明圈明显。
39.1.3 ralyi1纯度分析
40.对于预测蛋白的功能注释，在国家生物技术信息中心服务器(ncbi)上使用blast算法进行氨基酸序列的相似性搜索(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)。使用瑞士生物信息学研究所expasy服务器(http://swissmodel.expasy.org/)上的肽质量工具估计推定蛋白的分子量。使用计算pi工具(https://web.expasy.org/compute_pi/)计算alyi1的理论pi。通过signalp 5.0服务器(http://www.cbs.dtu.dk/services/signalpp/)预测了ralyi1的信号肽切割位点。使用dnaman版(lynnonbiosoft，san ramon，ca，usa)进行多序列比对。系统发育分析采用mega 7.0版(kumar et al.2016)。
41.1.4酶活测定
42.用3，5-二硝基水杨酸(dns)比色法测定褐藻胶裂解酶的活性(miller 1959)。一个单位(u)的酶活性定义为每分钟释放1mol还原糖所需的酶量。除非另有说明，否则在80μl缓冲液(20mm na2hpo
4-nah2po4，ph 8.0)、100μl褐藻胶底物(10mg/ml)和20μl酶提取物的混合物中于35℃下测定活性30min，平行做三个对照。然后，向溶液中加入300μl 3，5-二硝基水杨酸酯(dns)溶液。孵育后，将混合物煮沸5分钟以终止反应。最后，在540nm处测量吸光度。
43.1.5 ralyi1的特性描述
44.1.5.1温度对酶活性的影响
45.确定了褐藻胶裂解酶的最适温度为4-60℃。考察了褐藻胶裂解酶在4℃、10℃、20℃、25℃、37℃、40℃、45℃、50℃、60℃、70℃条件下培养1h的热稳定性。通过上述标准方法测定酶的残留活性。未经处理的酶活性定义为100％。
46.1.5.2 ph对酶活性的影响
47.通过在5.0
–
12.0的ph范围内测定酶活性，考察褐藻胶裂解酶的最佳ph。使用的缓冲体系为na2hpo
4-柠檬酸(ph 5.0
–
6.6)、na2hpo
4-nah2po4(ph6.6
–
7.6)、tris-hcl缓冲液(ph 7.6
–
8.6)和甘氨酸-naoh缓冲液(ph 8.6
–
12.0)。以0.5％(w/v)海藻酸钠为底物，在适宜的缓冲液中，于40℃反应30min。ph稳定性检测:将酶置于不同ph值(5.0-12.0)的缓冲液中，4℃放置1h，测定残余酶活。未经处理的酶活定义为100％。
48.1.5.3金属离子、氯化钠对酶活性的影响
49.通过添加最终浓度为1.0mm的各种金属离子(nacl、kcl、mgcl2、cacl2、nh4cl、nicl2、zncl2、srcl2、mncl2、fecl3和feso4)以及不同浓度的nacl(1、10、50、100、300、500、700、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500)测定金属离子对酶活性的影响向底物混合物中加入酶溶液引发反应，反应在40℃下进行30min。然后测定其残留活性。不添加金属离子的酶的活性定义为100％。
50.1.6 ralyi1的底物特异性、降解产物及动力学参数
51.在本研究中，使用1％(w/v)的底物溶液(20mm na2hpo 4-nah 2po 4，ph 8.0)和三种聚合物(海藻酸钠、polym和polyg)通过上述dns法测定酶活性，以评估ralyi1的优选底物。为了测定最终消化物的寡糖组成，向170μl底物溶液中加入30μl稀释酶(5m)，该溶液含有0.2％(w/v)底物、20mm na2hpo
4-nah2po4缓冲液和200mm nacl(ph 7.0)。35℃孵育0.5、
12h后，将反应缓冲液煮沸5min终止，用溶剂系统(1-丁醇/乙酸/水2:1:1)进行薄层色谱分析。薄层色谱板用硫酸/乙醇试剂(1:4，v/v)喷雾，85℃加热5min。
52.由于褐藻胶是由甘露糖醛酸和古洛糖醛酸残基的随机组合组成的聚合物，因此通过测量不同浓度(0.1-8.0mg/ml)底物下的酶活性，确定了纯化酶对褐藻胶和polym的动力学参数。由于两者的分子量(mw)相同，因此使用聚合物中糖醛酸的每种单体的mw(176g/mol)计算底物摩尔浓度。使用6150m-1
cm-1
的消光系数，通过监测235nm处吸光度的增加来测定产物浓度。在试验底物浓度下的速度(v)计算如下:v(mol/s)＝(milli au/min
×
min/60s
×
au/1000milliau
×
1cm)/(6150m-1
cm-1
)
×
(2
×
10-4
l)。如前所述，通过双曲线回归分析计算km和vmax值(swift et al.2014)。此外，通过vmax与酶浓度的比值([e])计算酶的周转数(kcat)。通过测量不同海藻酸钠浓度下酶活性的初始速度确定ralyi1对褐藻胶的动力学参数，并使用prism 6.0(graphpad software，inc.，la jolla，ca，usa)根据michaelis-menten方程的非线性回归拟合进行计算。
[0053]
1.7生物膜的形成与去除
[0054]
为检测酶对生物膜的作用效果，本研究以铜绿假单胞菌为模型菌。将菌株保存在含10％甘油的胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)中，温度为-20℃。在tsa上进行了37℃24h的预培养。将单个菌落在tsb 37℃过夜培养。对于生物膜分析，在37℃的tsb培养基中培养铜绿假单胞菌18h，并测量细菌悬液在od
600
处的吸光度。接下来，使用tsb培养基将细菌溶液稀释至0.2od
600
，并将100μl细菌溶液放入96孔板的孔中。此外，向上述孔中加入100μl pbs和纯化的褐藻胶裂解酶。培养72小时后，从孔中取出细菌悬液，并在pbs中适当洗涤三次。然后，加入100％甲醇固定生物膜。培养15min后，吸出甲醇，用无菌pbs洗涤3次。然后，在空气中生物膜变干后，向孔中加入200μl的1％结晶紫。染色30min后，使用pbs将孔洗3次。将生物膜风干后，加入200μl 33％乙酸，室温孵育30min，使染色生物膜溶解。最后，使用酶标仪读取600nm下的吸光度值(biotek instruments，winooski，vt，usa)。此外，为观察酶对铜绿假单胞菌形成的生物膜的降解作用，将细菌在37℃下培养72h，形成生物膜。然后，向孔中加入生物膜形成试验中使用的100μl pbs、100μl纯化的ralyi1，还是做三个平行对照，并在37℃下培养24h。以下操作与上述生物膜抑制试验中的操作相同。
[0055]
实施例2.结果和讨论
[0056]
2.1 aly1的序列分析
[0057]
海洋细菌tamlanasp.i1是从威海金沙滩石鳖中分离得到的。在褐藻胶单一碳源中生长迅速，高效降解褐藻胶，具有较高的褐藻胶裂解酶活性。基因alyi1的开放阅读框长度为897bp，编码298个氨基酸，包括signalp推测的信号肽序列。推导出的alyi1蛋白的理论等电点(pi)和理论分子量(mw)分别为4.55和32.15kda。所述裂解酶的核酸序列如seq id no.1所示，所述裂解酶的氨基酸序列如seqidno.2所示。
[0058]
blast处理的多序列比对显示，alyi1是pl7家族中一种新的褐藻胶裂解酶，与内切型双功能褐藻胶裂解酶sphingomonas sp.a1的alya1-ii具有最高同一性(30.0％)。根据cazy数据库，pl7家族有6个亚家族。
[0059]
2.2 ralyi1的表达、纯化和鉴定
[0060]
采用平板法和紫外吸收法检测ralyi1褐藻胶裂解酶活性。平板试验结果显示，革兰氏碘液染色后形成透明圈(图1a)，表示酶已成功实现外源表达，重组蛋白经证实具有褐
藻胶裂解酶活性。alyi1基因成功克隆，在大肠杆菌bl21(de3)中表达，并利用his-tag经nta-ni琼脂糖凝胶亲和层析纯化。sds-page分析结果显示，纯化后的蛋白以主带形式出现，与预测的32kda mw接近(图1b)。
[0061]
在4℃
–
70℃的温度范围内测定了ralyi1的最佳温度。如图2a所示，该酶的最佳温度为40℃，在50至60℃的温度范围内表现出超过40％的相对活性。在70℃时几乎没有活性。通过分别在25℃、30℃、35℃、40℃、45℃和50℃下培养该酶不同时间后测量残余活性，研究了ralyi1的热稳定性(图2b)。在4-40℃下培养1h后，褐藻胶裂解酶相对稳定。在较高温度下培养会导致酶活性丧失。在45℃培养0.5h和1h后，该酶分别保持了51％和16％的残留活性。在50℃下30min几乎无活性。这些结果表明，该酶具有相对窄的热稳定性范围。
[0062]
在4℃的不同ph值下考察了ralyi1的最佳ph值。如图2c所示，在ph8.6时酶的活性最高，但图中突出的是，在na2hpo4–
柠檬酸(ph 5.0
–
6.6)、na2hpo4–
nah2po4(ph 6.6
–
7.6)、tris-hcl(ph 7.6
–
8.6)或甘氨酸-naoh(ph8.0
–
11.0)中酶的活性保持不变，且几乎所有活性都得以保留。在ph 12.0时未检测到酶活性。在ph 11.0时，该酶仍具有51％的相对活性。褐藻胶裂解酶在一系列不同ph值(5.0-11.0)的缓冲液中于4℃孵育1h后，通过测定残留活性测定其ph稳定性(图2d)。结果表明，ralyi1在6.0
–
8.0的宽ph范围内保持稳定，保留了70％以上的原始活性。在ph5.0和11.0条件下，其残留活性分别维持在42％和51％。
[0063]
使用最终浓度为1mm的各种金属离子(na

、k

、mg
2
、ca
2
、mn
2
、ni
2
、zn
2
、sr
2
、fe
3
、fe
2
和nh
4
)考察了金属离子对褐藻胶裂解酶活性的影响(图2e)。k

、ca
2
、fe
3
、fe
2
、nh
4
对该酶有抑制作用，其中ca
2
的作用最为突出。酶活性不受fe
2
的影响。1mm na

刺激褐藻胶裂解酶活性。进一步研究了不同浓度na

的影响(图2f)。使用1500mm nacl时，ralyi1的活性达到最大值，在3000至5000mm的nacl添加量范围内，酶活性没有出现显著变化。虽然在加入5000mm nacl之前酶活性迅速下降，但在ralyi1中仍保持一定的酶活性。结果表明，在1500mm nacl存在下观察到最高活性(相对活性的239％)。因此，ralyi1可在较宽的nacl浓度范围内保持稳定，这可能是由于最初来源于海洋环境所致。
[0064]
2.3分析底物特异性和最终产物
[0065]
通过测量不饱和糖醛酸的od
235
值来研究底物特异性，其中不饱和糖醛酸是通过使用褐藻胶、polyg和polym作为底物，经α-消除反应生成的低聚物。如图3a所示，ralyi1褐藻胶裂解酶对褐藻胶、polyg和polym表现出活性，并且优先降解褐藻胶而不是pm和pg。
[0066]
为了研究ralyi1的最终产物，采用薄层色谱(tlc)分析方法分析了褐藻胶、polym和polyg在24小时后的降解产物。薄层色谱结果显示，二糖、三糖是polym和褐藻胶的主要降解产物(图3b)。此外，通过esi-ms监测褐藻胶最终解聚产物的鉴定，也检测到二糖、三糖(图3c)。该结果与薄层色谱分析一致。单体产物的缺乏表明ralyi1对褐藻胶、polyg和polym有内切作用。
[0067]
以不同浓度(0.1-8mg/ml)的海藻酸钠为底物，采用lineweaver-bulk图计算ralyi1的动力学参数值。海藻酸钠中的km(mg/ml)和vmax(s-1
)值分别为1.23和4.14。反应常数kcat(s-1
)和催化效率常数kcat/km(mg-1
ml s-1
)分别为221.78和180.31。以褐藻胶为底物，褐藻胶裂解酶ralyi1的酶活为1298.68u/mg。
[0068]
2.4褐藻胶裂解酶ralyi1对铜绿假单胞菌生物膜的影响
[0069]
本研究采用具有较高酶活力的褐藻胶裂解酶ralyi1探究其对铜绿假单胞菌生物
膜的影响。纯化的ralyi1和其他对照组分在96孔板中与细菌共孵育36h，通过结晶紫染色法以进一步观察褐藻胶裂解酶ralyi1是否会影响铜绿假单胞菌的生物膜形成。结果表明，与pbs和变性ralyi1相比，ralyi1会抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。如图4a所示，值得注意的是，在所培养的温度下，相对于生物膜的形成，ralyi1表现出最高的抑制活性。铜绿假单胞菌的生物膜形成减少50.53％
±
3.52％。此外，还利用荧光倒置显微镜观察了酶ralyi1与铜绿假单胞菌生物膜之间的相互作用(图4c，4d)。另外，与对照相比，等量的灭活酶未表现出显著的抑制作用，表明具有较高酶活性的ralyi1在抑制铜绿假单胞菌生物膜形成中起着重要作用。如前所述，细菌生物膜的组成及其外部基质可能是抑制生物膜形成的原因。褐藻胶裂解酶能够高效降解作为基质核心成分的褐藻胶，减少生物膜的形成。
[0070]
为评价ralyi1是否具有根除铜绿假单胞菌形成的生物膜的能力，分别将褐藻胶裂解酶组和对照组与培养48h的铜绿假单胞菌形成的生物膜一起培养。结果(图4b)表明，ralyi1经结晶紫染色后生物膜降解较多，铜绿假单胞菌降解率约为44.98％
±
6.72％。此外，还利用荧光倒置显微镜密切观察了酶ralyi1与铜绿假单胞菌生物膜之间的相互作用(图4e、4f)。
[0071]
上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。