一种快速检测IDH1突变的引物组、试剂盒及扩增方法和应用与流程

一种快速检测idh1突变的引物组、试剂盒及扩增方法和应用
技术领域
1.本技术涉及基因检测领域，尤其涉及一种快速检测idh1突变的引物组、试剂盒及扩增方法和应用。


背景技术：

2.人类idh基因有三种类型，分别为idh1、idh2和idh3，但仅idh1定位与细胞质和过氧化物酶体中发挥主要作用，idh2和idh3定位与线粒体中，因idh1基因所编码的蛋白名为人异柠檬酸脱氢酶（idh1），该类蛋白酶可以将异柠檬酸氧化为草酰琥珀酸，然后再转化为α-酮戊二酸。目前大量研究发现idh1的突变与多种肿瘤密切相关，如肝内胆管癌、软骨肉瘤、甲状腺癌、前列腺癌、副神经节瘤、急性髓细胞性白血病和脑胶质瘤等，其致瘤机制为突变的idh1能将α-酮戊二酸转化为2-羟戊二酸，然后在细胞内积累，后者可以抑制前者的靶点，导致这些靶点表达异常从而引发癌症。
3.idh1/2基因突变主要发生在低级别胶质瘤细胞中，约60%～80%的ⅱ级和ⅲ级胶质瘤以及高达90%继发性胶质母细胞瘤存在有idh基因突变，在胶质瘤中，idh1突变频率远高于idh2的突变频率，超过 90% 的 idh 基因突变为 idh1 突变，而在idh1突变中几乎所有类型均为r132位点（包括r132h、r132c、r132l、r132s、r132g等），除此之外idh1/2而idh1最主要的突变类型为r132h突变，占全部突变类型的80%以上，是最关键的idh突变位点，也是多种肿瘤的重要分型标记物。
4.目前肿瘤等疾病相关突变位点的基因检测是通过血液、体液或组织细胞对dna进行检测的技术，随着基因测序技术发展，临床上基因突变检测的金标准是二代测序法，此方法的优点是实验方法简单，结果直观可靠，成本较低，但该技术检测灵敏度较不高，且检测周期较长，通常从临床样本获取到检测报告回复至少需要1-2周时间；而随着荧光定量pcr 技术的发展，出现了越来越多的基于pcr的基因检测试剂盒产品，相比二代测序法，荧光pcr技术仅需2小时即可得到检测结果，灵敏度高，具有明显的优势。
5.由于现阶段的荧光定量pcr检测需要采用在专业仪器上进行，而目前针对idh1 r132的突变位点的检测，大部分是针对某一类或某几种突变进行检测，因此需要多次的荧光定量pcr检测才能得到整个idh1 r132的突变位点信息，而对idh1 r132所有突变位点的检测需要在多个设备上和专门的检测人员进行检测，操作较为繁琐，难以在临床上应用；因此如何能全面检测idh1 r132所有的突变位点，以实现在临床上检测idh1 r132所有的突变位点，是目前亟需解决的技术问题。


技术实现要素：

6.本技术提供了一种快速检测idh1突变的引物组、试剂盒及扩增方法和应用，以解决现有技术中荧光定量pcr检测难以全面检测idh1 r132所有的突变位点的技术问题。
7.第一方面，本技术提供了一种快速检测idh1突变的引物组，所述引物组包括idh1基因组引物，所述idh1基因组引物包括idh1 r132h基因突变型探针、idh1 r132l基因突变
型探针、idh1 r132c基因突变型探针、idh1 r132g基因突变型探针和idh1 r132s基因突变型探针，所述idh1 r132h基因突变型探针的序列如seq id no.3所示，所述idh1 r132l基因突变型探针的序列如seq id no.4所示，所述idh1 r132c基因突变型探针的序列如seq id no.5所示，所述idh1 r132g基因突变型探针的序列如seq id no.6所示，所述idh1 r132s基因突变型探针的序列如seq id no.7所示。
8.可选的，所述idh1基因组引物还包括idh1基因上游引物和idh1基因下游引物，所述idh1基因上游引物的序列如seq id no.1所示，所述idh1基因下游引物的序列如seq id no.2所示。
9.可选的，所述引物组还包括内标基因组引物，所述内标基因组引物包括内标基因上游引物、内标基因下游引物和内标基因探针，所述内标基因上游引物的序列如seq id no.8所示，所述内标基因下游引物的序列如seq id no.9所示，所述内标基因探针的序列如seq id no.10所示。
10.可选的，所述idh1 r132h基因突变型探针、所述idh1 r132l基因突变型探针、所述idh1 r132c基因突变型探针、所述idh1 r132g基因突变型探针和所述idh1 r132s基因突变型探针的3'端都设有淬灭基团，所述淬灭基团包括tamra、bhq或mgb。
11.第二方面，本技术提供了一种快速检测idh1突变的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的引物组。
12.可选的，所述试剂盒为gbs核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括：卡盒体，所述卡盒体设于所述试剂盒内，所述卡盒体设有分隔区和阻断柱，所述分隔区包括裂解区、清洗区和扩增反应区，所述裂解区的出料口连通所述清洗区，所述清洗区的进料口连通所述扩增反应区，所述裂解区、所述清洗区和所述扩增反应区之间分别通过所述阻断柱分隔开，所述阻断柱内设有纵向通道，以实现对分隔区的封锁；所述扩增反应区用于承载扩增反应液，所述扩增反应液含有所述引物组。
13.可选的，所述gbs核酸检测试剂盒还包括：加样口，所述加样口设于所述试剂盒的顶部；卡盒盖，所述卡盒盖设于所述试剂盒的顶部，用于实现对加样口的单向封闭，所述卡盒盖和所述加样口之间设有封口膜。
14.第三方面，本技术提供了一种快速检测idh1突变的扩增方法，所述扩增方法在的第二方面所述的试剂盒中进行，所述扩增方法包括：提取预设重量的离体胶质瘤组织样品；对所述胶质瘤组织样品进行前处理，得到含目的基因的样品浆液；向所述试剂盒中加入所述样品浆液和磁珠溶液，后进行pcr扩增反应，得到纯化的扩增产物；其中，所述预设重量为2.5mg～5.0mg。
15.可选的，所述样品溶液和所述磁珠溶液的体积之比为19:1～20:1。
16.第四方面，本技术提供了一种快速检测idh1突变的引物组的应用，将第一方面所述的引物组用于制备临床快速检测idh1突变位点的检测试剂中。
17.本技术实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：本技术实施例提供的一种快速检测idh1突变的引物组，分别针对idh1 r132h基因
突变型、idh1 r132l基因突变型、idh1 r132c基因突变型、idh1 r132g基因突变型和idh1 r132s基因突变型设计对应的基因探针，能涵盖目前大部分的idh1 r132基因突变点位，进而在同个试剂盒中，采用设计的基因探针能在一轮核酸检测中检测出idh1 r132位点的所有突变类型，避免了需要多轮荧光定量pcr检测才能检出所有的突变类型，从而实现对所有突变类型的全面检测，进而能实现在临床上全面检测idh1 r132位点的所有突变类型。
附图说明
18.此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
19.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
20.图1为本技术实施例提供的方法的流程示意图；图2为本技术实施例提供的试剂盒的结构示意图；图3为本技术实施例提供的idh1 r132l基因突变型为阳性的实时荧光pcr曲线图；图4为本技术实施例提供的idh1 r132（除外r132h）基因突变型为阳性的实时荧光pcr曲线图；图5为本技术实施例提供的idh1 r132h基因突变型为阳性的实时荧光pcr曲线图；图6为本技术实施例提供的idh1 r132野生型的实时荧光pcr曲线图；其中，1-卡盒体，11-裂解区，12-清洗区，13-扩增反应区，14-阻断柱，2-加样口，3-卡盒盖，4-封口膜。
具体实施方式
21.下面将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
22.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
23.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
24.本技术的创造性思维为：由于在许多对胶质瘤诊断和预后起关键作用的分子标志物中，异柠檬酸脱氢酶（idh）的突变状态至关重要，尤其对于低级别胶质瘤；许多研究表明，如果胶质瘤中存在idh1/2基因突变，则提示该胶质瘤患者的预后较好，对化疗/放疗的反应也会更好。目前已经证实了，idh突变状态对于胶质瘤患者的预后有着重要的提示作用，尽管神经胶质瘤的切除标准为最大限度的安全切除，但并没有明确证据表明对于idh野生型的高级别胶质瘤行近全切除、全切除、超全切除在生存预后上有明显的差异，但对于idh突变型的患者，切除范围很大程度上影响患者的复发和总生存时间，因此如果能够在术中快速明确胶质瘤患者的idh突变状态，对于术者手术策略的选择有着重要意义，尤其是位于功
能区的部分，可以根据idh突变状态判断是否进行扩大切除，从而在生存质量和生存时间上进行最优化选择。
25.因此，围绕idh的临床诊断和临床治疗迅猛突破，在大多数成人aml研究中，idh1的突变频率约为5.5%～10.4%，针对idh突变的靶向治疗在aml中的潜在效果已在多项体外及体内的临床前研究中得到证实，idh1的抑制剂在一些小鼠模型中取得了较好的临床前结果，目前已在开发针对idh1突变的aml治疗的一些小分子药物，如针对idh1突变的口服靶向抑制剂 lvosidenib(ag-120) 用于治疗idh1基因突变的复发或难治性aml的新药已通过fda审批，此外，idh1/2还被写入中枢神经系统肿瘤分类指南，成为了脑肿瘤诊断的金标准之一。
26.而采用荧光pcr技术对肿瘤等疾病进行基因检测，传统的步骤是基于患者肿瘤组织标本进行采集、裂解细胞、提取dna、并进行dna扩增后，利用特异性引物，通过pcr仪等特定设备对其含量进行定量检测，从而获取患者组织标本中是否含有目标基因突变，从而达到诊断肿瘤及其具体亚型的目的。
27.而目前主流荧光pcr技术用的试剂盒通常需要针对肿瘤组织细胞进行人工裂解、清洗、核酸提取、扩增等多个复杂步骤，需要多种试剂、设备和器材顺序配合完成，再利用荧光pcr引物探针等进行光学检测，并依赖于实时定量荧光pcr仪进行检测；整个过程需要专业技术人员操作，且检测较为麻烦，而且在不同步骤间常需要在不同设备之间转移样品，极易产生核酸污染和人工操作误差，十分影响检测精度，且pcr相关设备和pcr实验室建设成本高，占地面积大，维护运营复杂，在临床上推广难度极高，现多由第三方专业检测机构和公司实现检测。
28.本发明实施例提供的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：在本技术的一个实施例中，提供一种快速检测idh1突变的引物组，所述引物组包括idh1基因组引物，所述idh1基因组引物包括idh1 r132h基因突变型探针、idh1 r132l基因突变型探针、idh1 r132c基因突变型探针、idh1 r132g基因突变型探针和idh1 r132s基因突变型探针，所述idh1 r132h基因突变型探针的序列如seq id no.3所示，所述idh1 r132l基因突变型探针的序列如seq id no.4所示，所述idh1 r132c基因突变型探针的序列如seq id no.5所示，所述idh1 r132g基因突变型探针的序列如seq id no.6所示，所述idh1 r132s基因突变型探针的序列如seq id no.7所示。
29.在一些可选的实施方式中，所述idh1基因组引物还包括idh1基因上游引物和idh1基因下游引物，所述idh1基因上游引物的序列如seq id no.1所示，所述idh1基因下游引物的序列如seq id no.2所示。
30.本技术实施例中，通过在上述的多组基因探针的基础上，进一步对idh1基因上游引物和idh1基因下游引物的序列进行设计，保证对idh1基因的扩增充分，从而保证有足够的目的基因能进行基因检测。
31.在一些可选的实施方式中，所述引物组还包括内标基因组引物，所述内标基因组引物包括内标基因上游引物、内标基因下游引物和内标基因探针，所述内标基因上游引物的序列如seq id no.8所示，所述内标基因下游引物的序列如seq id no.9所示，所述内标基因探针的序列如seq id no.10所示。
32.本技术实施例中，通过设计内标基因，能有效的质控采样含量、核酸提取、核酸扩
增过程，提高检测的准确率。
33.在一些可选的实施方式中，所述idh1 r132h基因突变型探针、所述idh1 r132l基因突变型探针、所述idh1 r132c基因突变型探针、所述idh1 r132g基因突变型探针和所述idh1 r132s基因突变型探针的3'端都设有淬灭基团，所述淬灭基团包括tamra、bhq或mgb，所述淬灭基团可以是tamra，可以是bhq，也可以是mgb。
34.本技术实施例中，由于需要利用荧光pcr技术进行检测，因此需要淬灭基团保证检测的准确性，而限定淬灭基团的种类，能有效的保证荧光pcr技术的准确检测。
35.在本技术的一个实施例中，提供一种快速检测idh1突变的试剂盒，所述试剂盒包括第所述引物组。
36.在一些可选的实施方式中，如图2所示，所述试剂盒为gbs核酸检测试剂盒，所述试剂盒包括：卡盒体1，所述卡盒体1设于所述试剂盒内，所述卡盒体1设有分隔区和阻断柱14，所述分隔区包括裂解区11、清洗区12和扩增反应区13，所述裂解区11的出料口连通所述清洗区12，所述清洗区12的进料口连通所述扩增反应区13，所述裂解区11、所述清洗区12和所述扩增反应区13之间分别通过所述阻断柱14分隔开，所述阻断柱14内设有纵向通道，以实现对分隔区的封锁；所述扩增反应区13用于承载扩增反应液，所述扩增反应液含有所述引物组。
37.本技术实施例中，通过限定试剂盒的种类，以及对应的引物组所分布的区域，能将肿瘤组织裂解、核酸提取、核酸纯化、dna扩增、荧光pcr检测全流程进行自动化和封闭化整合，实现床旁快速基因检测，仅通过一个试剂盒就能全面对idh1 r132位点的所有突变类型进行检测。
38.在一些可选的实施方式中，所述gbs核酸检测试剂盒还包括：加样口2，所述加样口2设于所述试剂盒的顶部；卡盒盖3，所述卡盒盖3设于所述试剂盒的顶部，用于实现对加样口2的单向封闭，所述卡盒盖3和所述加样口2之间设有封口膜4。
39.本技术实施例中，限定加样口2和卡盒盖3及两者之间的封口膜4，能保证锁死后无法再自行开启，避免后续污染和干扰，从而保证试剂盒的良好密闭性，提高检测的准确率。
40.在本技术的一个实施例中，如图1所示，提供一种快速检测idh1突变的扩增方法，所述扩增方法在的所述试剂盒中进行，所述扩增方法包括：s1.提取预设重量的离体胶质瘤组织样品；s2.对所述胶质瘤组织样品进行前处理，得到含目的基因的样品浆液；s3.向所述试剂盒中加入所述样品浆液和磁珠溶液，后进行pcr扩增反应，得到纯化的扩增产物；其中，所述预设重量为2.5mg～5.0mg。
41.本技术实施例中，预设重量为2.5mg～5.0mg的积极效果是在该重量范围内，能保证样本足够，同时能保证检测结果的准确性；当预设重量的取值大于该范围的端点最大值，说明样本过量，导致原料浪费，当预设重量的取值小于该范围的端点最小值，说明样本量不足，影响最终检测的准确性。
42.在一些可选的实施方式中，所述样品溶液和所述磁珠溶液的体积之比为19:1～
20:1。
43.本技术实施例中，通过限定样品溶液和磁珠溶液的体积之比为19:1～20:1的积极效果是在该体积比的范围内，能保证磁珠对扩增产物的吸附充分，将扩增产物进行纯化，从而保证最终得到的扩增产物的高纯度，保证最终检测的准确性。
44.在本技术的一个实施例中，提供一种快速检测idh1突变的引物组的应用，将所述引物组用于制备临床快速检测idh1突变位点的检测试剂中。
45.实施例1一种快速检测idh1突变的引物组，引物组包括idh1基因组引物，idh1基因组引物包括idh1 r132h基因突变型探针、idh1 r132l基因突变型探针、idh1 r132c基因突变型探针、idh1 r132g基因突变型探针和idh1 r132s基因突变型探针。
46.idh1基因组引物还包括idh1基因上游引物和idh1基因下游引物。
47.引物组还包括内标基因组引物，内标基因组引物包括内标基因上游引物、内标基因下游引物和内标基因探针。
48.具体序列如表1所示。
49.表1idh1 r132h基因突变型探针、idh1 r132l基因突变型探针、idh1 r132c基因突变型探针、idh1 r132g基因突变型探针和idh1 r132s基因突变型探针的3’端都设有淬灭基团，淬灭基团为mgb。
50.实施例2将实施例2和实施例1进行对比，实施例2和实施例1的区别在于：
还提供一种快速检测idh1突变的试剂盒，包括引物组。
51.试剂盒为gbs核酸检测试剂盒，试剂盒包括：卡盒体1，卡盒体1设于试剂盒内，卡盒体1设有分隔区和阻断柱14，分隔区包括裂解区11、清洗区12和扩增反应区13，裂解区11的出料口连通清洗区12，清洗区12的进料口连通扩增反应区13，裂解区11、清洗区12和扩增反应区13之间分别通过阻断柱14分隔开，阻断柱14内设有纵向通道，以实现对分隔区的封锁；扩增反应区13用于承载扩增反应液，扩增反应液含有引物组。
52.gbs核酸检测试剂盒还包括：加样口2，加样口2设于试剂盒的顶部；卡盒盖3，卡盒盖3设于试剂盒的顶部，用于实现对加样口2的单向封闭，卡盒盖3和加样口2之间设有封口膜4。
53.实施例3将实施例3和实施例2进行对比，实施例3和实施例2的区别在于：还提供一种快速检测idh1突变的扩增方法，所述扩增方法在的第二方面所述的试剂盒中进行，包括：s1.提取离体的胶质瘤组织样品；s2.对所述胶质瘤组织样品用geneready动物样本前处理试剂盒（kt01-200/kt01-400）和生物样品低温快速制备离心系统（bsh-cl2）进行匀浆前处理，得到含目的基因的样品浆液；其中，均浆前处理的温度为8℃，匀浆前处理的循环数为1次，匀浆前处理包括振荡前处理和离心前处理，所述离心前处理的离心时间为3min，所述振荡前处理的震荡时间为45s/次，所述离心前处理的转速为6000rpm；s3.打开试剂盒的盖子，再打开封口膜，加入10μl的磁珠（使用前请振荡使之充分悬浮），再加入200μl样本，用移液器分吹打试剂混匀（建议至少吹打15次），后盖紧盖子，后进行pcr扩增反应，得到纯化的扩增产物；其中，pcr扩增反应程序如表2所示。
54.表2为了更好的确定上述扩增方法对检测的影响，在上述方法的基础上，进一步提供一种快速检测idh1突变的检测方法：s4.应用全自动核酸检测荧光定量pcr仪life ready k1000，利用pcr仪所自带的全自动核酸检测分析系统对pcr扩增产物进行分析，得到扩增曲线和tm值，综合扩增曲线与tm值判定idh1突变型基因的突变位点；其中，pcr仪的荧光通道如表3所示。
55.表3
全自动核酸检测荧光定量pcr仪life ready k1000的工作原理为：全自动核酸检测分析系统（lifeready 1000）预期与适配试剂配合使用，根据设定的运行参数，在控制系统的作用下通过热循环部件为核酸在体外进行rna逆转录以及变性、退火、延伸循环扩增及熔解提供所需的温度环境，利用光电部件实时转换扩增过程中产生的荧光信号，应用软件对荧光信号进行采集、存储和分析处理，用于对样本中特定靶基因或核酸序列进行扩增和分析。配套的试剂盒，上部区域实现组织裂解，中部及下部区域实现核酸提取、核酸纯化，底部区域实现扩增检测。
56.实施例4将实施例4和实施例3进行对比，实施例4和实施例3的区别在于：为了进一步明确胶质瘤组织样品的取样量和检测时间的关系，本技术在上述检测方法的基础上，还提供了验证试验：选择了两组胶质瘤样本，样本组a为idh突变型，样本组b为idh野生型。
57.在第一组试验中将每组样本分为2.5mg、5mg、7.5mg和10mg四个亚组，待匀浆前处理后每个亚组取上清液200μl上机检测，结果如表4所示。
58.表4在第二组试验中将每组样本同样划分为4个亚组，每个亚组各取5mg，但上机检测的上清液的体积则按照200μl、100μl、50μl、25μl的方式进行梯度递减，结果如表5所示。
59.表5
由表4和表5可知：将两组实验结果综合分析可以得出，在仪器默认的35个固定循环内，既要保证结果的准确性，又要避免浪费样本，因此最佳的取样量为2.5mg～5mg，此时循环阈值（ct）在22～25之间。
60.实施例5将实施例5和实施例4进行对比，实施例5和实施例4的区别在于：在确定了最佳取样量后，采用试剂盒、扩增方法和检测方法进行随机检测，以105例胶质瘤患者的肿瘤样本为待测样品，以二代测序技术（ngs）作为检测金标准，并且与免疫组化技术相对比，结果如表6和表7所示。
61.表6表7检测过程中，针对不同的idh1 r132位点的突变型，结果如图3-6所示。
62.图中，ct阈值的确定是根据扩增反应过程中荧光采集的情况给出一条扩增曲线（荧光曲线），同时设置一条水平线（阈值线），将阈值线拉至荧光曲线拐点处，两线交叉处的循化数即为ct值。
63.并且数据读取需满足：若idh1（除外r132h）基因的fam结果应呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台期的s曲线）和idh1 r132h基因的rox结果应呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台期的s曲线），满足上述两个条件则待测样本目的基因有idh1 r132l基因突变若仅有idh1（除外r132h）基因的fam结果应呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台
期的s曲线），则判为待测样本目的基因idh1 r132基因中有突变（不包含r132h突变，可以是idh1 r132l突变型基因、idh1 r132c突变型基因、idh1 r132g突变型基因和idh1 r132s突变型基因）。
64.若仅有idh1 r132h基因rox结果应呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台期的s曲线），则判为待测样本目的基因有idh1 r132h基因突变。
65.若仅有内部质控的cy5荧光通道检测结果应呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台期的s曲线），则判定为未检测到目的基因。
66.以上无论何种情况内部质控的cy5均呈现典型s型扩增曲线（包括未到平台期的s曲线）；若fam、rox、cy5均呈现阴性时，则表明卡盒试剂失效或故障，样本需要重新取样后检测。
67.由表6和表7，结合图3至图6可知：本发明的试剂盒的检测灵敏度（阳性符合率）为93.5%，特异度（阴性符合率）为98.3%，阳性预测值为97.7%，总符合率达到96.2%，而除外idh2基因突变病例，试剂盒在检测idh1 r132位点突变的准确率为100%。
68.本技术实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：（1）本技术实施例提供的引物组，分别针对idh1 r132h基因突变型、idh1 r132l基因突变型、idh1 r132c基因突变型、idh1 r132g基因突变型和idh1 r132s基因突变型设计对应的基因探针，从而在同个试剂盒中经过一轮检测就能将idh1 r132位点的所有突变类型检出。
69.（2）本技术实施例提供的试剂盒，能够基于多腔室微流控技术，将肿瘤组织裂解、核酸提取、核酸纯化、dna扩增、荧光pcr检测全流程进行自动化和封闭化整合，实现床旁快速基因检测，并且无需专业操作人员，仅仅需要医务工作者加样就可完成，方便操作。
70.（3）本技术实施例提供的试剂盒，能同时完成整个idh1 r132位点所有突变类型的核酸检测的工序，不依赖传统pcr的各种大量仪器设备，还能避免污染和人工操作误差，显著提升检测精度和效率。
71.（4）本技术实施例提供的试剂盒，可配合aigs实时荧光pcr仪，在1h内完成胶质瘤中idh1基因突变型的检测和确定，极大的缩短了检测所需的时间。
72.（5）本技术实施例提供的扩增方法，通过明确样品的预设重量范围，能进一步配合试剂盒，加快扩增反应的进行。
73.需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
74.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个
新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
75.以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。