多肽受体PSKR1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用

thermotolerance in tomato”,genes and development,2002,16:1555-1567)。番茄hsfa1a，hsfa2与hsfb1所形成的三聚体可以通过与分子伴侣的互作提高对热胁迫不同阶段的响应(scharf等,“the plant heat stress transcription fator(hsf)family:structure,function and evolution”，biophysica acta，2012，1819：104-119.)。番茄花药中slhsfa2在花粉形成过程中表达上调，从而缓解花粉对热胁迫的敏感性(fragkostefanakis等,“hsfa2 controls the activity of developmentally and stress-regulated heat stress protection mechanisms in tomato male reproductive tissues”，plant physiology，2016，170：2461-1477.)。由此可知，植物hsf基因是调控多种逆境响应基因表达的重要转录因子，在多种非生物逆境抗性和植物的生长发育中发挥重要的作用。
5.近年来，生物技术发展日新月异，dna重组技术的建立尤其是基因过表达技术的应用，能够最大程度发挥基因的作用，为解决人类面临的环境恶化、资源匮乏等问题储备更多抗性种质资源。
6.公开号为cn108841841a的中国专利文献公开了一种番茄转录因子slbzip6的克隆及其在抗高温胁迫中的应用，结果证实slbzip6参与了番茄的耐热性调控机制，且超表达slbzip6番茄耐热性比野生型更差。检测该基因表达水平，用于番茄耐热育种筛选。


技术实现要素：

7.本发明通过实验发现，多肽受体pskr1基因能够通过与热激转录因子hsfa1a互作调控番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境的抗性，缓解由于高温引起的植株叶片卷曲、光合损伤、花粉败育等。
8.基于以上发现，本发明提供了pskr1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用，以期为培育抗高温番茄品种提供依据。
9.具体采用的技术方案如下：
10.pskr1基因在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用，所述pskr1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示。
11.发明人通过实验发现，pskr1基因能够与热激转录因子hsfa1a互作，热激转录因子能够增强植株和花粉的对高温逆境的抗性，因此pskr1基因能够与hsfa1a互作调控番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境的抗性，热激转录因子hsfa1a的编码区序列如seq id no.5所示。
12.pskr1基因位于番茄的1号染色体上，其蛋白编码区长度为2904bp，pskr1基因编码一种跨膜蛋白，该蛋白由967个氨基酸组成。
13.本发明还提供了pskr1基因编码的蛋白在提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。
14.本发明还提供了一种提高番茄植株和/或番茄花粉对高温逆境抗性的方法，在番茄植株中过表达pskr1基因，所述pskr1基因的蛋白编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示。
15.具体包括以下步骤：
16.(1)构建过表达pskr1基因的载体；
his-ade表示缺少trp、leu、his和ade四种氨基酸的酵母固体培养基；若酵母在缺少氨基酸的酵母培养基上生长，则说明两个蛋白之间存在互作。
具体实施方式
32.下面结合附图与实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
33.实施例1
34.pskr1基因过表达载体与番茄植株的构建与鉴定
35.根据番茄基因组数据库(https://solgenomics.net/)获得pskr1基因(solyc01g008140)的编码序列，蛋白编码区的核苷酸序列如seq id no.1所示，pskr1基因编码的蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示。参考gateway手册，利用primer5软件设计上游引物(seq id no.3)：5’》ttggcgcgccatggtgatttgggagtttct》3’和下游引物(seq id no.4)5’》cggggtacccctctcctttacacttgcgattg》3’。
36.提取番茄叶片的rna，通过反转录得到cdna，以cdna为模板，利用上游引物和下游引物pcr扩增番茄pskr1基因编码区全长，扩增产物酶切转化后连接到具有35s启动子的表达载体pfgc1008-3ha上，该表达载体pfgc1008-3ha具体为：在过表达载体pfgc1008中加入了3个ha标签蛋白，ha标签蛋白为植物可选择性标记，以便于对转基因番茄植株进行鉴定及筛选。重组质粒构建成功后，再通过电击转化至根癌农杆菌gv3101菌株中，接着用转化的农杆菌侵染番茄子叶，进行组织培养，筛选获得oe:pskr1 t0代植株，取嫩叶叶片提取蛋白后进行western blot验证，具有目的条带的t0代株系用于连续繁种筛选，并获得两个纯合的t2代株系oe:pskr1-1和oe:pskr1-2(如图1所示)。
37.实施例2
38.pskr1基因过表达植株的高温逆境抗性研究
39.将3-4周大小的番茄幼苗放入人工气候培养箱，12小时光照12小时黑暗，光强200μmol m-2
s-1
，温度设置为45℃的高温处理或25℃的常温处理，期间及时补充水分，防止幼苗干旱。两天后发现高温条件下野生型对照植株wt比pskr1基因过表达植株oe:pskr1-1和oe:pskr1-2萎蔫更加严重，选取其中代表性植株进行拍照，同时测定番茄植株psii最大光化学效率(fv/fm)和相对电导率。
40.其中，植物psii最大光化学效率(fv/fm)测定方法为：将不同温度处理后的番茄植株置于暗环境适应30min后，利用德国heinz-walz公司生产的imaging-pam调制荧光成像系统照射检测光(《0.5μmol m-2
s-1
)获得最小荧光fo，再照射饱和脉冲光(4000μmol m-2
s-1
)获得最大荧光fm。荧光参数计算方法为：fv/fm＝(fm-fo)/fm。
41.相对电导率测定：称取0.3g番茄叶片并用dh2o将叶片洗净，去主叶脉后剪成1cm2的碎块置50ml离心管中，加入20ml dh2o。室温200rpm震荡2h后测得电导率el1。样品95℃水浴15min，冷却至室温测定电导率为el2。相对电导率el(％)＝el1/el2
×
100。
42.结果显示，pskr1基因过表达能显著提高番茄对高温逆境的抗性(图2中的a)。在番茄植株遭遇高温胁迫后，pskr1基因过表达植株oe:pskr1-1的psii最大光化学效率显著高于相同条件对照处理的wt番茄植株(图2中的b)，同时能够有效降低高温介导相对电导率的提高(图2中的c)。
43.实施例3
44.植物多肽psk外源处理对植株高温逆境抗性的影响
45.将0.85g psk缓慢加入100ml的水，搅拌直至充分溶解得到混合溶液；往100ml混合溶液中先后加入9.9l水和2.5ml有机硅混合均匀成稀释液(制剂工作液)后使用。
46.将制剂工作液均匀喷施苗龄为五叶一心的番茄叶片表面，直至两面叶片完全湿润，且制剂工作液不呈水滴状流下，每天晚6点喷施1次持续喷施3天，以喷施清水的番茄植株作为对照。
47.对psk外源喷施及对照处理后的番茄植株进行不同温度处理。番茄植株置于人工气候培养箱中，光强为200μmol m-2
s-1
，温度设置为45℃的高温处理或25℃的常温处理。期间及时补充水分，防止植株干旱缺水。不同温度处理10小时后，将高温处理组与常温处理组番茄植株进行比较，拍摄植物温度响应表型图，同时测定番茄植株psii最大光化学效率(fv/fm)和相对电导率。
48.结果显示，植物多肽psk外源处理能显著提高番茄对高温逆境的抗性(图3中的a)。psk外源处理的番茄植株遭遇高温胁迫后，其psii最大光化学效率(fv/fm)显著高于对照处理的番茄植株(图3中的b)；同时外源处理psk能有效降低高温介导相对电导率的提高(图3中的c)。
49.实施例4
50.pskr1基因过表达植株花粉的高温逆境抗性研究
51.番茄开花大约10d为小孢子母细胞减数分裂期，这个阶段被认为是对高温胁迫最敏感的发育时期。将出现花序的野生型和pskr1基因过表达植株在39℃高温下胁迫处理3h后重新置于正常培养条件下生长，到开花时进行花粉活力和花粉萌发的测定。
52.花粉活力检测方法：采用荧光素二醋酸酯溶液(fluorescein diacetate，fda)染色法检测番茄花粉活力。以2mg ml-1
的fda丙酮溶液为母液并于4℃避光保存，以0.5m蔗糖溶液稀释100倍后的溶液作为工作液。取番茄早上刚开的花，将花药中的花粉均匀散落在滴有fda工作液的载玻片上，28℃避光保湿染色1h后，盖上盖玻片，在荧光显微镜(leica)下观察并拍照统计。
53.花粉体外萌发率检测方法：花粉体外萌发采用苯胺蓝(sigma-aldrich溶液对生长的花粉管进行染色，以0.1％的苯胺蓝溶液为工作液。取番茄早上刚开的花，将花药中的花粉均匀散落在滴有花粉体外萌发半固体培养基的载玻片上，28℃避光保湿培养1h后，滴加20μl 0.1％的苯胺蓝溶液染色5min，盖上盖玻片，在荧光显微镜(leica)下观察并拍照统计。
54.结果如图4中的a-d所示，高温条件pskr1基因过表达植株oe:pskr1-1的花粉活力和花粉萌发率均高于野生型wt。
55.实施例5
56.以对照番茄cdna为模板，分别扩增pskr1基因的蛋白编码区胞内片段(seq id no.6)并重组至pgbkt7载体，hsfa1a片段并重组至pgadt7载体。将上述pgbkt7和pgadt7共同转化到酵母ah109菌株。
57.具体操作步骤如下：挑取在ypad培养基上的ah109单菌落至3ml ypda中，250rpm，30min振荡培养8h，取约200μl菌液转移到含20ml ypda的50ml离心管中，同样条件下培养过
夜。当od600数值到达0.6-0.8之间时，4000rpm，5min离心，弃上清。用te/liac重悬，4000rpm，5min离心，弃上清。再用te/liac重悬，制得酵母感受态。将上述重组的pgbkt7和pgadt7，鲑鱼精子dna，peg/liac与酵母感受态混合，30℃静置30min，加入60μl二甲亚砜。42℃水浴15min，冰上放置5min后离心去上清，加入100μl无菌ddh2o，涂抹于营养缺陷型固体培养基sd-trp-leu，30℃培养3-4天。挑取成功转入两个重组质粒的单克隆酵母用sd-trp-leu液体培养基培养，至od600数值到达0.6-0.8之间，用4000rpm，5min离心,弃上清。用无菌ddh2o重悬至od600数值到达0.3，并分别稀释10倍，100倍。吸取10μl菌液，分别滴至sd-trp-leu和sd-trp-leu-his-ade固体培养基30℃培养3-4天观察结果。
58.如图5所示，酵母菌落在sd-trp-leu和sd-trp-leu-his-ade固体培养基均生长良好，说明pskr1基因能够与热激转录因子hsfa1a互作。
59.以上所述实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。