一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法

1.本发明属于生物技术领域，尤其是指一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法。


背景技术：

2.类器官(organoid)是一种3d的细胞培养物，在结构及功能上高度模拟人体器官，能够形成类似器官结构并分化出对应功能的细胞功能集合，其具备细胞增殖分化、自我更新、自组装、可长期培养、遗传稳定等特点，在发育生物学、疾病病理学、细胞生物学、再生医学、精准医疗、药物毒性和药效试验，以及药物筛选等方向应用潜力巨大。目前，癌症相关疾病是全球主要的健康问题之一，每年导致约800万人死亡，预计未来这一数字将迅速增加。随着精准医学理念的提出及发展，癌症患者主要的诊断和治疗方法正逐渐从传统标准转向个性化技术。临床肿瘤患者来源的肿瘤类器官构建为肿瘤药物的个性化选择提供可能。
3.目前，针对临床肿瘤患者的用药筛选普遍使用2d细胞或pdx(人源性动物移植模型)开展。针对2d细胞，其体外扩增具有一定局限性，在传代后容易丧失原肿瘤的遗传异质性，容易发生优势克隆选择，且与临床个性相关性较低；而pdx模型虽然解决了个性化的关键问题，但移植成功率低、构建成本高、周期长等缺陷限制了其在临床上的大规模使用。因此，临床上可推广的药筛模型需满足周期短、药物通量高、预测效果准确的要求。相对于现有方法，类器官显现出强劲优势。
4.然而为了保证药物筛选的准确性，类器官在构建过程中标准需高度统一，对形成类器官的尺寸、细胞来源、细胞种类等进行规范。现今，传统培养条件下的肿瘤类器官需要在matrigel中嵌入生长，物理参数和生长因子可及性的局部差异可能带来类器官在形状、大小和分布等方面的差异，且该培养方式对形成类器官的细胞类型、数量无法做到均一、标准，且现有芯片的制备方式不能满足肿瘤类器官挑取需要，无法保证药物筛选的准确开展。
5.基于此，急需建立一种基于细胞芯片的肿瘤类器官培养方法，在芯片的材质，处理方式、肿瘤类器官的细胞来源、配比、尺寸、用药方式等指标上进行标准化，且自动化的挑取设备对后续类器官的药敏实验等加以规范，为临床肿瘤病人的个性化用药提供指南。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供了一种肿瘤干细胞筛选和基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官构建方法。本发明的肿瘤类器官构建思路：(1)病人来源的肿瘤干细胞获取，基于细胞芯片，肿瘤组织来源的肿瘤干细胞由于自我更新较强，可在3天左右自我增殖形成肿瘤球，经过干性功能表征与干性分子标志物的鉴定，可确定此类肿瘤球为肿瘤干细胞球，以此类细胞为核心培养形成的肿瘤类器官可满足细胞来源均一性；(2)尺寸与细胞类型均一的类器官培养，在3cm
×
3cm的细胞芯片上，可形成约62500个大小均一的80μm的肿瘤类器官，经自动化挑取设备挑取后，进行药敏试验的开展，足量大小与质量均一的类器官为药物筛
选的准确性提供可能。
7.本发明的第一个目的在于提供一种基于肿瘤干细胞的肿瘤类器官的构建方法，包括以下步骤：
8.(1)取肿瘤样本置于缓冲液中清洗，加入组织裂解液进行酶解匀浆得到匀浆组织液；
9.(2)将步骤(1)中酶解所得匀浆组织液过滤得到组织来源的肿瘤单细胞，对所得肿瘤单细胞进行重悬，并将所得肿瘤单细胞重悬液铺于细胞芯片上，待细胞沉降进入所述细胞芯片的微孔中，加入培养基，培养1-7天，得到细胞球；
10.(3)将步骤(2)所得细胞球进行扩增，并铺在改性细胞芯片中，培养2-3天，得到所述肿瘤类器官。
11.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述缓冲液选自pbs缓冲液。
12.在本发明的一个实施例中，步骤(1)中，所述组织裂解液包括1500u/ml的胶原酶(collagenase)，1000u/ml的透明质酸酶(hyaluronidase)与dnase等。
13.在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述细胞芯片的微孔直径30μm-1mm；微孔间距5μm-500μm；所述芯片的微孔形状为圆柱、圆锥、长方体或正方体。
14.在本发明的一个实施例中，步骤(2)中，所述培养基选自添加生长因子的dmem/f12基础培养基；所述生长因子选自胰岛素(insulin)、氢化可的松(hydrocortisone)、jagged-1、sb431542、bfgf和egf中的一种或多种。
15.在本发明的一个实施例中，所述胰岛素(insulin)含量为2.5-10μg/ml，氢化可的松(hydrocortisone)浓度为0.2-0.8μg/ml，jagged-1的浓度为0.5-2μm，sb431542的浓度为0.5-3μm，egf的浓度为10-35ng/ml，bfgf的浓度为5-20ng/ml。
16.在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述改性细胞芯片的功能性改性选自氨基改性、羧基改性、等离子处理、多巴胺改性或胶原改性。
17.在本发明的一个实施例中，所述氨基改性的条件为：采用乳液聚合法制备有机硅的高聚物乳液，并通过添加氨基硅烷偶联剂制得氨基硅氧烷乳液，在催化剂及交联剂的作用下进一步交联成含氨基集团的硅橡胶，在pei基膜上通过高温固化即可形成氨基改性的pdms/pei膜。
18.在本发明的一个实施例中，所述多巴胺改性的条件为：使用ph 8.5的10mm的tris buffer配置成2mg/ml的多巴胺pda溶液，将芯片浸泡在pda溶液中，避光室温过夜孵育，第二天清洗，得到用于培养的芯片。
19.在本发明的一个实施例中，所述胶原改性的条件为：hff细胞中转入cbd(胶原结合域)—生长因子融合蛋白表达-质粒，制备富含特定生长因子的ecm，用于类器官的培养。
20.在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，细胞球扩增后铺在改性细胞芯片的具体操作：将细胞球平铺在改性细胞芯片后再加入一层基质；所述基质为水凝胶材质，所述水凝胶的原料选自pegda、海藻酸钠、壳聚糖、琼脂糖、明胶或甲基丙烯酸明胶中的一种或多种。
21.在本发明的一个实施例中，所述基质还可以包括胶原、细胞外基质或特定生长因子。
22.在本发明的一个实施例中，所述特定生长因子选自egf、bfgf、jagged-1。
23.在本发明的一个实施例中，所述基质的厚度为3-5μm。
24.在本发明的一个实施例中，胶原或细胞外基质占基质中的质量比为20-60％。
25.在本发明的一个实施例中，步骤(3)中，所述改性细胞芯片的尺寸为80-100μm。
26.在本发明的一个实施例中，所述ecm为富含egf与bfgf的ecm。
27.本发明的第二个目的在于提供一种肿瘤类器官由以上构建方法所得。
28.本发明的上述技术方案相比现有技术具有以下优点：
29.(1)使用改性的特殊材质的细胞芯片和3d培养基，为2d阵列的细胞为细胞提供了弱粘附2d界面，既防止了细胞的2d铺展和细胞聚集，又为每一个细胞提供了3d增殖的微环境。具有较强的自我更新能力的肿瘤干细胞在芯片上增殖形成细胞球而突出出来，从而实现了对肿瘤组织中的肿瘤干细胞的高通量筛选。与现有的csc(肿瘤干细胞，cancer stem cell)筛选技术相比，该技术不受已知csc标志物的局限，仅从关键的在自我更新能力特征筛选csc，筛选更精准，并具有高通量、快速和均一的优势。
30.(2)与现有的具有未知异质性的pdo(类器官，patient derived organoid)相比，纯化的csc来源的pdo(csc-pdo)保证了肿瘤pdo的高质量，以及质量的标准化和一致性，使对csc进行重复性药筛更具有了可行性。对纯化的csc-pdo的药筛，可指导临床实现“擒贼先擒王”的肿瘤治疗理念，具有更大的现实意义。
31.(3)在不同规格的细胞芯片上可高通量制备尺寸可控和均一的csc-pdo。与现有的pdo技术相比，该技术可使pdo制备实现标准化，使可重复的药物筛选成为可能，为大规模、标准化、自动化、产业化pdo精准药筛奠定基础。
32.(4)现有的肿瘤pdo构建往往基于对肿瘤复杂微环境的模糊认知，更多的是从形式上对异质性进行保留或模拟。csc是肿瘤发生、转移和耐药的核心关键细胞，是肿瘤临床“擒贼先擒王”治疗理念的核心靶细胞，是更复杂的肿瘤微环境模拟系统构建的基础，该技术将为更高级复杂类器官的构建和理论研究提供关键核心细胞资源。
附图说明
33.为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
34.图1是本发明未经放大的细胞芯片概念图。
35.图2是本发明细胞芯片的局部放大示意图；其中a、b、c分别代表芯片阵点直径、阵点间距与阵点高度。
36.图3是本发明芯片上肿瘤干细胞的筛选与肿瘤干细胞来源的pdo的制备示意图。
37.图4是本发明实施例1的癌旁组织与乳腺癌组织单细胞在芯片上的成球情况。
38.图5是本发明实施例1的芯片上所形成肿瘤球的epcam(红色)与cd45(绿色)染色。
39.图6是本发明测试例1的成球细胞与未成球细胞的肿瘤干性标志物表达差异检测。
40.图7是本发明测试例2的成球细胞与未成球细胞在matrigel中克隆形成能力检测。
41.图8是本发明测试例3的单细胞球挑取后的连续培养。
42.图9是本发明测试例4的来源与尺寸均一的csc-pdo的3d培养。
43.图10是本发明测试例cscs-pdo对her2靶向药trastuzumab的敏感性试验。其中，(a)qrt-pcr比较211009-liu、211110-huang、211027-chen三个样本间her2的表达水平差异；(b)cck8试验对三例样本中获取的cscs-pdo进行her2靶向药trastuzumab的敏感性比
较。
具体实施方式
44.下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
45.本发明的肿瘤类器官构建思路：(1)病人来源的肿瘤干细胞获取，基于细胞芯片，肿瘤组织来源的肿瘤干细胞由于自我更新能力较强，可在3天左右自我更新形成肿瘤球，经过干性功能表征与干性分子标志物的鉴定，可确定此类肿瘤球为肿瘤干细胞球，以此类细胞为核心培养形成的肿瘤类器官可满足细胞来源均一性；(2)尺寸与细胞类型均一的类器官培养，在3cm
×
3cm的细胞芯片上，可形成约62500个大小均一的80μm的肿瘤类器官，经自动化挑取设备挑取后，进行药敏试验的开展，足量大小与质量均一的类器官为药物筛选的准确性提供可能。
46.实施例1
47.一种肿瘤类器官构建方法，具体步骤为：
48.(1)临床乳腺癌样本的获取：苏州大学附属第一医院甲乳外科获取乳腺癌样本与癌旁样本，样本为2mm
×
2cm穿刺样本(2-3条)。立即置于预冷的pbs中，冰盒储存。
49.(2)穿刺样本的处理：样本置于pbs中清洗2-3次，加入组织裂解液，匀浆器下匀浆组织，37℃摇床上酶解组织1.5h左右。
50.(3)使用40μm过滤器过滤步骤(2)中所得酶解样品，获得组织来源的单细胞。
51.(4)将步骤(4)所得单细胞进行离心，并利用dmem/f12基础培养基重悬细胞得到细胞密度约为1
×
108/ml的细胞悬液，将重悬的细胞悬液铺于步骤(4)中所得细胞芯片上，细胞自然沉降进入芯片微孔，加入5μg/ml的insulin，0.4μg/ml的hydrocortisone，20ng/ml的egf，1μm的jagged-1，2μm的sb431542的dmem/f12基础培养基，培养72h(具体见图4)。
52.(5)epcam荧光抗体的鉴定：培养72h后，步骤(4)的细胞芯片中细胞孔内自我更新能力强的细胞增殖形成肿瘤细胞球，为了鉴定肿瘤细胞球的形成，加入epcam荧光抗体(抗体：培养基＝1:1000)，观察肿瘤球细胞epcam的表达量(具体见图5)。
53.(6)细胞挑取仪精准挑取epcam阳性细胞球，对细胞球的生物学特性加以表征，鉴定其肿瘤干细胞特征。
54.(7)对挑取的细胞球进行扩增，获得大量来源均一的细胞球。
55.(8)细胞芯片多巴胺改性处理，处理方法为，ph 8.5的10mm的tris buffer配置成2mg/ml的多巴胺pda溶液，将芯片浸泡在pda溶液中，避光室温过夜孵育，第二天清洗，得到用于培养的芯片，备用。(芯片见图2所示)
56.(9)将扩增培养后的细胞重新铺在步骤(8)中改性细胞芯片中，芯片上覆盖一层5μm厚度的富含egf的ecm生物材料，根据对肿瘤类器官尺寸的不同要求，选择80μm孔径的细胞芯片，3d培养3天后，来源均一的肿瘤干细胞可形成均一尺寸的肿瘤类器官。
57.由图4可知，乳腺癌组织样本与癌旁组织样本单细胞处理后，置于芯片中培养3天后，乳腺癌细胞芯片上能明显形成更多的肿瘤球，乳腺癌组织中细胞球成球数目多，且较为紧实，而癌旁组织中成球数目远少于癌组织，该结果表明肿瘤组织中自我增殖能力强的细胞多于癌旁组织。
58.由图5可知，改性细胞芯片上按照1:1000的浓度加入红色荧光的epcam抗体(标记肿瘤细胞)与绿色荧光的cd45抗体(标记淋巴细胞)。结果表明，改性细胞芯片上肿瘤球上epcam表达量明显高于未成球细胞，且淋巴细胞在芯片细胞上占比较少(图5)，本实验可排除淋巴细胞对肿瘤细胞增殖成球的干扰。
59.其中，此处步骤(8)所得芯片的参数为：
60.长宽：3cm
×
3cm
61.改性方式：多巴胺改性
62.微孔直径a：50μm
63.两孔边距b：50μm
64.微孔深度c：50μm
65.单个芯片微孔数目：250
×
250＝62500。
66.测试例
67.1，肿瘤干细胞特性检测。为了确定实施例1中所述细胞芯片上形成的肿瘤球在肿瘤干性指标上的表现，用单细胞挑取设备精准挑取单个细胞球进行基因表达检测，具体操作步骤如下所述：
68.(1)分别挑取实施例1中改性细胞芯片中同一孔内的成球细胞与未成球细胞；
69.(2)进行单细胞来源或少量细胞来源的cdna逆转录；
70.(3)qpcr比较乳腺癌肿瘤干细胞标志物(如cd24、cd44、aldh1等)的转录水平表达量。结果见图6。
71.由图6可知，成球细胞与未成球细胞的干性标志物表达存在差异，结果表明，成球细胞的干性指标显著高于未成球细胞，初步确定肿瘤细胞球中的细胞为肿瘤干细胞。
72.2，肿瘤球自我繁殖能力检测。为了验证实施例1中所得成球细胞和未成球细胞的自我繁殖能力，挑取同一孔内数目相近的成球细胞与未成球细胞于matrigel中培养，具体操作步骤如下所述：
73.(1)挑取同一孔内等量的成球细胞与未成球细胞；
74.(2)将细胞接种于materigel中进行培养10天；
75.(3)显微镜下观察细胞在materigel中的增殖情况。实验结果见图7。
76.由图7结果可知，成球细胞的克隆形成数目约为未成球细胞的2.12倍，证明成球细胞的自我增殖能力强于未成球细胞，肿瘤干性更强。
77.3，肿瘤球细胞扩增。在滋养层细胞的培养条件下，挑取的单个肿瘤细胞球可完成体外增殖，具体操作步骤如下所述：
78.(1)按照每孔100μl的总体积将matrigel浸润六孔板，吸走多余的胶后，37℃培养箱预热凝固胶20分钟。
79.(2)复苏分装冻存的滋养层细胞，37℃水浴锅中摇动加热细胞直至融化无冰块，先将滋养层细胞转移至离心管中，后用特定滋养层细胞培养基(dmem/f12基础培养基，添加r-spondin1 100-150ng/ml，jagged 10.5-2μm，noggin 50-150ng/ml，rock-inhibitor 1-3μm)重悬细胞。
80.(3)轻轻吹打混匀后，每孔3ml的体积将细胞移至六孔板中。
81.(4)48小时内使用滋养层细胞接种要培养的细胞。
82.(5)由于滋养层细胞前期经过丝裂霉素的处理，其无法增殖，故扩增所得细胞均为接种细胞来源的细胞，可实现单细胞球来源的细胞扩增。所得细胞结果见图8。
83.从图8中可知，细胞球挑取后，于滋养层细胞上3天(d3)，5天(d5)，7天(d7)的连续培养。收集增殖的细胞球，酶解后可继续增殖培养，已获得大量的均一的csc。
84.4，csc-pdo的构建。具体操作步骤如下所述：
85.(1)本课题组前期应用基因工程改造的成纤维细胞生产富含特定生长因子的可溶性细胞外基质(extracellular matrix,ecm)，与胶原水凝胶或甲基纤维素水凝胶混合，在细胞芯片的每个阵点创造乳腺癌细胞弱粘附的3d培养微环境以用于pdo的3d培养。
86.(2)将乳腺癌干细胞经滋养层细胞扩增后，置于80-100μm阵点直径的细胞芯片上，保证每一pdo芯片阵点内细胞数目一致。芯片阵点的直径尺寸可控且均一，决定了制备的cscs-pdo的尺寸可控和大小均一。
87.(3)将稀释后的ecm置于芯片上，1-2天后，即可完成cscs来源一致、尺寸均一的高通量pdo构建。
88.肿瘤干细胞来源的肿瘤类器官(csc-pdo)高通量均一制备。将酶解后的单一csc与一定浓度的matrigel或胶原水凝胶或ecm水凝胶等混合，重新接种于不同规格的细胞芯片上，3d培养3天后，芯片上可高通量形成尺寸均一的csc-pdo(图9)。
89.5利用cscs-pdo进行药物筛选。利用实施例1的方法得到大量不同乳腺癌患者来源的cscs-pdo后，进行临床常用的药物筛选测试。为验证本发明中所得cscs-pdo在临床用药试验中的准确性，分别选取her2低表达、中表达、高表达的编号为211009-liu、211110-huang、211027-chen的pdo进行her2靶向药物trastuzumab的药敏试验测定。经检测，结果见图10，由图可知在药物处理48h后，her2表达高低与其靶向药物trastuzumab的ic
50
呈现相关性，且同一组内样本间的差异性不显著(图10)，该药敏试验初步证明本项目中构建的cscs-pdo在药物筛选中能够反映临床样本本身特性，且准确性较高，与此同时，芯片上构建的pdo数量充足，可保证至少50种药物或肿瘤治疗手段在体外的同时试验。未来，将用更多病患、不同乳腺癌亚型的肿瘤样本制备cscs-pdo，用于更多的临床药物测试，以建立稳定的基于cscs-pdo的标准化药物筛选方法。
90.显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。